作为骨膜素羊膜生物标记物

抽象

寻找羊膜和羊膜干细胞的精确起源仍然是一个挑战，主要依赖于分析强大的遗传模型，如小鼠羊膜。在对非灵长类动物的羊膜进行取样以分离候选的羊膜干细胞时，深刻理解盘形灵长类动物和人类胚胎以及杯形小鼠胚胎中羊膜发育的根本差异是至关重要的。特异表达于羊膜而不表达于其他胚外膜的分子标记基因的可用性将有助于明确验证正在调查的起始材料。到目前为止，这种羊膜标记物尚未被报道。我们假设骨形态发生蛋白(BMP)的靶基因是假定的羊膜标记物，主要是因为在小鼠中BMP信号级联的几个成分之一的缺失已被证明导致了早期羊膜的发育缺陷。比较已知的BMP靶基因在不同胚外组织中的表达分析，结合原位杂交，鉴定Periostin (Postn)妊娠期间羊膜mRNA富集。此外，我们鉴定并提出了一种标记组合，作为小鼠不同胚胎外组织的转录签名。

1.简介

羊膜是围绕羊膜的胎儿和描绘充满流体的羊膜腔，从而提供孕内密闭环境并赋予保护和耐冲击性的最内胚外膜。在大多数脊椎动物中，羊膜是薄且无血管的透明膜。近年来，人类长期羊膜已吸引了相当多的关注，因为羊水，ectoderm-和中胚层衍生的细胞可以分化成从细胞培养三个胚层细胞。此外，居民干细胞样已经报道了羊水细胞外胚层（综述[1，2]， 这个问题）。此外，羊膜的免疫原性低，使得对（再生）医学极大的兴趣，这“医疗废物”组织。事实上，羊膜已经使用了一个多世纪的伤口敷料。

最近，研究旨在探索羊膜干细胞的存在和起源已经完成，使用更强大的遗传模式生物，如小鼠和大鼠。尽管羊膜发展的圆盘形的灵长类动物胚胎和杯形小鼠胚胎（的根本差异进行审查：2]），羊膜膜和羊膜液衍生的细胞与干细胞样特征已经从小鼠和大鼠[分离3，4]。

在人类，无论是羊膜和绒毛膜环绕胚胎和两种膜妊娠孕中期融合，而卵黄囊相当粗浅[2]。与此相反，在小鼠中，在胚胎日原胃形成后不久，羊膜囊褶皱物理分离后，绒毛膜永远不会与羊膜融合(E)7.0 [6]。绒毛膜并入胎盘的绒毛膜盘，同时羊膜被内脏卵黄囊包围，除了部分绒毛膜盘。重要的是，一方面是羊膜，另一方面是卵黄囊和绒毛膜盘，它们与充满液体的外体腔保持距离(图)1（一个）-1(c))。在小鼠胚胎中，羊膜在整个妊娠过程中由鳞状中胚层和外胚层组成的单层双膜组成，分别面对体腔和羊膜腔。

收集来自非灵长类物种羊膜以分离所谓羊膜干细胞[当周围的人和小鼠羊膜组织根本不同的认识是重要2]。分子标记的可用性是专门存在于羊膜，而不是在其他胚胎外膜，或在各自的液体，将有助于明确的特征，干细胞分离的最初材料。

空间的基因表达研究很少包括在羊膜表达信息，这部分是因为该组织似乎容易被忽视或丢弃，而且还因为它通常很难从背景染色低表达水平区分由于该拉伸的膜的平坦蜂窝结构。据我们所知，具体的羊膜 - 基因没有明确的报道，但羊膜的生理功能可能对假定的候选人羊膜标记暗示。羊膜是一个非常有弹性的组织抵抗增加舒展。因此，逐渐地，一个基底层由胶原蛋白，层粘连蛋白，巢蛋白的，和纤连蛋白的羊膜外胚层和中胚层[之间的纤维形式7，8]。羊膜上皮表面微绒毛增多，可能与膜的过滤和转运能力增强有关。羊膜发育受损的小鼠模型也可能提示候选羊膜标记物。很少有显示羊膜形成缺陷的小鼠突变体被描述(在[6)，与许多尿囊有缺陷的突变体形成对比[9]或胎盘[10]。许多突变体的主要与羊膜发展显示缺陷似乎点受损骨形态发生蛋白（BMP）信令（BMP2，Smad5的）或在编码BMP信号的推定调节基因（被发现安姆，BMP1)。Amnionless（飞行员由于缺乏羊膜，突变体发育出最特殊的缺陷，而绒毛膜、卵黄囊、血岛和尿囊发育正常[11]。BMP2空胚胎不能关闭羊膜[12]。缺陷的小鼠中SMAD5作为BMP信号的细胞内介质，除了含有异位干细胞样细胞、造血细胞和内皮细胞的局部羊膜增厚外，也显示羊膜延迟闭合[13-15]。一些配体可引起BMP羊膜信号。BMP4在小鼠羊膜中大量表达，但BMP2和BMP7在羊膜和邻近组织中也有转录的报道[16-18]。

对于BMP羊膜发展的信号中的关键作用，使我们推测为BMP靶基因是羊膜的候选标记。鉴于发展中国家羊膜这样的靶基因及其邻近组织的表达差劲的文档，我们已经完成的不同胚外组织几次这样的靶基因的比较基因表达分析。成绩单骨膜（POSTN）似乎是高度在小鼠和人类羊膜在不同的发展阶段充实。骨膜素是分泌的ECM蛋白可与不同ECM蛋白和整联蛋白相互作用以及由转化生长因子β诱导的（TGF）β和接受重塑或主动应激的组织中的BMPs(在[19]）。原位杂交分析证实了羊膜富集的定位PeriostinmRNA的羊膜。我们建议使用的组合Periostin和AP-2作为生物标志物开发的鼠标羊膜。

2.材料和方法

2.1。小鼠和人类胚胎外组织的收集

在冰冷的PBS中分离E8.5 ~ E18.5的野生型小鼠胚胎(CD1)，收集羊膜、尿囊和内脏卵黄囊组织。材料在冰冷的PBS中洗涤，立即冷冻并储存在−80℃，直到进一步处理。LacZ胚胎是转基因的基因组成的bmp -响应元件(BRE)ID1启动子驱动β报道BMP-SMAD活性的-半乳糖苷酶合成[五]。将这些胚胎在E7.0和E8.0冻PBS中分离，并进一步处理β半乳糖苷酶染色。CD1胚胎在E8.5 E9.5和在冰冷的PBS收集，固定在PBS中的4％多聚甲醛，并进一步对加工原位杂交（ISH）。

在冷冻PBS中分离出妊娠期1 - 3月和妊娠期2 - 3月的人胚胎外组织，立即冷冻在RLT缓冲液(Qiagen)中，直到进一步处理(LUMC)。这些组织来自自愿流产，没有医学、胎儿或产科并发症。乌兹·鲁汶产科计划剖宫产后收集了足月羊膜。鲁汶大学伦理委员会(KU Leuven)和莱顿大学医学中心医学伦理委员会(P08.087)分别批准了小鼠和人体组织的采集。

2.2。β半乳糖苷酶的活动和原位杂交

一个fter brief glutaraldehyde/formaldehyde fixation, BRE : LacZ hete-rozygous embryos were washed in PBS and stained forβ-半乳糖苷酶30℃在5-溴-4-氯-3-吲哚- - d -半乳糖吡喃苷(X-gal, Fermentas, R0941)染色溶液中过夜，如前所述[五]。染色后的胚胎在6点清洗、脱水、石蜡包埋和切片μm。切片用Mayer氏苏木。

为原位杂交，将胚胎过夜在PBS中的4％多聚甲醛在4℃下固定，用PBS洗涤和盐水，脱水并包埋于石蜡中，并在6切片 μm。原位用digi标记的反义核探针的切片上的杂交Tbx2[20]，Tbx5中[21], Msx1[22]，MSX2[23),而POSTN[24]用自动平台（Ventana公司发现，Ventana公司医疗系统）进行的。

2.3。基因表达分析

提取RNA并用RNeasy试剂纯化柱（Qiagen，的RNeasy Mini或微型试剂盒，74104和74004）纯化。使用Superscript III逆转录酶（Life Technologies）中，寡聚dT和随机引物（Life Technologies公司）进行逆转录。定量PCR使用的LightCycler 480的SYBR Green I主混合物（Roche，4707516001）上的LightCycler 480实时PCR系统进行，所有的反应都在技术重复实时。引物设计与IDT的在线工具（http://www.idtdna.com/)。Gapdh和UBC(老鼠)和GAPDH和β肌动蛋白（人）作为参考基因进行归一化。鼠标的引物序列（正向引物第一）法新社:GATGAAACCTATGCCCCTCC CAAAAGGCCCGAGAAATCTG;AP-2：CGTTACCCTCCTCACGTCACTAG，TTTCGCACACGTACCCAAAGT;Hand1:CGAAAGCAAGCGGAAAAGGGAGTT TTTAGCTCCAGCGCCCAGACTT;HAND2：AGGCCTTCAAGGCGGAGATCAA CCTGTCCGGCCTTTGGTTTTCTTG;Msx1:CACCCTACGCAAGCACAAGA，GCAGCTGAGCTGTGGTGAAA;Msx2:GCTGCCCTCAGGCTTCAGT TGCGCCGTATATGGATGCT;骨膜：AAGGAAAAGGGTCATACACGTACTTC，CCTCTGCGAATGTCAGAATCC;Tbx2：ATCGACAACAACCCCTTTGC GAGAGTGGGCAGCGTTAGCT;TBX4：TCAACACCTTCCCAACTCAG GGGAGAACGGAAATAGTGATCG;TBX5：CATCAGTATCACTCGGTACACG GTTACAACGGGCGATCTAGAG;ζ珠蛋白：GCTTCAAGATCATGACCGCCGT，CGGTGGAGGCTTAGCGGTACTT;GAPDH：AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC，GCCTCTCTTGCTCAGTGTCC;UBC：TAAAAAGAGCCCTCCTTGTGCT，AGACACCTCCCCATCACAC。人引物序列骨膜：GAAAGGGAGTAAGCAAGGGAG ATAATGTCCAGTCTCCAGGTTG;GAPDH:TGCACCACCAACTGCTTAGC，GGCATGGACTGTGGTCATGAG;β肌动蛋白：CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG，ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC。骨膜素引物被设计以扩增所有已知的小鼠3和4人的转录物，分别。与qBASEplus软件（Biogazelle）进行数据分析。定量使用“qBASE方法”的基础上，ΔΔCT方法进行。两个技术重复用于每个样品和目标;标准偏差是从重复的Ct值来计算，并通过误差棒表示。相对RNA水平通过设置与最低表达的样品（每个目标）为1的不同的目标表达式不能直接进行比较获得。E8.5的至少五个个体样品和E9.5胚胎和E13.5的至少两个单独的样品和E18.5胚胎小鼠的qPCR实验中使用。对于人，每一个的一个或两个单独样品中提及的第一和第二个三个月胎龄进行了分析和38周（术语）羊膜5倍单独的样品。

3.结果

后立即形成羊膜鼠标羊膜分离并从孕的胚胎区域标定胚外区域。在这个阶段羊膜不围绕发育中的胚胎还没有（图1(a))。在早期阶段器官胚胎发生的轴向旋转，因此它被通过它的羊膜和卵黄囊（图包裹1（二） -1(c))。鼠标羊膜是由羊膜外胚层的连续性与胚胎外胚层和中胚层羊膜与描绘的卵黄囊和在羊膜的最后部的尿囊/脐带（图间皮共享其边界1(a))。

为了研究BMP是否能在羊膜封闭前后诱导smad介导的BMP信号通路，我们监测了BRE: LacZ报告胚胎羊膜中BMP- smad的激活。这些小鼠胚胎报告活化的BMP-SMADS靶基因表达被激活[五] （数据1（d） -1（H））。羊膜闭合之前，活性BMP-Smad信号是最主要的amniochorionic折叠的羊膜外胚层部件（图1（d））。闭合高BMP-Smad信号后水平持续在羊膜的两个层，并且所述信令域开始于前胚胎外胚层和中胚层和最后的胚胎中胚层和羊膜的胚外中胚层扩大到胚外胚交界区域，更具体地，尿囊，和卵黄囊（图1（E） -1（H））。

从E8.5、E9.5、E13.5和E18.5小鼠胚胎中显微解剖羊膜和内脏卵黄囊(现在称为卵黄囊)，涵盖早期器官发生、器官发生和早产阶段。此外，从E8.5和E9.5胚胎中分离出尿囊。E8.5和E9.5样本收集了至少5个胚胎的组织，同时分别处理较早妊娠期的组织，然后分离mRNA和合成cDNA。为了评估这些样本的质量，通过定量逆转录- pcr (RT-qPCR)来评估不同胚胎外组织中富集的转录本的存在。TBX4被用作尿囊特异性标志物[25]，和法新社和ζ球蛋白分别是内脏内胚层和原始造血细胞的标记物，后者在内脏卵黄囊的中胚层发育[26，27]。一个适当的羊膜特异性标记在这个阶段是缺乏的AP-2（Tfap2A）中的溶液包括在分析中，因为我们以前报道，该标记物用于非神经外胚层表面和神经嵴细胞[28在羊膜外胚层中也大量表达[13]。这一分析表明，显微切割羊膜的样品不沾染尿囊（图2(一个)）或卵黄囊（图2 (b)） 组织。

采用RT-qPCR法对同一羊膜、内脏卵黄囊和尿囊标本进行分析，筛选出7个BMP靶点(Tbx2，Tbx5中，HAND1，HAND2，MSX1，MSX2和POSTN作为鉴定(a)假定羊膜标记物的首选选择标准。

在T-box转录因子编码基因的转录水平Tbx2相比于羊膜时在尿囊和卵黄囊高（图2 (c))。在E8.5时尿囊的表达最为明显，并与之前by报道的表达域相关原位杂交[29]。尿囊中不同程度的富集变得TBX4mRNA表达-从E9.5开始逐渐减少。的表达式域TBX5已记录了原位E7.5胚胎尿囊杂交[三十]。该TBX5纹不会导致表达在不同胚外组织稳定，坚固的图案（图2 (c))。因此，两者我们都不考虑TBX5也不Tbx2作为候选标记为羊膜。

Hand1和Hand2编码对心脏和胚胎外发育至关重要的基本螺旋-环-螺旋转录因子[31]，与Hand1似乎作为有利的候选标记羊膜(图2 (d))。然而，除了强表达在羊膜[32高表达Hand1已被证明在一个卵黄囊Hand1: LACZ-reporter小鼠品系[31]。此外，HAND1缺陷的胚胎显示缺陷在卵黄囊脉管系统，这表明HAND1为卵黄囊发展重要[33]。

Msx1和MSX2Msh同源质盒转录因子参与神经管、心脏、牙齿、肢体和颅面发育，据报道是BMP信号传导的直接效应因子(在[34，35]）。Msx1表达已被报道用于小鸡羊膜[36),而MSX2mRNA在人胎盘中检测到[37]。这使得我们研究了这两个基因在小鼠胚胎外组织中的表达。RT-qPCR结果显示，两种转录本在妊娠早期羊膜和尿囊中均有高表达(图)2 (e))。

POSTN编码一种描述不佳的细胞外基质(ECM)蛋白。它在心脏和发育中的胚胎羊膜中的表达已被报道[14，38]，尽管其在其他胚外组织的表达没有被记载。在独立的实验，POSTN被一致地发现表达在整个小鼠发育羊膜中富集（图2 (f)），但也有人在卵黄囊和尿囊检出。确实，原位杂交分析证实的高表达水平POSTN在E8.5 E9.5和鼠标羊膜和指出，表达是在羊膜中胚层主要（图3(一个)-3 (b))。POSTN在E8.5尿囊中未检测到表达，但是在尿囊/脐带在E9.5被清楚地检测到表达。同样，POSTN在E8.5时内脏卵黄囊间皮细胞中偶见表达POSTN整个羊膜，尿囊，和卵黄囊的间皮中观察到在E9.5表达（图3(一个)-3 (b))。

在人中，三个单独的胚胎的RT-qPCR分析表明POSTN妊娠的前三个月期间基因表达的高度富集在羊膜，在比较与其他胚外组织：绒毛膜、胎盘和脐带(图)4(一))。POSTN在脐带表达相对高以及，其结果为E9.5小鼠尿囊同样地（图2 (f))。因此,POSTN可以被认为是在人类羊膜标记过的，但它需要被指定其表达通过RT-qPCR中分离胚外组织仅验证（图4(一))。不像鼠标，POSTN逐步孕期人羊膜下降水平（图4 (b))。

POSTN表达富集在羊膜，但其在胚外组织中的表达不是排他性的羊膜。要使用POSTN有信心作为羊膜标记我们已经分析了在E8.5的胚外样品和E9.5小鼠胚胎不同胚外组织（图标记的组合5(一个)-图5（b）)。基于这些结果，我们认为羊膜是表达相对较高水平的POSTN和AP-2，以及可忽略的水平ζ球蛋白，法新社和TBX4(数据5(一个)-图5（b）)。

4。讨论

鉴于BMP4小鼠羊膜发育中表达是专利[16，导致BMP信号级联的几种成分缺失的遗传小鼠模型出现早期羊膜缺陷[6，而活跃的BMP- smad信号在早期器官发育过程中一直存在于羊膜中，因此我们假设BMP的靶基因是羊膜标记物。基于这些信息，我们采用有根据的猜测方法并确定POSTN从7个承认BMP靶基因预设选择作为整个妊娠期的羊膜富集的标记基因。

所有选择的BMP靶基因在小鼠羊膜进行了明确地表达，而另一种BMP靶基因的表达，特定尿囊标记物TBX4[25]，的确不是在羊膜检测。不同的选择的BMP靶基因的时空表达模式发展这表明它们不都属于一个组synexpression期间，在不同的胚外组织随后不同的趋势。例如，POSTN转录水平是整个妊娠期羊膜样品中不断地高，而Hand1和MSX2在器官形成期早期出现的成绩单富集于羊膜，但这个时间的函数变得不那么突出。相应的BMP靶基因的表达模式的时空区域化表明所研究的胚外组织被暴露于通过（不同的）BMP成形素和/或转录辅激活物和阻抑物可以导致的不同区域化信令的动态水平不同的转录反应。

Postn是一种分泌的ECM蛋白，与骨骼、心脏发育以及癌症有关[19]。该蛋白与纤维化的地方有联系;它可以直接与其他ECM蛋白，如纤连蛋白，生腱蛋白-C相互作用，胶原蛋白I，胶原蛋白V和硫酸肝素蛋白聚糖。骨膜素用作用于特定整联，例如配体αvβ3，αvβ5和α4β6但也与黏附点激酶相互作用，从而影响细胞迁移的能力[19，39]。POSTN在成纤维细胞或在以下内容的损伤事件采用成纤维细胞样特征的细胞中表达[19]。细胞外和分泌性质的Postn蛋白使其成为一个不太合适的羊膜标记，基于facs分类细胞。尽管如此,POSTN是一个有趣的BMP靶基因在高度拉伸的羊膜。的表达POSTN已被报道被BMPs诱导，但也被TGF诱导β1、机械拉伸[40]。转化生长因子的分泌的生长因子β和BMP的家庭是众所周知的他们心内膜垫发展的胚胎心脏管内的参与。POSTN研究表明，mRNA在发育中的小鼠胚胎和胎儿心脏中表达，并定位于心内膜垫，提示其在瓣膜形成和瓣膜疾病中发挥作用[41]。事实上,损失POSTN结果在间充质细胞坐垫和瓣膜异常，通过TGF不适当分化β心脏成熟过程中的-依赖通路[19，40，42，43]。到目前为止，尚无任何羊膜缺陷已报告POSTN空老鼠。它，然而，最近证实，POSTN与BMP-1相互作用。这种相互作用可能导致增强的BMP-1和沉积BMP-1介导的蛋白水解活化lysil在细胞外基质，其促进胶原蛋白交联氧化酶[44]。BMP-1，尽管其名称具有误导性，但它不是bmp相关的生长因子，而是一种前胶原c蛋白酶。有趣的是，BMP-1缺乏的小鼠确实会出现羊膜缺损[7]。

在过去的几年里，ECM被认为是正常组织和肿瘤中调节信号的重要来源(在[45]）。最近的研究表明癌症干细胞及其转移壁龛之间的联系。连同其他ECM蛋白腱C-POSTN在侵袭肺部的乳腺肿瘤起始细胞的转移生态位成分中起关键作用[46]。通过增强癌细胞中的Wnt和Notch信号，Postn和肌腱蛋白C为转移起始细胞提供物理和信号支持。POSTN缺陷小鼠发生乳腺肿瘤，但他们有能力转移到肺部的显著减少相比，野生型小鼠的肿瘤。Malanchi等。建议POSTN在肺转移的进展中的作用是在转移性利基集中Wnt配体为干细胞样转移起始细胞刺激[46]。POSTN促进肿瘤转移，并促进在肿瘤微环境侵袭也是在结肠直肠癌，胰腺癌，口腔癌，前列腺癌，食道癌，卵巢癌[47-52]。也许Postn在羊膜中的存在可能有助于细胞培养中羊膜细胞的重编程能力。

POSTN富集在小鼠羊膜，并且其表达水平保持在妊娠期间相当恒定。POSTNmRNA的定位出现在羊水中胚层，而羊水外胚层出现负（图3(一个))。这是胚胎在E8.5转弯时羊膜少拉伸之前尤为明显。POSTN可以被认为是一个合适的羊膜标记在人类也，虽然它的转录水平递减在怀孕期间。观察到的下降的时间似乎与羊膜和绒毛膜物理融合相相关，因此很容易推测，与以前周围的液体相比，机械拉伸和压力/绒毛膜接触的变化会使绒毛膜的收缩减弱POSTN在羊膜的水平。在妊娠的前三个月，POSTN与其他胚胎外组织(绒毛膜、胎盘和脐带)相比，它在人羊膜中高度富集，但它不仅限于羊膜，在脐带中的表达已证明。的表达POSTN整个妊娠期可以在不同的胚外组织，因为动态POSTN检测mRNA原位人term胎盘基质细胞的杂交[53]。在这项研究中，作者没有报道POSTN其他非胎盘胚外组织的表达水平。在任何情况下，分析一组人羊膜标记而不是使用单一标记基因是可取的，需要在这个方向进行更多的研究。

我们的原位杂交分析证实，小鼠POSTN早期的器官，此外，它是在羊水中胚层表达亮点期间羊膜充实。然而，POSTN表达可在的卵黄囊和尿囊间皮被观察为好。绕过基础上，分析羊膜身份过早地结论POSTN仅就表达水平而言，我们建议将羊膜、内脏卵黄囊和尿囊通过一组不同标记基因的表达谱进行分类。小鼠的羊膜特征是在早期器官发生高水平POSTN和AP-2，低水平的ζ球蛋白表达，和可忽略的水平法新社和TBX4（数字五)。内脏卵黄囊可归类为高表达的组织法新社和ζ珠蛋白，用温和的表达POSTN和AP-2，以及缺少TBX4;而尿囊的特征是高TBX4表达水平和弱表达Postn, Ap-2和ζ球蛋白。法新社在尿囊中检测不到表达(图)2 (b)和五）。以来ζ球蛋白是卵黄囊中原始造血细胞的标记物，在早期器官发育后不建议使用该标记物。

总之，我们建议使用POSTN和AP-2作为小鼠羊膜中富集的标记集，我们提出了一种标记组合作为小鼠胚胎外组织的转录签名。应该进一步鼓励对其他标记的无偏性鉴定，尤其是富含羊膜的细胞内蛋白和/或膜蛋白，以及羊膜标记板的使用。

致谢

作者感谢Zwijsen团队的所有成员，A.弗朗西斯，M.主演，和D Huylebroeck（鲁汶大学，比利时鲁汶），他们也感谢A.加缪（研究所雅克·莫诺，巴黎，法国）持续支持;C. L. Mummery (LUMC, Leiden, Netherlands) for Bre : LacZ mice; L. van Iperen for the collection of the human embryonic samples (LUMC, Leiden, Netherlands); J. Deprest (UZ Leuven, Leuven, Belgium) for term human amniotic tissues; E. Delot for Periostin; R. Schwartz for Tbx2; B. Bruneau for Tbx5; R. Hill for Msx1; E. Seuntjens for Msx2 plasmids. M. Dobreva is a VIB-predoctoral fellow. This work is supported by the Interuniversity Attraction Poles Program IUAP-6/20 (SCdSL and AZ), VIB, Grants from the Research Council of the KU Leuven (OT/09/053 and GOA/11/012) to A. Zwijsen.

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