羊膜是最内层的胚胎外的膜周围充满液体的脊椎动物的胎儿和对羊膜腔,从而提供一个封闭环境内的孕体,赋予保护和耐冲击性。在大多数脊椎动物,羊膜是一种薄而无血管的透明的膜。近年来,人类术语羊膜已经吸引了相当大的关注,因为amniotic-ectoderm——和mesoderm-derived细胞可以分化成三个生殖细胞层细胞培养。此外,居民羊膜干细胞的细胞外胚层(综述[已报告 1, 2),这个问题)。此外,低免疫原性的羊膜使得这个“医疗废物”组织(再生)医学的极大兴趣。事实上,羊膜已被用于在一个世纪作为伤口敷料。

最近,研究旨在探索羊膜干细胞的存在和起源已经完成,使用更强大的遗传模型生物,比如,老鼠和老鼠。尽管羊膜根本差异发展的杯状容器的圆盘形的灵长类动物胚胎和小鼠胚胎(评论: 2]),羊膜和羊水细胞与癌功能一直孤立从老鼠和老鼠 3, 4]。

在人类羊膜和绒毛膜围绕胚胎和膜融合在怀孕的第二个三个月,虽然卵黄囊是初级( 2]。相比之下,在鼠标,绒毛膜永远不会融合的物理分离后羊膜amniochorionic折原肠胚形成后不久在一天胚胎(E) 7.0 ( 6]。蛋壳变得合并胎盘绒毛膜磁盘,而羊膜变得内脏卵黄囊包围了,除了绒毛膜的磁盘。重要的是,羊膜一方面和卵黄囊和绒毛膜磁盘另一方面保持间隔的充满液体的exocoelomic腔(数字 1(一)- 1(c))。在小鼠胚胎,羊膜在妊娠期由一个简单的双层膜鳞状的中胚层和外胚层,分别面对exocoelomic和羊膜腔。

意识到人类和小鼠的根本不同的周围组织羊膜是重要的收集非灵长类物种的羊膜分离时所谓的羊膜干细胞( 2]。分子标记的可用性,特别是在羊膜和其他胚胎外的膜,或在相应的流体,因此有助于确定明确的初始原料干细胞是孤立的。

空间基因表达的研究很少在羊膜包括信息表达,部分原因在于这个组织似乎容易被忽视或丢弃,也因为通常很难区分低表达水平和背景染色由于扁平细胞结构的拉伸膜。据我们所知,amnion-specific基因没有明确被报道,但是羊膜的生理特性可能暗示对假定的候选人羊膜标记。抗拒的羊膜是一个弹性组织增加拉伸。因此,逐步,基板由胶原蛋白、层粘连蛋白,nidogen,纤连蛋白纤维在羊膜外胚层和中胚层之间形成 7, 8]。羊膜上皮细胞获得越来越多的表面微绒毛,这可能与增强过滤和跨膜运输能力。小鼠模型与羊膜受损发展也可能密报候选人羊膜标记。值得一提的是很少有鼠标显示羊膜缺陷突变体形成(综述[描述 6]),与许多缺陷的突变体在尿囊 9)或胎盘( 10]。许多突变体显示缺陷主要与羊膜开发似乎点受损骨形成蛋白(BMP)信号( Bmp2, Smad5)或在基因编码假定的BMP信号调节器( 飞行员,Bmp1)。Amnionless ( 飞行员)突变体开发最具体的缺陷,因为他们缺乏一个羊膜,而蛋壳,卵黄囊血岛屿,和尿囊正常发育 11]。 Bmp2零胚胎未能关闭羊膜( 12]。老鼠缺乏 Smad5BMP信号的细胞内的中介,也显示延迟羊膜关闭,除了当地羊膜增厚含有异位干细胞的细胞,造血和内皮细胞 13- - - - - - 15]。几个配体有可能引起羊膜的BMP信号。 Bmp4在鼠标羊膜表达丰富,但 Bmp2和 Bmp7成绩单也被报道在羊膜和邻近组织( 16- - - - - - 18]。

在羊膜BMP信号发展的至关重要的作用让我们假设目标基因BMP羊膜的候选标记。给穷人的文档这样的目标基因的表达在发展中羊膜和周边组织,我们有进行了比较基因表达分析的几个这样的目标基因在不同的胚胎外的组织。periostin成绩单( Postn)似乎是高纯度在老鼠和人类羊膜在不同的发展阶段。Periostin ECM分泌蛋白,可以与不同的ECM蛋白质和整合蛋白和转化生长因子诱导的(TGF) β和每个组织进行改造或积极的压力(了 19])。 原位杂交分析确认amnion-enriched定位 Periostin信使rna在羊膜。我们建议使用的组合 Periostin和 AP-2为开发鼠标羊膜作为生物标志物。

后立即羊膜形成鼠标羊膜分离和划定了胚胎外的地区从胚胎孕体区域。在那个阶段羊膜不围绕着发展中胚胎(图 1(a))。在器官形成早期阶段胚胎经历一个轴旋转,因此它被羊膜和卵黄囊包裹(数字 1(b) - 1(c))。鼠标羊膜是由羊膜外胚层的连续性与羊膜的胚胎外胚层和中胚层分享其边界的间皮则勾勒出内脏卵黄囊和尿囊/脐带在最后羊膜的一部分(图 1(a))。

调查是否BMP抒发SMAD-mediated BMP信号,除了羊膜关闭阶段,我们监控BMP-SMAD激活羊膜BRE: LacZ记者胚胎。这些小鼠胚胎报告的目标基因表达激活激活BMP-SMADS [ 5)(图 1(d) - 1(h))。羊膜关闭之前,活跃BMP-SMAD信号是最主要的羊膜amniochorionic褶皱的外胚层组件(图 1(d))。后关闭高BMP-SMAD信号水平坚持羊膜的两层,和信号域开始扩展到extraembryonic-embryonic交界地区,更确切地说在前胚胎外胚层和中胚层和最后胚胎中胚层和羊膜的胚外中胚层,尿囊和卵黄囊(数字 1(e) - 1(h))。

人羊膜和内脏卵黄囊(称为从此卵黄囊)从E8.5 microdissected, E9.5, E13.5, E18.5小鼠胚胎,早期器官发生、器官形成,早产的发展阶段。此外,尿囊E8.5中分离的E9.5胚胎。从至少5个胚胎组织汇集E8.5和E9.5样本,同时组织从年长的妊娠阶段分别处理,然后mRNA孤立和互补脱氧核糖核酸合成。评估这些样品的质量,记录丰富的存在在不同的胚胎外的组织是由定量评估一(RT-qPCR)。 Tbx4是用作allantois-specific标记( 25] ,和 法新社和 ζ球蛋白标记的内脏内胚层和原始造血的细胞,分别,后者发展的中胚层内脏卵黄囊( 26, 27]。一个适当的amnion-specific标记在这个阶段,但缺乏 Ap-2( Tfap2A)是包含在分析,如我们之前报道这nonneural表面外胚层和神经嵴细胞的标志( 28在羊膜外胚层中也大量表达 13]。这一分析表明,microdissected羊膜样本不含有尿囊(图 2(一个))或卵黄囊(图 2 (b))组织。

相同的相同的羊膜、内脏卵黄囊和尿囊样本RT-qPCR异形的7所选的表达BMP目标( Tbx2、Tbx5 Hand1、Hand2 Msx1 Msx2和 Postn)作为首选标准(a)假定的羊膜的识别标记。

T-box转录因子编码基因的转录水平 Tbx2高尿囊、卵黄囊的羊膜相比(图 2 (c))。尿囊的表情似乎最主要E8.5和关联表达域之前报道的 原位杂交( 29日]。这个微分的浓缩尿囊becomes-unlike Tbx4信使rna expression-progressively从E9.5开始失去。表达的领域 Tbx5已经记录了 原位杂交E7.5胚胎(尿囊的 30.]。的 Tbx5分析不会导致一个稳定和健壮的模式表达在不同的胚胎外的组织(图 2 (c))。因此,我们认为没有 Tbx5也不 Tbx2作为羊膜的候选标记。

Hand1和 Hand2编码基本helix-loop-helix转录因子,心脏和胚胎外的发展是至关重要的 31日),与 Hand1看似有利的候选人羊膜的标志(图 2 (d))。然而,除了强大的表达式在羊膜 32)的高表达 Hand1已经证明的卵黄囊 Hand1: LACZ记者鼠标应变( 31日]。此外,Hand1-deficient胚胎卵黄囊血管缺陷,表明Hand1卵黄囊发展是很重要的 33]。

Msx1和 Msx2要看更多有关憩苑是homeobox-containing转录因子参与神经管,心,牙齿,肢体,和颅面发展,据报道,立即效应器BMP信号(了 34, 35])。 Msx1表情已经报道了小鸡羊膜( 36),而 Msx2信使rna被发现在人类胎盘( 37]。这使得我们研究这两个基因的表达在小鼠胚胎外的组织。RT-qPCR结果显示高表达的成绩单在羊膜早期怀孕期间还在尿囊(图 2 (e))。

Postn编码一个糟糕的描述细胞外基质(ECM)的蛋白质。其表达式被报道在发展中胚胎的心脏和羊膜( 14, 38),虽然其在其他肿瘤组织的表达没有被记录。在独立的实验中, Postn表达一贯发现富含羊膜在鼠标(图发展 2 (f)),但它也发现卵黄囊和尿囊。的确, 原位杂交分析证实了高表达水平 Postn在鼠标羊膜E8.5 E9.5和强调,表达主要在羊膜中胚层(数字 3(一个)- - - - - - 3 (b))。 Postn表达式中没有检测到E8.5尿囊,但表情显然是检测尿囊/ E9.5脐带。同样的, Postn表情只是偶尔间皮细胞中检测到的内脏在E8.5卵黄囊,但是 Postn表达式中观察羊膜的间皮,尿囊,卵黄囊E9.5(数字 3(一个)- - - - - - 3 (b))。

在人类,RT-qPCR分析表明,三个单独的胚胎 POSTN基因表达是高纯度羊膜在怀孕的前三个月,相比与其他胚胎外的组织 :绒毛膜胎盘和脐带(图 4(一))。 POSTN表达式的脐带也相对较高,类似于E9.5老鼠尿囊(图的结果 2 (f))。因此, POSTN也可能被视为人类羊膜标记,但它需要指定它的表达只是验证了RT-qPCR孤立的肿瘤组织中(图 4(一))。不像老鼠, POSTN水平在人类羊膜在妊娠(图逐步减少 4 (b))。

Postn表达丰富的羊膜,但其表达在胚胎外的组织不是独家羊膜。使用 Postn有信心作为羊膜标记我们分析了标记的组合不同的胚胎外的组织在胚胎外的样品E8.5和E9.5小鼠胚胎(数字 5(一个)- - - - - - 5 (b))。基于这些结果,我们得出这样的结论:羊膜是一个组织表达水平相对较高 Postn和 Ap-2和可忽略的水平的 ζ球蛋白, 法新社和 Tbx4(数据 5(一个)- - - - - - 5 (b))。

考虑到 Bmp4表达式是专利发展中鼠标羊膜( 16),基因小鼠模型缺乏几个组件的BMP信号级联发展早期羊膜缺陷( 6),积极BMP-SMAD信号正在进行羊膜早期器官发生发育期间,我们假设目标基因BMP假定的羊膜标记。基于这些信息,我们跟着一个受过教育的猜测方法和识别 Postn7承认BMP的预设选择目标基因作为amnion-enriched标记基因在妊娠。

所有选定BMP目标基因在鼠标羊膜明确表示,而另一个BMP的目标基因的表达,allantois-specific标记 Tbx4( 25),确实是在羊膜无法察觉。时空表达模式的不同选择BMP目标基因不同的趋势不同的胚胎外的组织在开发这表明他们不属于一个synexpression组。例如, Postn转录水平不断在妊娠高羊膜样本,而 Hand1和 Msx2记录出现丰富的羊膜早期在器官形成,但这在时间的函数变得不那么突出。的时空区域化各自BMP目标基因的表达模式表明,肿瘤组织在调查中暴露于动态信号的水平(不同的)BMP形态因子和/或不同的转录辅活化因子区域化和可能导致不同的转录抑制因子响应。

Postn ECM分泌蛋白,相关骨骼和心脏发展以及癌症( 19]。与领域相关的蛋白质纤维化;它可以直接与其他ECM蛋白质,如纤连蛋白、tenascin-C,胶原蛋白,胶原蛋白V和硫酸肝素蛋白聚糖。Periostin作为配体为特定蛋白等 αv β3, αv β5和 α4 β6但交互也粘着斑激酶和可以影响细胞迁移的能力( 19, 39]。 Postn表达成纤维细胞或细胞,采用呈特征后受伤事件( 19]。Postn蛋白质的分泌细胞外和性质使这个不适当的细胞羊膜FACS-based排序的标志。尽管如此, Postn是一个有趣的BMP目标基因的高度拉伸羊膜。的表达 Postn据报道被bmp诱导,但也由TGF吗 β1,通过机械拉伸( 40]。TGF分泌生长因子 β和BMP的家庭为他们的参与是众所周知的在胚胎心脏心内膜垫发展管。 Postn信使rna表达已被证明是在发展中老鼠胚胎和胎儿心脏和本地化的心内膜垫暗示作用valvulogenesis和瓣膜病 41]。事实上,损失 Postn结果在不适当的缓冲间充质细胞的分化和通过TGF瓣膜异常 β端依赖途径期间建立的成熟的心 19, 40, 42, 43]。到目前为止没有报告羊膜缺陷 Postn零老鼠。然而,最近被证实,Postn与BMP-1交互。这种交互可能导致增强沉积BMP-1和BMP-1-mediated蛋白水解lysil氧化酶的活化细胞外基质,促进胶原蛋白的交联( 44]。BMP-1,尽管其误导性名称,不是BMP-related生长因子但胶原C-proteinase。有趣的是,老鼠缺乏BMP-1做开发一个羊膜缺陷( 7]。

在过去的几年里,ECM已被认为是一个重要的监管信号来源正常组织和肿瘤(了 45])。最近的研究表明癌症干细胞及其转移领域之间的联系。连同另一个ECM protein-tenascin C - Postn扮演重要角色转移利基组件breast-derived入侵肺部肿瘤起始细胞( 46]。通过提高Wnt和Notch信号癌细胞,Postn和tenascin C提供身体和信号支持metastasis-initiating细胞。 Postn缺乏小鼠乳腺肿瘤发生发展,但他们的能力转移到肺部肿瘤在野生型小鼠相比明显减少。Malanchi等人提出的角色Postn Wnt配体在肺转移的进展集中在转移性小众的刺激茎状的metastasis-initiating细胞( 46]。Postn促进肿瘤转移和促进入侵在结直肠肿瘤微环境也,胰腺癌、口腔、前列腺癌、食管和卵巢癌 47- - - - - - 52]。也许Postn在羊膜的存在可能导致细胞培养的羊膜细胞重编程能力。

Postn在鼠标羊膜、丰富,妊娠期间保持相对稳定的条件下的表达水平。 Postn信使rna出现局部羊膜中胚层,羊膜外胚层出现负(图 3(一个))。这个特别明确胚胎在羊膜E8.5不太紧张。 POSTN可以被认为是一个合适的羊膜标记在人类,尽管其转录水平在妊娠期间逐步减少。观察的时机似乎与减少阶段当羊膜和绒毛膜身体融合,因此容易推测变化机械拉伸和压力/接触绒毛膜相比以前周围液体变弱 POSTN羊膜的水平。在怀孕的前三个月, POSTN是人类羊膜高纯度对比其他胚胎外的组织(绒毛膜胎盘和脐带),但它并不局限于羊膜,证明了其表达式的脐带。的表达 POSTN在妊娠可能在不同的胚胎外的组织,因为是动态的 POSTN信使rna被检测到 原位在人类胎盘[的基质细胞杂交 53]。在这项研究中作者没有报告 POSTN表达水平在其他非胎盘类胚胎外的组织。在任何情况下,分析人类羊膜组标记,而不是使用一个标记基因是可取的,并需要进行更多的研究在这个方向。

我们的 原位杂交分析证实了鼠标 Postn被浓缩在羊膜早期器官形成和凸显此外,表示在羊膜中胚层。然而, Postn表达式中可以观察到间皮的内脏卵黄囊和尿囊。绕过过早得出结论羊膜身份进行分析的基础上 Postn表达水平,我们建议对羊膜进行分类,发自肺腑的卵黄囊和尿囊表达式分析一组不同的标记基因。鼠标在器官形成早期羊膜的特点是高水平的 Postn和 Ap-2,低水平的 ζ球蛋白表情,和可忽略的水平的 法新社和 Tbx4(图 5)。发自肺腑的卵黄囊可分为组织高水平的表达 法新社和 ζ球蛋白,与温和的表达 Postn和 Ap-2,没有 Tbx4;而尿囊的特点是高 Tbx4表达水平和弱的表达 Postn, Ap-2和 ζ球蛋白。法新社表达式中无法在尿囊(数字 2 (b)和 5) 。自 ζ球蛋白是原始的标记haematopietic卵黄囊细胞,这是不明智的使用这个标记以外的器官发生早期发育。

总之,我们建议使用 Postn和 Ap-2作为标记集浓缩在鼠标羊膜和我们提出的组合标记作为不同的转录签名老鼠胚胎外的组织。附加标记的无偏识别,优先amnion-enriched胞内蛋白和/或膜蛋白,和面板的使用应进一步鼓励羊膜标记。