SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 431534年 10.1155 / 2012/431534 431534年 研究文章 高分辨率的基因组分析染色体异常在人类使用135 K StemArray干细胞 艾略特 亚伦。 Hohenstein艾略特 克丽丝蒂。 Kammesheidt 安雅 Vemuri Mohan C。 橱柜遗传学 基因组服务和研发部门15阿尔戈号的船员,奥林奇县,92656年 美国 2012年 5 04 2012年 2012年 16 09年 2011年 06 02 2012年 06 02 2012年 2012年 版权©2012亚伦·m·艾略特et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

培养干细胞在较长一段时间会导致获得性染色体畸变。确定拷贝数变异(CNV)的干细胞系至关重要因为基因拷贝数异变会有戏剧性的对基因表达和肿瘤发生的潜在的影响。在这里,我们描述一个改进版本StemArray, stem-cell-focused比较基因组杂交(aCGH)微阵列,其中包含135000调查,覆盖超过270干细胞和癌症相关基因的外显子的水平。我们已经极大地提高了探针间距在整个基因组中值以获得更高的分辨率细胞系的基因档案。为了说明使用StemArray的重要性,我们描述一个karyotypically正常iPSC线我们发现了染色体变异可能影响细胞的细胞表型。确定自适应染色体畸变在干细胞系是至关重要的,如果他们在再生医学使用。

 1。介绍

几项研究已经表明,人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞(万能的ESCs)期间获得基因组异常长时间的文化( 1- - - - - - 3]。这些染色体畸变可能会有戏剧性的对生存的影响,增殖能力和分化潜能的细胞,它可以导致不可靠的实验结果和危害他们的潜能在再生医学中使用。干细胞研究人员所使用的最常见的方法监控的基因组稳定细胞系G-banded核型分析。然而,这种方法只能检测大变化超过5 megabases (Mb),因此,大多数较小的染色体变化是错过了。最近,许多组织已经采用其他方法干细胞特性,包括基因表达分析和基于阵列比较基因组杂交(aCGH)微阵列分析 4- - - - - - 6]。虽然基因表达分析有利于说明真正的细胞的转录状态,这种技术的解析是超过10 Mb ( 4]。aCGH技术可以检测出不平衡在一个典型的结构异常分辨率在100 Kb。研究使用aCGH微阵列检测拷贝数变化的干细胞已经确定了无数subkaryotypic改变期间获得文化适应( 2, 6]。然而,在这些研究中使用的数组不属预定目标的全基因组花砖数组,通常有低覆盖率的单个基因和常规分析相对昂贵。

我们之前开发stem-cell-targeted aCGH微阵列包含44 K探针与探测目标地区的覆盖率( 7]。在这里,我们描述一个更新和改进版本的StemArray目前所使用的各种干细胞实验室的基因组完整性的干细胞系。该数组包含135 K探测覆盖整个基因组平均15 Kb的分辨率。此外,custom-targeted微阵列外显子水平分辨率在270干细胞和癌症相关的基因。12×135 K数组的使用平台,它允许12个样本每张幻灯片,大幅降低了成本的数组并使其竞争力的定价与核型分析。

 2。材料和方法 2.1。iPSC行文化

iPSC线用于研究来自成纤维细胞的使用标准的逆转录病毒转导 OCT4, SOX2, KLF4,和 原癌基因。结果iPSC行培养在人工基底膜(BD生物科学)基板在前面描述的条件 7]。使用Puregene DNA基因组DNA分离净化设备(试剂盒)和质量决定使用一个nd - 1000分光光度计(NanoDrop)。

 2.2。aCGH

stem-cell-focused微阵列是由橱柜遗传学(奥林奇县,CA)使用罗氏罗氏探针集。微阵列包含135000个探针对人类基因组注释组装构建37 (UCSC的hg 19)。探针密度增加超过270个干细胞和癌症相关的基因,在这些地区的平均可用(基因列表要求)。剩下的探针是平铺的整个基因组骨干的平均探针间距15 Kb。验证运行后,只有那些探针与最优性能选择最后阵列设计。根据罗氏罗氏aCGH进行协议(V.8.0)。短暂,500 ng的人类干细胞的DNA和500 ng汇集sex-matched参考DNA热变性(Promega)在98°C 10分钟然后贴上青蓝3随机九聚物和青蓝5随机Exo-Klenow九聚物的片段。标记的DNA被异丙醇沉淀提纯,标记效率决定使用一个nd - 1000分光光度计。基于浓度,20 μg标记的DNA样本和参考连同2 x杂交缓冲,杂交组件,并对齐益生元加在一起,放在135 K StemArray(橱柜遗传学)。微阵列杂交在毛伊岛杂交系统(罗氏罗氏)42°C 72小时。幻灯片是根据协议和扫描洗2 μ关于罗氏MS200高分辨率扫描仪的决议。

 2.3。数据分析

数据提取和规范化使用NimbleScan 2.6软件包(罗氏罗氏)。像差要求,规范化数据集被导入到Nexus拷贝数6.0版本(BioDiscovery)。为GC内容正确,噪音减少系统校正文件是基于基因组位置探测器的设计。异常区域确定使用FASST2意义阈值为1.0 e-6分割算法。畸变过滤器选择使用以下参数:最小数量的调查在该地区4,最小平均绝对日志2比例放大是一个副本。杂合的删除−3和。3,平均日志2比≥1.0代表了一种高复制得失和≤1.1纯合子的副本。

 3所示。结果与讨论

为了识别较小的基因内的变化对干细胞基因重要维护,我们取得了显著改善StemArray设计发布之前( 7]。调查内容增加了从44 K探测135 K探测器,导致整体的骨干决议增加43 Kb到15 Kb,分别。更新后的设计还包括平均超过270 5探针/外显子的干细胞和癌症相关的基因,使单一外显子决议在这些功能重要的地区。例如,激酶BUB1 28个外显子,一个关键的“具备干细胞”基因对维持基因组稳定至关重要,是外显子级别的141调查(数字 1(一)和 1 (b))[ 8, 9]。相比之下,标准目录135 K不属预定目标的数组只包含一个探针 BUB1基因(图 1 (c))。

135 K StemArray增加了探针覆盖在干细胞和癌症相关的基因。(一)具备干细胞基因 BUB1包含141个总调查导致单一外显子决议。(b)外显子满了5探针/外显子启用一个外显子缺失或放大的检测。(c)相比,标准的罗氏目录135 K数组只包含一个探针 BUB1基因,因此没有解决检测该基因的变化。

iPSC线一般用逆转录病毒载体转化成纤维细胞包含派生而来 OCT4, SOX2, KLF4,和 原癌基因( 10]。这些基因提供良好的积极控制iPSC aCGH数据的多个副本这些转基因DNA融入。使用我们之前44 K设计,我们不能检测转基因整合 OCT4由于缺乏高质量的外显子探测器。然而,新的135 K设计,我们能够识别高四个多能性基因的复制放大(数字 2(一个)- - - - - - 2 (d))。

iPSC行通常由转换派生与逆转录病毒载体含成纤维细胞 OCT4, SOX2, KLF4,和 原癌基因。这些重组基因微阵列提供优秀的积极控制多个重复每个转基因应该观察到。更新后的135 K StemArray可以检测多个副本集成iPSC转换因素(一) OCT4,(b) SOX2,(c) KLF4,(d) 原癌基因。

说明描述干细胞系的重要性stem-cell-focused芯片,我们的基因组稳定性监测通道iPSC末行G-banded核型分析和自定义集中135 K StemArray。核型分析显示没有畸变iPSC线(图 3(一个))。这个结果后,大多数干细胞研究人员会考虑这细胞系正常和适合于进一步的研究。然而,高分辨率aCGH分析显示9 subkaryotypic iPSC线的变化范围从1.5 Kb到595 Kb(图 3 (b))。

人类基因组稳定性分析的iPSC线通过核型分析和StemArray。(a)大部分的干细胞研究人员仍描述他们的细胞通过G-banding中期核型分析的分辨率只有5 Mb。用这种方法测试我们的iPSC线没有发现任何畸变。(b) aCGH定制135 K芯片识别4删除和5放大在iPSC样本大小从1.5 Kb到595 Kb。

当进行aCGH iPSC线,建议先确定父母的纤维母细胞的基因组剖面线的细胞。因为所有个体基因组DNA包含拷贝数变化,执行此初始测试将允许一个单独的染色体变化期间获得文化的固有的成纤维细胞。此外,它并不少见为纤维母细胞获得类似于干细胞基因组改变文化。对这些细胞进行aCGH之前一个派生iPSC线是好的做法是不想浪费时间和金钱发展中干细胞系成纤维细胞已经包含有害的畸变。通过这样做,我们可以分类识别变化的7源自4转基因产品的集成,或拷贝数变化出现在父母的纤维母细胞。因此,其余2畸变被iPSC线在收购重组或长时间的文化。

的595 Kb放大3 q13.13包含8基因包括stem-cell-associated DPPA2和 DPPA4基因(图 4(一))。几项研究已经确定这些基因作为特定标记为多能细胞紧密相连( 11- - - - - - 13]。的功能 DPPA2和 DPPA4在干细胞一直存在争议。马丹et al。 14)创建 DPPA2/ DPPA4双缺陷小鼠ES细胞和得出结论,这些基因是可有可无的ES细胞表型,因为他们保持他们的自我更新和分化能力类似于野生型ES线( 14]。然而,最近的一项研究Du et al。 15证明siRNA击倒 DPPA2在小鼠ES细胞的差别导致了对这些基因的标记基因 OCT4和 NANOG加速分化,减少扩散( 15]。支持这些发现,其他几个可拆卸的屏幕已经确定这些基因在小鼠ES细胞自我更新一样重要,分化和可能的目标 OCT4和 SOX2( 16, 17]。这将是有趣的,以确定的功能 DPPA2和 DPPA4在人类干细胞,这些干细胞标记也被证明是高度在不同类型的人类癌症中表达的 18]。总的来说,数据显示干细胞线窝藏放大 DPPA2和 DPPA4可能有选择性的优势,应该谨慎使用这些线在他们的研究。

stem-cell-targeted 135 K StemArray可以检测诱发畸变在iPSC行影响细胞的存活和增殖能力。检测两个收购stem-cell-associated染色体异常和癌症相关的基因在iPSC线。(a)一个595 Kb放大横跨stem-cell-related DPPA2和DPPA4基因,和(b) 285 Kb删除覆盖的snps和CDH13基因外显子4 - 5相关的癌症。

其他异常收购在iPSC线扩展文化是一个16岁285 Kb删除q23.3跨越外显子4 - 5的 CDH13基因(图 4 (b))。 CDH13也称为H-cadherin,涉及细胞生长,生存和增殖( 19]。Downregulation的 CDH13已经观察到在许多癌症类型,增加肿瘤细胞侵犯( 19, 20.]。同样,过度的 CDH13在减少扩散,癌细胞的结果对细胞凋亡的敏感性增加,减少肿瘤的生长 在活的有机体内( 21, 22]。此外,删除包括复发 CDH13曾被观察到在各种癌症包括肺癌、卵巢癌、视网膜母细胞瘤( 20., 23, 24]。这一发现与贝克在协议et al。 25)建议有一个发生的文化适应和肿瘤发生的事件之间的联系 在活的有机体内( 25]。这些染色体异常中发现人类干细胞在长期文化提高明显的特定线路安全的担忧。

虽然我们可以提供进一步的例子使用我们的工具更新135 K StemArray监控基因组稳定,我们认为这里提供的示例清晰地展示了这种测试的好处。虽然核型分析仍然是一个受欢迎的技术监测干细胞的遗传完整性,许多干细胞研究人员开始意识到使用高分辨率的方法来检测的重要性亚微观的变化。使用一个Affymetrix 115000单核苷酸多态性(SNP)微阵列,Maitra等人能够识别一个放大~ 2 Mb的8号染色体上包括原癌基因致癌基因在高通道ESC线( 1]。

几组确定了获得重复20 q11.21使用各种各样的微阵列平台从低分辨率的细菌人工染色体/ P1-plasmid人工染色体(BAC / PAC)阵列244000高分辨率探头aCGH数组( 2, 5]。这种改变已经观察到人类ESC和iPSC线条和种能阻碍DNMT3B通常包括具备干细胞基因。细胞系包含这种重复倾向于更好的生长,增加了生存和分化低于野生型线。有趣的是,我们组和其他人也发现放大种能阻碍DNMT3B跨越这个区域不包含基因,但包括ID1 [ 7]。ID1编码helix-loop-helix蛋白质相互作用通过转录因子,改变他们的dna结合蛋白的能力 26]。最近,一项由Martins-Taylor等人使用135000年和385000年调查微阵列识别重复拷贝数变化在iPSC线。尽管几个小区域通常在iPSC行被发现包括1 q31.3, 2 p11.2,和17 q21.1,没有明显的候选基因在这些领域与相关函数在干细胞( 6]。

尽管这些研究利用aCGH技术描述干细胞系信息,他们都使用不属预定目标的标准目录进行微阵列。这些微阵列平台通常用于瓷砖整个基因组的分辨率取决于探测器使用的总数。因此,大多数stem-cell-related目录微阵列的基因几乎没有被覆盖,和,因此,小畸变生成这些地区通常是错过了。根据,我们经常发现诱发畸变检测干细胞样本在我们实验室,曾出现正常核型或目录aCGH微阵列分析。重要的是要注意,核型分析完全不应该被忽视,因为它允许检测平衡易位,与aCGH这是不可能的。出于这个原因,我们认为这两种方法应该使用为了获得一个完整的基因的干细胞系。随着越来越多的数据生成的135 K StemArray,我们希望获得新的见解在干细胞维持这些地区重要。此外,由于微阵列设计大相径庭探针位置和基因的报道,是很重要的干细胞研究人员同意在特定的设计参数来监测他们的细胞系如果数据比较。

 4所示。结论

人类干细胞系,培养一段时间容易染色体畸变。获得一个全面的基因组特征这些线是至关重要的,因为获得结构的变化可以影响细胞的增殖能力。通过使用一个stem-cell-focused StemArray等微阵列,研究人员可以确定诱发畸变原本会被忽略的核型分析和标准目录数组。ES和iPSC行开始被用于治疗目的有必要评估细胞基因组稳定性和高分辨率的集中数组来确保安全性和实用性。

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