High-Resolution Genomic Profiling of Chromosomal Abnormalities in Human Stem Cells Using the 135 K StemArray

摘要

长时间培养干细胞会导致获得性染色体畸变。由于拷贝数变异(CNV)对基因表达和致瘤潜力有显著影响，因此确定干细胞系拷贝数变异(CNV)是至关重要的。在这里，我们描述了我们的StemArray的改进版本，这是一个干细胞聚焦比较基因组杂交(aCGH)微阵列，包含135,000个探针，在外显子水平覆盖了270多个干细胞和癌症相关基因。为了获得更高分辨率的细胞系遗传图谱，我们戏剧性地增加了整个基因组的中位探针间距。为了说明使用StemArray的重要性，我们描述了一个核型正常的iPSC细胞系，在该细胞系中我们检测到了可能影响细胞表型的获得性染色体变异。如果干细胞要用于再生医学，识别干细胞系中的自适应染色体畸变是必要的。

1.介绍

多项研究表明，人类胚胎和诱导多能干细胞(ESCs, iPSCs)在长期培养过程中会发生基因组异常[1-3]。这些染色体畸变会对细胞的存活、增殖能力和分化潜能产生巨大影响，导致实验结果不可靠，危及其在再生医学中的潜在应用。干细胞研究人员监测细胞系基因组稳定性最常用的方法是g带核型分析。然而，该方法只能检测5megabases (Mb)以上的大变化，因此，大多数较小的染色体变化被遗漏。最近，许多研究小组已经开始使用其他方法来进行干细胞特性分析，包括基因表达谱分析和基于阵列的比较基因组杂交(aCGH)微阵列分析[4-6]。Although gene expression profiling is beneficial to illustrate the true transcriptional state of the cells, the resolution of this technique is over 10 Mb in size [4]。aCGH是一种可以在100 Kb以下的典型分辨率下检测不平衡结构异常的技术。利用aCGH微阵列检测干细胞拷贝数变化的研究发现，在培养适应过程中获得了大量的亚核型改变[2，6]。然而，这些研究中使用的阵列为非靶向全基因组拼接阵列，通常单基因覆盖率低，常规分析成本较高。

We previously developed a stem-cell-targeted aCGH microarray which contains 44 K probes with increased probe coverage in targeted regions [7]。在这里，我们描述当前使用的各种干细胞实验室来刻画他们的干细胞系的基因组完整性StemArray的更新和改进的版本。The array contains 135 K probes to cover the entire genome at an average resolution of 15 Kb. In addition, the custom-targeted microarray has exon level resolution in over 270 stem cell and cancer-related genes. The use of the 12 × 135 K array platform, which allows 12 samples to be run per slide, significantly reduces the costs of the array and makes it competitive in pricing with karyotype analysis.

2。材料和方法

2.1。iPSC系文化

在研究中使用iPSC系使用的标准逆转录病毒转导的成纤维细胞产生OCT4，SOX2，KLF4,和C-MYC。在上述条件下，在基质(BD Biosciences)基质上培养得到的iPSC系[7]。使用Puregene DNA纯化试剂盒(Qiagen)分离基因组DNA，使用ND-1000分光光度计(NanoDrop)检测质量。

2.2。的aCGH

干细胞聚焦微阵列是由Ambry Genetics公司(Aliso Viejo, CA)使用罗氏NimbleGen探针装置开发的。该芯片包含135,000个探针，这些探针注释了人类基因组组装37 (UCSC hg 19)。在超过270个干细胞和癌症相关基因的探针密度增加，平均在这些区域(可要求提供基因列表)。其余的探针以15 Kb的探针间距平铺在基因组主干上。在验证运行之后，只有性能最佳的探针才被选择用于最终的阵列设计。aCGH按照Roche NimbleGen方案(V.8.0)进行。简单地说，500ng的人类干细胞DNA和500ng的混合性别匹配参考DNA (Promega)在98℃热变性10分钟，然后用Exo-Klenow片段标记蓝氨酸3随机Nonamers和蓝氨酸5随机Nonamers。用异丙醇沉淀法纯化标记的DNA，用ND-1000分光光度计测定标记效率。根据浓度，20μ将标记的样品g和参比DNA与2X杂交缓冲液、杂交组分A和比对oligo一起放入135k StemArray (Ambry Genetics)上。微阵列在Maui杂交系统(Roche NimbleGen)上杂交，42℃，72小时。按方案冲洗切片，2点扫描μNimbleGen MS200高分辨率扫描仪上的M分辨率。

2.3。数据分析

数据提取和使用NimbleScan 2.6软件包（罗氏的NimbleGen）归一化。对于像差通话，标准化的数据集被导入的Nexus拷贝数6.0版本（生物发现）。为了校正的GC含量，降噪系统修正文件的基础上，在设计探针的基因组位置发展。使用FASST2分割算法与1.0E-6的显着阈值进行了测定异常区域。像差滤波器是用下面的参数中选择：在该区域4中，最小绝对平均对数探测器的最小数量₂ratio for one copy amplification was  .3 and for a heterozygous deletion −.3, and a mean log₂比率≥1.0表示高拷贝增益，≤1.1表示纯合拷贝损失。

3.结果与讨论

在努力在基因干细胞维持重要的是找出较小的基因内的变化，我们已经取得了显著改善此前公布的StemArray设计[7]。The probe content has increased from 44 K probes to 135 K probes, resulting in an overall increase in backbone resolution from 43 Kb to 15 Kb, respectively. The updated design also includes on average of 5 probes per exon in over 270 stem cell and cancer-related genes, enabling single exon resolution in these functionally important regions. For example, the 28 exons of the kinase BUB1, a key “stemness” gene essential for maintaining genomic stability, are covered at the exon level by 141 probes (Figures图1（a）和图1（b））8，9]。相比之下，标准目录135 K非目标数组中只包含一个探针BUB1基因(图1 (c))。

iPSC系通常是由转化成纤维细胞的逆转录病毒载体含有OCT4，SOX2，KLF4,和C-MYC[10]。这些基因的iPSC的aCGH数据提供良好的阳性对照，因为这些转基因的多个副本融入DNA。Using our previous 44 K design, we were not able to detect transgene integration ofOCT4由于缺乏外显子质量探头。However, with the new 135 K design, we are able to identify high copy amplifications of all four pluripotency genes (Figures2(一个)-图2（d）)。

To illustrate the importance of characterizing stem cell lines with a stem-cell-focused microarray, we monitored the genomic stability of a late passage iPSC line by both G-banded karyotyping and the custom focused 135 K StemArray. Karyotype analysis revealed no aberrations in this iPSC line (Figure图3（a）)。根据这一结果，大部分的干细胞研究人员会考虑该细胞系正常的，适合进一步的研究。However, high-resolution aCGH analysis revealed 9 subkaryotypic variations in the iPSC line ranging in size from 1.5 Kb to 595 Kb (Figure图3（b）)。

当在iPSC系导电的aCGH，建议首先确定从该细胞所来源的亲本成纤维细胞系的基因组谱。由于所有的个体的基因组DNA含有复制数量的变化，执行该初始测试将允许人们从分离那些固有的亲代成纤维细胞培养期间获得的染色体变化。此外，它是不寻常的成纤维细胞系以类似于干细胞培养获得基因组改变。对这些细胞的前一个导出的iPSC系表演的aCGH是一个不想浪费时间和金钱从开发已经含有有害畸变成纤维细胞的干细胞系好习惯。通过这样做，当从任一的融合的4个转基因的，或存在于亲代成纤维细胞群体拷贝数变异衍生我们可以分类所识别的变化的7。因此，剩余的2个像差已被重新编程或延长培养期间iPSC系获得的。

3q13.13的595 Kb扩增包含8个基因，包括干细胞相关基因DPPA2和DPPA4基因(图图4（a）)。一些研究已经确认这些紧密连接的基因是多能细胞的特异性标记[11-13]。的功能DPPA2和DPPA4干细胞研究一直存在争议。Madan等人[14)创建DPPA2/DPPA4双缺陷小鼠胚胎干细胞，并得出结论，这些基因对胚胎干细胞表型是可有可无的，因为它们保持了类似野生型胚胎干细胞系的自我更新和分化能力[14]。然而，最近的一项研究由Du等。[15]表明，siRNA敲除的DPPA2在小鼠胚胎干细胞中导致标记基因的下调OCT4和NANOG，分化加速，增殖减少[15]。为支持上述结论的，其他几个击倒筛选已经鉴定了这些基因在小鼠ES细胞的自我更新，分化和可能的目标至关重要OCT4和SOX2[16，17]。这将是有趣的，确定的功能DPPA2和DPPA4在人类干细胞中，这些干细胞标记物也被证明在不同类型的人类癌症中高度表达[18]。总体而言，数据表明干细胞系窝藏扩增DPPA2和DPPA4可能有选择性的优势，在他们的研究中应该谨慎使用这样的线。

延长培养期间在iPSC系中获取的其他异常是一个285 KB缺失16q23.3跨越外显子4-5CDH13基因(图4 (b))。CDH13，也被称为H-cadherin，参与细胞生长、存活和增殖[19]。Downregulation的CDH13在许多癌症类型已经观察到，并已与增加的肿瘤细胞侵袭性相关联19，20]。同样，过度CDH13在癌细胞中导致增殖减少，增加对凋亡的敏感性，以及肿瘤生长的减少体内[21，22]。此外，经常性的缺失涵盖CDH13在各种癌症包括肺癌，卵巢癌，和成视网膜细胞[已经观察20，23，24]。这一发现与贝克等人的协议。[25他认为在文化适应和发生的致瘤事件之间存在联系体内[25]。染色体异常如这些在长期培养提出了关于特定线路的安全担忧明显在人类干细胞中发现的。

Although we could provide further examples of the utility of using our updated 135 K StemArray to monitor genomic stability, we believe the example provided here clearly demonstrates the benefits for such testing. Although karyotype analysis is still a popular technique to monitor the genetic integrity of stem cells, many stem cell researchers are beginning to realize the importance of using higher resolution methods to detect submicroscopic alterations. Using an Affymetrix 115,000 single-nucleotide polymorphism (SNP) microarray, Maitra et al. were able to identify an amplification of ~2 Mb on chromosome 8 encompassing the c-MYC oncogene in a high passage ESC line [1]。

几组使用各种各样的从低分辨率细菌人工染色体/ P1质粒人工染色体（BAC / PAC）阵列，以高分辨率244,000探针的aCGH阵列[微阵列平台已经确定所获取的复制在20q11.212，五]。这种改变已经在人类ESC和iPSC系中观察到，并通常包括干性基因DNMT3B。含有这种重复细胞系倾向于变得更好，增加存活率，而且比野生型品系分化慢。有趣的是，我们组和其他人也发现扩增跨越该区域不包含DNMT3B基因但包括ID1 [7]。ID1编码螺旋 - 环 - 螺旋蛋白，其与HLH转录因子相互作用，改变它们的DNA结合能力[26]。近日，由马丁斯 - 泰勒等人的一项研究。使用135000点385000探针的微阵列，以确定在iPSC系复发性的拷贝数变异。尽管在iPSC系共同地获取几个小区域被发现，包括1q31.3，2p11.2，和17q21.1，有在这些段没有明显的候选基因与干细胞相关联的功能[6]。

虽然采用的aCGH技术表征干细胞系的这些研究信息，他们都使用非定向标准目录进行芯片。这些微阵列平台通常被设计成瓷砖分辨率依赖于所使用的探针的总数的整个基因组。因此，在目录芯片多数干细胞相关的基因几乎没有任何覆盖，作为结果，跨越这些地区的小偏差通常错过。按照，我们经常在我们的实验室是早先出现正常的核型为或目录的aCGH微阵列分析测试干细胞样品时，检测致病像差。这是需要注意的重要的染色体核型分析，不应该完全不理会，因为它允许平衡易位，这是不可能的aCGH的检测。出于这个原因，我们认为这两种方法应以获得干细胞系的完整基因图谱中。As more data is generated with the 135 K StemArray, we expect to gain new insights into those regions important in stem cell maintenance. In addition, since microarray designs vary wildly in probe placement and gene coverage, it is important for stem cell researchers to agree on specific design parameters to monitor their cell lines if data is to be compared.

4。结论

被用于在延长的时间周期培养的人干细胞系易受染色体畸变。获得这些线的综合基因组谱是必不可少的，因为所获得的结构变化可以影响细胞的增殖能力。通过使用干细胞为中心的微阵列如StemArray，研究人员可以识别，否则将通过核型分析和标准目录阵列错过致病像差。由于ES和iPSC系开始被用于治疗目的，有必要以评估细胞的基因组稳定性的高分辨率聚焦阵列，以确保安全性和有用性。

参考文献

1. A.迈特拉，D. E.烯王，N. Shivapurkar等人，“在培养的人胚胎干细胞的基因组的改变，”自然遗传学第37卷，no。10, 2005年第1099-1103页。视图:出版商的网站|谷歌学术
2. C.吐，I. Mateizel，M. Geens等人，“在人胚胎干细胞经常性染色体异常，”自然生物技术卷。26，没有。12，第1361-1363，2008。视图:出版商的网站|谷歌学术
3. 李建民，“人类诱导多能干细胞与胚胎干细胞之核型异常”，国立台湾大学医学研究所硕士论文。自然生物技术第29卷，no。4, 2011年313-314页。视图:出版商的网站|谷歌学术
4. 胡志刚，“人类诱导多能干细胞的染色体畸变鉴别与分类”，国立中山大学医学研究所硕士论文。细胞干细胞第7卷，no。4，第521-531页，2010。视图:出版商的网站|谷歌学术
5. H.吴，K. J.金，K梅塔等人，“人类胚胎干细胞的拷贝数变异分析，”干细胞卷。26，没有。6，第1484至1489年，2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术
6. K.马丁 - 泰勒，B. S. Nisler，S.M。Taapken等人，“在人经常性拷贝数变异诱导多能干细胞，”自然生物技术第29卷，no。6，第488-491，2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
7. A. M.埃利奥特，K. A.海恩斯坦埃利奥特，和A. Kammesheidt，“使用干细胞的人类干细胞的高分辨率阵列CGH表征聚焦微阵列，”分子生物技术第46卷，no。3，第234-242页，2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术
8. R. R. Rao, J. D. Calhoun, X. Qin, R. Rekaya, J. K. Clark, S. L.查查，“两种人类胚胎干细胞系的转录分析比较”，生物技术和生物工程卷。88，没有。3，第273-286，2004。视图:出版商的网站|谷歌学术
9. 李少良，刘玉华，曾振宁，钟泰良，李泰义，辛格，“台湾五种新的人类胚胎干细胞系的特性及基因表达分析”，干细胞与发育第15卷第2期4，第532-555页，2006。视图:出版商的网站|谷歌学术
10. K. Takahashi, K. Tanabe, M. Ohnuki等，“成人成纤维母细胞诱导多能干细胞的确定因素”，细胞卷。131，没有。5，第861-872，2007。视图:出版商的网站|谷歌学术
11. M.拉马略桑托斯，S.尹，Y.松崎，R. C.马利根，和D. A. Melton的，“‘干性’：胚胎和成体干细胞的转录谱，”科学第298卷，no。2002年，第597-600页。视图:出版商的网站|谷歌学术
12. A. Bortvin，K. Eggan，H. Skaletsky等人，“不完全再活化在从体细胞核克隆小鼠胚胎的Oct4相关基因，”发展卷。130，没有。8，第1673年至1680年，2003。视图:出版商的网站|谷歌学术
13. J. Maldonado-Saldivia, J. Van Den Bergen, M. Krouskos等，“Dppa2和Dppa4是紧密联系的SAP motif基因，局限于多能细胞和生殖系。”干细胞第25卷，no。1，第19-28，2007。视图:出版商的网站|谷歌学术
14. B.马丹，五，马丹，O.韦伯等人，“多能性相关基因DPPA4是可有可无的胚胎干细胞特性和生殖细胞的发育，但必不可少的胚胎，”分子和细胞生物学第29卷，no。11，第3186-3203页，2009。视图:出版商的网站|谷歌学术
15. J.杜，陈吨，十邹B.熊和G鲁“DPPA2击倒诱导分化和小鼠胚胎干细胞的增殖压抑，”生物化学杂志，第147卷，no。2，第265-271页，2010。视图:出版商的网站|谷歌学术
16. N. Ivanova, R. Dobrin, R. Lu等人，“用RNA干扰分析干细胞的自我更新，”自然第442卷，no。7102，第533-538页，2006。视图:出版商的网站|谷歌学术
17. H. Chakravarthy, B. Boer, M. Desler, S. K. Mallanna, T. W. Mckeithan, and A. Rizzino, “Identification of DPPA4 and other genes as putative Sox2:Oct-3/4 target genes using a combination of in silico analysis and transcription-based assays,”细胞生理学杂志，第216卷，no。3，第651-662页，2008。视图:出版商的网站|谷歌学术
18. T.约翰，O. L. Caballero的，S. J. SVOBODOVA等人，“ECSA / DPPA2是与在非小细胞肺癌的癌症 - 睾丸抗原共表达的胚胎癌抗原，”临床癌症研究第14卷，no。11，第3291-3298页，2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术
19. A.五安德烈耶娃和M. A.库图佐夫，“钙粘蛋白13在癌症，”基因、染色体和癌症卷。49，没有。9，第775-790，2010。视图:出版商的网站|谷歌学术
20. M.佐藤，Y.森，A.樱，S.藤村，和A.堀井“的H-钙粘蛋白（CDH13）基因被失活的人肺癌，”人类遗传学第103卷，不。1, 96-101页，1998年。视图:出版商的网站|谷歌学术
21. Z. Y.黄，Y.吴，N.赫德里克和D. H.古特曼，“T钙粘蛋白介导的细胞生长调控涉及ģ₂相位停止，要求p^{21 cip1 / WAF1}表情,“分子和细胞生物学第23卷，no。2，第566-578页，2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术
22. D. W.陈，J. M. F.李，P.C。Y.陈和I. O. L.伍，“基因和人肝细胞癌细胞T-钙粘蛋白的表观遗传失活，”国际癌症杂志卷。123，没有。5，第1043至1052年，2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术
23. M.川上，J.的Staub，W. Cliby，L.哈特曼，D. I.史密斯和V. Shridhar，“上16Q H-钙粘蛋白（CDH13）的受累于在卵巢癌中缺失频繁的区域，”国际肿瘤学杂志第15卷第2期4，第715-720页，1999。视图:谷歌学术
24. S. Gustmann，L.克莱因Hitpass，H.斯蒂芬等人，“损失在视网膜母细胞瘤染色体臂16Q：与循环地缺失区的弥漫性玻璃体播种和细化的关联的确认书”。基因、染色体和癌症卷。50，没有。5，第327-337，2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
25. D. E. C.贝克，N.J。哈里森，E.莫尔特比等人，“适应人类胚胎干细胞和培养的肿瘤发生体内”,自然生物技术第25卷，no。2, 207-215页，2007。视图:出版商的网站|谷歌学术
26. “蛋白质Id:螺旋-环-螺旋DNA结合蛋白的负调控因子”，r.w. Benezra, r.l. Davis, d.l Turner, H. Weintraub，“蛋白质Id:螺旋-环-螺旋DNA结合蛋白的负调控因子”，细胞第61卷，no。1，第49-59页，1990。视图:出版商的网站|谷歌学术

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