再生医学中非人灵长类诱导的多能干细胞

摘要

在已获得诱导多能干细胞的各种物种中，非人灵长类动物(NHPs)作为临床前模型具有独特的作用。它们与人类的亲缘关系和相似的生理，包括中枢神经系统，使它们成为翻译研究的理想对象。本文综述了从不同NHP物种中获得iPS细胞系的研究进展。我们专注于狨猴的iPS细胞系，这是一种小型的NHP，可以模拟几种人类疾病状态。在再生医学中，绒猴可以作为实施患者特异性自体细胞治疗的模型。

1.再生医学中的诱导多能干细胞

再生医学的目的是恢复因疾病或衰老而受损的器官的健康功能。一个主要问题是用于再生医学的细胞来源。通常认为使用患者自身的细胞是可取的，因为假设这样可以避免使用药物来抑制移植细胞的免疫排斥反应。诱导多能干细胞(iPS细胞)的发现极大地扩展了在再生医学中使用患者特异性细胞的可能性[1.,2.］．iPS细胞可以从任何体细胞中提取，但具有胚胎干细胞的特性。像胚胎细胞一样，它们可以用来产生再生医学中可能需要的任何身体细胞。人们普遍认为一种自体的细胞疗法将成为可能,在“诱导多能性”细胞来自患者的细胞,以提供一个来源的细胞可以被移植到心脏病人恢复功能、中枢神经系统、造血系统、或其他受疾病或衰老影响的器官。目前的实验涉及非人灵长类动物模型的发展，以iPS细胞为基础的自体细胞治疗。

2.细胞治疗中自体细胞与异体细胞的比较

任何考虑将再生医学应用于人体试验对象时，必须评估用于治疗的细胞的来源[3.,4.］．随着iPS细胞的发现，人们几乎立刻意识到这一发现为自体细胞治疗开辟了道路。2007年的一项综述指出:“如果这种方法可以应用于人类，那么就可以在不使用捐赠的卵子或胚胎的情况下制造患者特异性干细胞。”[5.］．假设如果细胞接受为“自我”然后他们将是最好的功能移植的结果:细胞功能在自然环境中,没有引起慢性免疫或炎症反应,如果没有问题,将导致免疫抑制药物的使用。换句话说，它们将成为基于细胞移植的最佳可能治疗结果的“黄金标准”。虽然同种异体细胞可能对患者产生可接受的结果，但自体细胞移植将提供判断同种异体细胞结果的标准。

在发现iPS细胞后不久，这项技术被用于一项tour-de-force研究，在该研究中，iPS细胞来自一种模拟人类镰状细胞贫血的小鼠。iPS细胞中的遗传缺陷得到纠正，并在分化为造血干细胞后移植回同一品系的小鼠体内[6.］．在处理的小鼠的症状基本上改善。这是的iPS细胞治疗的潜在力量的第一个示范。由于这些细胞源自并重新引入，同株的小鼠，它们在使用同基因细胞的一个实例，而不是真正的自体细胞。随后，另一项研究表明，同基因的iPS细胞和它们的子代细胞可以，事实上，引起免疫应答[7.］．这一出人意料的发现尚未得到令人满意的解释。截至撰写本文之日，iPS细胞及其衍生物的免疫原性问题仅在小鼠中得到了解决，尚未在包括灵长类在内的更多翻译相关物种中得到解决。

基于使用自体细胞的治疗方法是否值得进行必要的大量开发和实施工作？目前的答案尚不清楚。首先，在缺乏合适的转化模型或基于iPS细胞的治疗的实际临床试验的情况下，优势必须保持在理论上。我们不知道以自体细胞为基础的治疗与以异体细胞为基础的治疗相比会有多好。可能，自体细胞会被证明是优越的，但可能与异体细胞没有什么区别。在一些治疗中，需要非常快速的治疗将排除使用自体细胞细胞。例如，在中风中，由于需要立即治疗，需要“现成”细胞，而iPS细胞不太可能有用。然而，了解免疫匹配与不匹配细胞在中风模型中是否具有优势将具有重要意义。

第二，很难预测以诱导多能干细胞为基础的治疗最终会变得多么容易。当2006-2007年首次从皮肤成纤维细胞中制造iPS细胞时，重新编程是非常低效和费力的。在过去4年里，在更好、更简单的协议和提高效率方面取得了惊人的进展[8.–11.］．鉴于没有理由认为该过程不应该继续在效率经过这种改进，它很可能是iPS细胞来自患者的细胞建立将在未来的一段时间内变得相当常规的和便宜的。在效率和成本类似的显着改善已经出现在其它生物医学技术，例如，DNA测序。

在再生医学非人灵长类动物研究的重要性3。

之前，有可能考虑采用自体细胞治疗人类患者，iPS细胞的特性，必须彻底在合适的动物模型研究，以确保自体细胞治疗是既安全又有效。人们普遍认为，临床相关的实验应该在非人灵长类动物（NHP），而不是啮齿动物进行。NHP中被认为是理想的，因为它们关联到人类和他们相似的生理这种临床前试验，特别是对于中枢神经系统。移植细胞功能的长期研究（> 3年）将有可能在NHP中，但在啮齿动物是不可能的。

因此，NHPs中基于iPS细胞的再生医学有一条从基础研究到转化研究的明确道路。在可使用的各种NHPs中，绒猴具有几个关键优势。普通绒猴(普通狨猴)具有体型小、繁殖快、居住条件明确等优点。与人类不同，在人类中，不受控制的环境和许多共病是混杂因素，狨猴可以居住在明确的环境中，并且几乎没有已知的共病[12.］．各种人类疾病都有可能在狨猴身上建模[13.–15.］．一种化学诱发的帕金森氏病模型也在这一物种中得到了发展[16.]还有一个中风模型[17.]已开发。组织学和MRI脑图谱可用[18.].狨猴的基因组已经完成[19.]，而狨猴是迄今为止第一个也是唯一一个拥有转基因模型的灵长类动物，显示生殖系传播[20.］．虽然在恒河猴身上也产生了转基因基因，但它们没有将转基因基因传给后代[21］．帕金森氏病的基因模型通过过度表达α-synuclein已经在狨猴身上得到了发展[20.］．最后，在一个狨脊髓损伤模型已在移植的人的试验中使用的神经干潜在治疗效应细胞[22,23].我们的长期目标如图所示1..

4.NHP iPS细胞研究进展

尽管NHPs在再生医学中很重要，但与小鼠和人类来源的iPS细胞相比，NHPs来源的iPS细胞的研究相对较少。第一批NHP iPS细胞来自恒河猴[24］．目前(2011年9月)，iPS细胞已经从5个NHP物种中获得(表1)1.）;三种猕猴(恒河猴、梳尾猕猴和食蟹猴)，一种普通的狨猴和一种濒危的灵长类动物，钻猴[24–33］．所有关于NHP iPS细胞的报道的共同特征是:主要由携带转录因子cdna的逆转录病毒混合物衍生POU5F1,SOX2,KLF4，和MYC；在长期培养中保持多能性特征;能分化为三个胚层的细胞和组织;缺乏恶性特性，尽管在免疫缺陷小鼠中有形成良性畸胎瘤的能力[24–33］．

5.狨iPS细胞：一种自体细胞治疗模型

我们研究的最终目标是从单个狨猴获得iPS细胞，并将细胞植入供体动物，遵循iPS细胞定向分化为特定的细胞谱系(图)1.）．在这类研究成为可能之前，需要对免疫缺陷小鼠进行广泛的体外调查和研究。

我们选择从皮肤成纤维细胞中提取狨猴iPS细胞，因为成纤维细胞是iPS细胞生成研究最广泛的细胞类型，并且因为使用小的皮肤活检作为起始材料与iPS细胞及其衍生物的未来临床应用相关。在最初的实验中，我们使用成纤维细胞源自刚出生的绒猴皮[25］．编码人类Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc cdna的逆转录病毒[2.]是在开发平台-A细胞中制备，并通过聚凝胺絮凝浓缩[34］．用浓缩病毒感染细胞后，在正常成纤维细胞生长条件下加入丙戊酸[35］．14-21天后，在融合的成纤维细胞培养中发现了形态改变的小菌落。这些菌落由快速分裂的小细胞组成，具有高的核/胞浆比和显著的核仁。当含有这种菌落的培养物被固定并进行碱性磷酸酶活性染色时，发现大多数形态改变的小菌落碱性磷酸酶呈阳性，碱性磷酸酶是多能性的标志[36]这些菌落迅速扩张，产生非常密集的小细胞斑。这些细胞具有先前报道的人类iPS细胞的形态学特征[2.］．

从4×10的人口开始^5.绒猴成纤维细胞，我们获得了约100个具有iPS细胞样形态的细胞集落。在饲养层上分离和扩增集落。从成纤维细胞培养物中分离的这些集落中，30个显示出持续生长并能够扩增到可以冷冻保存的程度。在这些集落中，选择了8个用于进一步培养染色体核型通过G显带进行了研究，发现是正常的[25］．随着绒猴iPS细胞克隆在饲养层上的最初扩展，我们研究了细胞是否可以在无饲养条件下生长。细胞在含20%胎牛血清和40% mef条件培养基的基质涂层培养皿中复制，并继续快速生长。细胞群在这些条件下进行了进一步的研究。

狨猴iPS细胞克隆表达多能性标记物的水平可与人类胚胎干细胞系(I6)媲美或超过该水平[25］．8个狨猴iPS细胞克隆中，NANOG和SOX2 mRNA水平均高于I6细胞，OCT4 mRNA水平与I6细胞相当。iPS细胞克隆中OCT4 mRNA水平>比用于重编程的成纤维细胞高100倍，NANOG和SOX2水平>高50倍。我们评估了用于重编程的两个因子OCT4和SOX2的载体和总mrna的相对水平。我们使用了特定于重组载体的引物对(载体序列5 '引物和编码区域3 '引物)。载体OCT4 mRNA占总OCT4 mRNA的0.01% ~ 0.1%，载体SOX2 mRNA占总SOX2 mRNA的0.1% ~ 1%。这些发现表明，病毒基因组被适当地沉默[38］．

为了评估狨的iPS细胞克隆的分化成所有三个胚层的细胞的潜能，细胞移植到免疫缺陷小鼠（皮下注射在50％基质胶：[39,40])来自绒猴iPS细胞的畸胎瘤包含多种组织结构，代表所有三个胚层的衍生物。因为据报道，来自不完全重编程细胞的畸胎瘤形成外胚层和中胚层起源的组织，而不是内胚层起源的组织[38]我们对内胚层起源的成熟结构的发育进行了组织学研究；我们观察了内胚层组织，包括简单的柱状和假复层上皮、含杯状细胞的上皮和外分泌腺结构[25].同时进行免疫组化研究；外胚层组织（发育中的神经组织）通过存在βIII微管蛋白;由平滑肌肌动蛋白中胚层组织;内胚层组织由α-甲胎蛋白。

接着，我们研究了多顺反子载体的电位用于重编程（图2.）．该逆转录病毒载体具有以下特征:(a)由于重编程因子的表达是由5 ' LTR驱动的，如果细胞已适当重编程，则在重编程过程中表达沉默[38];(b)所有因素都在一个病媒中，从而避免了非常高效感染的需要;(c)作为逆转录病毒载体，只有正在分裂的细胞才会被感染(这并不会降低这类载体的价值，因为诱导多能性细胞必须来自能够细胞分裂的细胞);(d) loxP位点可在需要时进行编码区切除。使用该多顺反转录病毒载体获得的狨猴iPS细胞表现出与四种因子共同感染获得的iPS细胞克隆相同的特性。因此,细胞由1:1:1:1的表达四个重组因子属性基本相同派生的合并感染,的表达比四个因素不一定是平等的,几乎可以肯定不同克隆克隆。

尽管这类逆转录病毒载体具有优势，但使用整合形式的病毒载体进行重编程可能会被使用修饰的mRNA或修饰的蛋白质的非病毒重编程方法淘汰[9］．这些方法避免了在重编程过程中靶细胞的任何遗传修饰。

狨猴iPS细胞的长期成功扩张对于细胞特性的广泛研究至关重要。虽然我们确定了细胞生长的无饲料条件，但这些条件需要胎牛血清和适合细胞类型的培养基，如小鼠胚胎成纤维细胞。最近，我们已经确定绒猴iPS细胞可以在不添加血清或由另一种细胞类型调节的培养基中持续长时间生长。几种确定的培养基支持绒猴iPS细胞长期生长，而不丢失多能性基因(如NANOG和OCT4/POU5F1)的表达。由共感染获得的克隆和由多顺反子载体感染获得的克隆都可以在规定的培养基中生长(图)3.）．

总之，根据形态学、生长需求、多能性因子表达、逆转录病毒沉默以及产生畸胎瘤的能力的标准，我们得出这些细胞线代表了所有三个胚层的组织善意的诱导多能干细胞。

6.绒猴iPS细胞向神经前体细胞的分化

在随后的工作中，我们研究了绒猴iPS细胞系在体外向神经系细胞分化的潜力。iPS细胞向神经祖细胞（NPC）的分化已被广泛用于测试适当的多能性；例如，这种形式的定向分化被用于最近一组具有良好特征的人类iPS细胞的测试[10.,11.］．鼻咽癌的产生有三种一般类型:基质细胞衍生的诱导活性(SDIA)，一种由某些间充质细胞(如PA6细胞系)分泌的因子的混合物，特征相对较差[2.,41,42];胚状体(EB)形成，然后在有神经基底培养基存在的适当表面上覆盖胚状体[43,44];以及使用小分子的诱导，如通过SMADs化学抑制BMP/激活素/节点信号[45］．我们在狨猴iPS细胞中使用了这些方法，它们都产生了NPC细胞系(图)4.）．

7.摘要

总而言之，来自NHPs的iPS细胞在临床前研究中具有独特的重要性，从而导致在人类患者中实施再生医学。我们从狨猴中获得并描述了iPS细胞，这是一种小型的NHP，可以作为涉及iPS细胞的自体细胞治疗的合适模型。未来的研究将测试个体狨猴的自体细胞治疗原则。

致谢

作者实验室的工作由美国国立卫生研究院（R21AG03266）资助，由美国退伍军人事务部（I01BX01454）、TED纳什长寿基金会和欧文斯医学研究基金会资助。S. Farnsworth得到了资助T32 DE014318的支持。（颅面部口腔生物学学生学术研究培训）。

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