人类多能干细胞来源的血液成分的潜在临床应用

摘要

人类胚胎干细胞（hESC）和诱导多能干细胞（iPS细胞）的而不会失去多能性和分化理论上无限分裂成身体中的任何细胞类型的能力，使它们成为大型再生医学用途极具吸引力的细胞来源。在血液介入目前使用的成体干细胞衍生产品设置了一个重要的先例，并提供了指南为开发基于人类胚胎干细胞/ iPSC细胞疗法的血液系统。在这篇综述中，我们强调需要输血或这些细胞的刺激，和用于人类胚胎干细胞/ iPSC的衍生物的电位以作为功能性的替代的血液成熟细胞的生物学功能，临床病症。许多研究者已经能够区分人类胚胎干细胞和/或iPS细胞转化为具体的成熟血细胞类型。例如，人类胚胎干细胞衍生的红血细胞和血小板在任务，例如分别氧递送和血液凝固，功能可以是能够作为替代品在紧急情况他们的供体来源的对应物。人类胚胎干细胞衍生的树突细胞在抗原呈递功能，并且可以被用来作为现成的，货架疫苗疗法刺激针对癌细胞的抗原特异性免疫应答。然而，在体外用于产生这些细胞的分化系统需要进一步优化，才能将hESC/ ipsc衍生的血液成分用于临床。

1.介绍

人类胚胎干细胞(hESCs)被吹捧为再生医学的未来，因为它们具有分化成人体任何细胞类型的潜力。与成人或脐带血干细胞不同，造血干细胞在培养过程中能够无限增殖而不会丧失其多能性，这使其成为一种极具吸引力的细胞来源，可用于大规模生产多种治疗细胞类型[1]。人类诱导多能干细胞(iPSCs)的出现为再生医学领域增加了另一个维度，因为它可以生产针对患者的治疗，从而减少HLA不匹配和免疫不相容的问题[2]。虽然各有优缺点，但hESCs和iPSCs是两种多能细胞来源，在治疗神经系统疾病、修复或替换受损组织，以及如本文所述，产生可转运血液成分方面具有深远的临床潜力。

造血干细胞(HSCs)位于骨髓内，通常产生并负责补充成人血液系统内的所有成熟细胞[3.]。造血干细胞首先分化为多能祖细胞(MPPs)，然后进一步分化为普通髓系祖细胞(CMPs)和普通淋巴祖细胞(CLPs)。CMPs最终生成红细胞、巨核细胞/血小板、单核细胞和粒细胞，而CLPs则生成自然杀伤细胞、T细胞和B细胞(图)1)。研究人员已经能够获得高度富集的种群在体外通过向特定的造血谱系分化hESCs和/或iPSCs生成血液成分。血液系统中的每一种成熟细胞类型都可用于不同的临床目的，本文将重点研究在这些研究中，hESCs/iPSCs作为原代细胞替代品的能力。

2.红细胞

红细胞是外周血中最丰富的细胞类型，浓度为5×10¹²细胞/升(L) [4]，约占总血容量的40%-45%(图)2)[4,5]。尽管身体看似充裕能力生产红细胞，约16万台的红细胞被收集并每年输到患者体内[6，包括贫血(红细胞计数低)或因创伤而大量失血的患者。在无法进行血型分析的紧急情况下，(O)型rh阴性"通用"红细胞是非常可取的，当诊所遇到供应短缺时，通常首先耗尽红细胞。从hESCs/iPSCs中提取(O) rh阴性红细胞显然为缓解捐赠红细胞的持续短缺提供了一个有吸引力的选择。

在成人骨髓明确红细胞生成是通过细胞因子，促红细胞生成素（EPO）调节的多步骤过程。它开始时的HSC衍生的CMP通过巨核细胞祖红细胞（MEP）阶段和提交到红血球谱系。所述pronormoblast（也称为proerythroblast或rubriblast）标记分化的第一阶段和外观随后是早期，中期和晚期幼红细胞（红细胞）的阶段，在该时间细胞核被排出和小区成为网织红细胞。网织红细胞退出骨髓，成为完全的循环内到期的红细胞，血红蛋白表达的成年形式（α2β将氧气输送到身体的各个组织。在被巨噬细胞吞噬并循环使用之前，它们循环了大约120天(图)1)[5,7]。

红细胞可以推导在体外从各种主要的干细胞来源，包括脐带血（CB），外周血（PB）和骨髓（BM）[8,9]。尽管它们很有用，这些原代细胞仍然是供者有限的血液替代品来源。人类胚胎干细胞(hESCs)是产生红细胞的另一种干细胞来源在体外膨胀率远远超过BM, PB，甚至CB。两个不同的在体外分化方法已广泛用于从胚胎体中产生红细胞:(1)胚胎体形成，在形成单细胞悬浮液之前，胚胎体首先聚集并形成三维球体;(2)将胚胎体在动物基质饲养细胞层上共培养。例如，Chang等人。成功地利用EB方法从hESCs中生成红细胞。培养30-56天后，红细胞仍未摘除，主要表达于胚胎ε和胎儿γ-是globins，而不是理想的成年人β球蛋白(10]。在另一项研究中，Olivier等。使用连续基质共培养步骤产生hesc来源的红细胞。在第一步中,FH-B-hTERT基质(人类胎儿肝细胞永生化与端粒酶逆转录酶的催化亚基)被用来诱导的初始分化为其对造血细胞(小鼠BM间质细胞)5级血统而被用来进一步诱发他们对红细胞分化。尽管他们采用了谨慎的多步骤方法，而且产量很高(0.5 ~ 5 * 10)⁷细胞），将得到的细胞必须由EB方法产生的那些类似的问题;他们主要表达胚胎ε和胎儿γ珠蛋白亚型，只有有限数量的成年人β-可检出红蛋白[11]。

我们最近开发的“成血管细胞”系统为上述两种方法提供了一种临床适应性的替代方法，并被证明可用于从hESCs中大规模生成红细胞[12- - - - - -14]。成血细胞(HBs)是造血和内皮细胞谱系的共同前体，因此在图中所示的造血层次结构中，它略位于造血干细胞的上游1。我们发现，在无血清的甲基纤维素培养基中，hESCs可以分化为HBs。在进一步分化之前，通过一个中间的HB阶段可以使多能细胞大量扩张，并促进下游成熟细胞群的大规模生产。我们生成了大约10个¹⁰到10¹¹每使用该系统[人类胚胎干细胞的6孔板红系细胞14，比Olivier等人报道的方法效率高出1000倍以上。(11]。扩展在体外在OP9基质细胞上的培养促进了高达65%的细胞去核，并增加了成人的表达β珠蛋白，允许它在发生了对细胞的15％。尽管这样的改善，大部分细胞仍然发现胎儿表达和胚胎珠蛋白链。

包括我们自己的研究小组在内的几个研究小组已经证明，人类诱导多能干细胞可用于生成红细胞[15- - - - - -18];然而，我们的研究也揭示了病毒介导的诱导多能干细胞含有内在的分子和细胞异常，这可能会阻碍其临床应用[18]。最近，一种完全不需要多能干细胞的RBC生成方法被描述为[19]。萨博等。使用异位Oct4直接转分化成纤维细胞至CD45⁺造血祖细胞，并通过将它们暴露于EPO能够产生表达高水平的成人红血球谱系细胞β-红蛋白和低水平的胎儿ε-红蛋白，并能去核[19]。需要进一步的研究来确定哪种起始细胞来源，如hESCs、iPSCs或oct4转导成纤维细胞，将会对发展最有用在体外红细胞生成的替代品。

3.血小板

血小板(血小板)在止血(在血管损伤部位止血)和血管修复中起着重要作用。其浓度约为3×10¹¹/L使它们成为外周血中第二丰富的细胞类型，仅次于红细胞(图)2)[4]。与红细胞相比，血小板的寿命较短，在循环中只持续约9天[5]。严重的血小板减少症(血小板计数<5×10)¹⁰如果血小板生成有某种缺陷(如肝功能衰竭或白血病患者)，或者血小板被破坏(如化疗患者)，则可能发生[20]。危及生命的血小板减少症患者可输注血小板，但由于需求量大、保质期短，可输注血小板经常供不应求[20]。供者依赖计划的不足使得科学家和临床医生对开发功能性可转运血小板的替代来源越来越感兴趣。

由于没有细胞核或DNA，血小板实际上是细胞碎片，是由大的、多核的巨核细胞(MK)前体剪切和破碎而产生的。MKs出现在骨髓中，与红细胞有共同的前体，MEP(图)1)。MEPs对巨核细胞谱系的逐步参与主要由血小板生成素(TPO)调控，并涉及细胞表面标记CD41表达的增加(αIIb /β3整合素或糖蛋白GPIIb/IIIa)和GPIb/V/IX表面复合物的成分。巨核生成还包括细胞大小的大幅增加(50到100)μ由血小板相关蛋白如血管性血友病因子(vWF)在细胞质中积累引起的[21]和核多倍体化，导致DNA含量累积高达128N [21,22]。多倍体上称为“血小板”的细胞过程开始出现，它们最终的分裂和释放导致血小板的产生(图)1)。MKs(血小板生成)产生血小板的机制尚不完全清楚，但似乎非常有效在活的有机体内，每MK可产生2000 - 11000个血小板[23]。

在体外巨核细胞和血小板生成最早是在1995年使用CD34报道⁺造血干细胞作为启动细胞来源[24等多项研究证实了从PB、BM、CB中分离的造血干/祖细胞可以通过标准细胞培养方法产生MKs和功能性血小板[[21]]。25- - - - - -27]。在试图概括的BM微环境，提供更多的自然生长条件下，新型三维培养系统最近被开发[28]。在其中一个系统中，研究人员使用手术级聚酯织物在井内创建三维矩阵。在改进后的系统中，该研究小组使用反向胶体晶体和聚丙烯酰胺水凝胶在三维生物反应器中创建了一个高孔、高互联的球形腔网络。CD34⁺在这两种三维系统中，细胞被发现扩展并分化为MKs和血小板。尽管生物工程取得了进展，但效果有限在体外主CD34的扩展能力⁺这些细胞无法取代捐赠作为血小板的主要来源。因此，hESCs可能是一个更好的开始大规模细胞群在体外生产。

第一个研究报告在体外2006年发表了利用OP9共培养方法从hESCs中生产MKs的研究[29]，但所产生的MKS很少产生的任何proplatelet状结构。此后，Takayama等。报道了从hESCs和最近从iPSCs中成功生成MKs和功能性血小板[三十,31]。他们将hESCs或iPSCs在C3H10T1/2基质细胞上共培养14-15天，精选含造血祖细胞的囊状结构，将单细胞悬浮液在含TPO、干细胞因子(SCF)和肝素的新鲜基质上复制9-23天。通过电子显微术检测，从这些培养物中产生了多倍体CD41a/CD42b双阳性MKs，并产生了含有特征形态的血小板[三十]。各种各样的在体外试验证实了血小板的功能，并使用了激光诱导的血管损伤模型来显示ipsc衍生的血小板很容易并入新开发的血栓中在活的有机体内(31]。

在这些研究中，血清和动物饲养层的使用阻碍了这种方法适应临床使用的能力，人工采摘ES囊也增加了相当多的时间和劳动过程。其他的方法将可能被开发用于临床级和大规模生产。为此，我们已经能够使用上述用于RBC的HB系统作为生成MKs的替代、无血清和无费钱方法(图)3.)[32]。然而，与Takayama的研究相似，我们也发现MKs有效生成血小板仍然需要传统的基质共培养。我们的hesc来源的血小板表现出粘附并在纤维蛋白原、vWF和I型胶原涂层表面扩散的能力，在生理激动剂刺激下聚集，并收缩纤维蛋白凝块在体外。激光诱发血栓模型也证实了我们的hesc血小板能够促进血栓的形成在活的有机体内(32]。如果在体外分化的hESCs将成为可转运血小板的主要来源，未来的工作将需要确定一种方法来消除MK到血小板过程中对间质的需要，并提高血小板转运效率在体外血栓形成。

4.白细胞:树突细胞

白细胞(WBCs或白细胞)仅占外周血细胞的1%左右[4)(图2)，但它们在保护人体不受病毒、细菌和癌细胞滋长的侵袭方面，却扮演着极其重要的角色。树突状细胞(dc)横跨先天免疫和适应性免疫的界面，是人体三种主要的专业抗原呈递细胞(APCs)之一。树突状细胞可刺激t细胞对多种疾病相关抗原的特异性反应，因此可用于开发基于疫苗的治疗方法[33,34]。

人的DCs起源于HSCs，可通过髓系和淋巴系分化途径发展[35]。髓系(m) DCs由粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP-)来源的单核细胞产生(图)1)。它们分泌白细胞介素(IL)12来回应激活刺激，并表达toll样受体TLR2和TLR4。淋巴系来源的dc (plasmacytoid (p) DCs)与mDCs具有相似的功能特征，但分泌干扰素(IFN)α，表达TLR7和9 [35]。未成熟的树突状细胞可以存活数周，它们可以在皮肤、鼻子、肺、肠道或外周血中取样，并使用TLRs对各种类型的病原体进行模式识别。一旦与合适的抗原接触，未成熟的树突状细胞就会被激活并经历成熟过程，这包括将抗原蛋白水解并使用MHC I或II类分子将其片段呈现在树突状细胞表面。它还涉及t细胞共刺激受体(如CD80 (B7.1)、CD86 (B7.2))表达的上调[36，及CD40 [37]。成熟的树突细胞还会上调CCR7的表达，CCR7是一种趋化受体，可以帮助树突细胞通过血流迁移到脾脏或淋巴系统[38]。完全成熟的树突细胞只能存活几天，这是足够它们到达淋巴结并激活辅助T细胞、杀伤T细胞和B细胞的时间。

20世纪90年代末进行的创新工作为DCs的临床应用提供了概念证明，研究表明离体产生的dc(来自异种源或自体BM或PB来源)注射到患者体内后可装载黑素瘤特异性抗原，刺激抗肿瘤免疫应答[39,40]。此后，其他研究表明，暴露于被杀死的肿瘤细胞中的DCs也能诱发特异性的细胞毒性CD8⁺t细胞反应(41]。鉴于其强大的免疫刺激作用，目前正在进行200多项临床试验，以探讨以dc为基础的疫苗对黑色素瘤、多发性骨髓瘤、I型糖尿病、艾滋病毒和丙型肝炎病毒感染(http://www.clinicaltrials.gov/)。

2010年4月，本项研究（Silpuleucil T，Dendreon公司通过开发）成为了第一个基于DC疫苗疗法，以获得完整的FDA批准，是治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的治疗选择[42]。该疫苗利用前列腺酸磷酸酶与细胞因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合后的抗原肽高效传递和摄取离体培养的自体DCs [43]。鉴于像Provenge这样的特制的自体或异体dc疫苗的高成本[44]，人类胚胎干细胞可以用作抗原致敏的DC的推导和大规模制造成本效益的替代细胞来源。

Slukvin等。是第一批从hESCs中产生功能性DCs的人群，他们使用了从小鼠ESC系统改编的3步分化方案[45]。它们共同培养上OP9基质细胞的hESC为9-10天，以促进初始造血分化，然后转移到细胞组成的悬浮培养αMEM, 10%胎牛血清，GM-CSF，持续8-10天。活细胞纯化后在含有GM-CSF + IL4的培养基中再培养7-9天，在此期间出现人DCs。另外两个研究小组也报告了利用EB的形成产生hesc衍生的骨髓系DCs，并且是通过无血清或无血清和无输注的方式实现的[46,47]。这些来源于hesc的DC具有特征性的大偏心核、多针状树突，并不同程度表达DC表面标记CD11c、CD40、CD45、CD86、HLA I类和HLA II类。在一项研究中，产率为每hESC 2 DCs [46]到3-5个dc / hESCs [47]。尽管与单核细胞来源的树突状细胞相比存在细微差异，但在检测IL12p70分泌、趋化性、抗原摄取和蛋白水解、诱导t细胞增殖和刺激抗原特异性细胞毒性CD8的分析中，hesc来源的树突状细胞在成熟后似乎具有功能⁺t细胞反应(46,47]。

在开发基于hesc的DC疫苗时，需要仔细选择成熟鸡尾酒，以获得预期的反应在活的有机体内。例如，前列腺素E2已被证明有助于DC趋化，但它抑制了DC分泌IL12p70的能力[48,49]。这种区别将对基于dc的治疗产生重要的影响在活的有机体内因为IL12p70对驱动CD4至关重要⁺T细胞走向促炎、抗菌Th1反应，而远离相反的抗炎Th2反应。来自于hesc的DC疫苗的临床应用也将取决于它们在临床前动物研究中的表现。在活的有机体内，目前尚未有关于hESC-DCs的临床前试验的报道，但用抗原负载的自体或异体DCs进行的研究应该可以提供有用的指导。

5.自然杀伤细胞

人天然杀伤（NK）细胞是从HSC衍生的CLPs产生（图1），并有〜的半衰期在PB 7-10天[50]。其为1×10浓度⁸细胞/L约占白细胞的1-2%，或PB中所有细胞的0.01-0.02% [4]。NK细胞属于天然免疫系统，对各种微生物感染产生快速、非特异性反应，有助于肿瘤细胞的检测和清除[50]。如果遇到MHC I表达不足的细胞，NK细胞会产生保护反应，然而，为了防止不适当的细胞杀伤，测量MHC I表达的过程相当复杂。简而言之，如果一个细胞缺乏足够的自我mhc I分子，各种激活和抑制信号的相互作用有助于NK细胞产生适当的保护反应，无论是细胞因子释放、自然细胞毒性还是抗体依赖性细胞毒性(anti- dependent cellular cytotoxicity, ADCC) [51]。

NK细胞的两个主要群体，未成熟和成熟，在功能上是截然不同的，可以通过各种细胞表面标记的表达来区分。未成熟的NK细胞具有较高的细胞因子生产能力和较低的细胞毒性，通常为CD56^明亮的/ CD16^低/吉珥^低/ CD94^高(52]。未成熟的NK细胞分泌细胞因子激活巨噬细胞，并有助于引发广泛的免疫反应。而成熟的NK细胞则表现出低细胞因子生产能力和高溶细胞能力，且为CD56^昏暗的/ CD16^高/吉珥^高/ CD94^低(52]。它们的溶细胞功能依赖于颗粒内部颗粒中的颗粒酶和穿孔素酶的释放，而这些酶又负责裂解和诱导靶细胞凋亡。NK细胞从未成熟到成熟的转变被认为发生在次级淋巴组织中，但PB中绝大多数NK细胞是成熟的CD56^昏暗的CD16^高细胞溶解的类型(53]。

内源性NK细胞可能无法检测和清除癌细胞在活的有机体内。在许多患者中，NK细胞活性可能降低或有缺陷，而在其他患者中，癌细胞已经发展出逃避NK细胞检测的机制(在[51])。尽管如此，罗森博格和他的同事在20世纪80年代发表的研究表明，注入自体淋巴细胞激活杀手(LAK)细胞会受到刺激离体IL2能够缩小各种不同类型癌症患者的肿瘤[54,55]。这一开创性的工作刺激了利用NK细胞在临床上相当大的兴趣和各种用于利用其细胞毒性功能的方法。虽然这些研究的细节在别处审查[51),离体刺激和注入自体或异体NK细胞已被用于许多不同类型癌症的实验治疗，而临床方案的改变增加了这种治疗方法的成功。目前，针对白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、胶质瘤、肾细胞癌以及乳腺癌、胰腺癌、肺癌、头颈部癌(http://www.clinicaltrials.gov/)。这些试验的结果将有助于建立最有效的战略，利用NK免疫治疗潜力。这些过继转移的最大障碍办法迄今看来是从外周血单核或LAK细胞集合[获得NK细胞的足够数量的难度51]。hESCs的使用在体外NK细胞的产生可能提供更大的合适效应细胞池，从而能够克服这一障碍。

一般来说，已证明hESCs向淋巴系细胞分化比向髓系细胞分化更困难。只有明尼苏达大学的Dan Kaufman领导的一个研究小组能够成功地从hESCs中复制获得功能性NK细胞[56,57]。他们优化的2步分化程序是将未分化的hESCs在M210-B4(一种表达层粘连蛋白和IV型胶原的小鼠基质细胞系)上共培养17-20天。CD34⁺/ CD45⁺然后从培养物中分离出双阳性细胞，并在含有SCF、flt3-配体(FL)、IL7和IL15的培养基中转移到AFT024基质上。高度富集的CD45同质群体⁺CD56⁺CD94⁺NK细胞通常在30-35天后出现。在体外实验表明，以这种方式产生的hesc来源的NK细胞能够分泌IFNγ对IL12/IL18的刺激也显示出对K562红白血病细胞的天然细胞毒性，对ADCC对Raji细胞的天然细胞毒性[56]。这些hESC-NK细胞随后被证明对其他类型的癌细胞具有天然的细胞毒性在活的有机体内异种移植小鼠模型的抗肿瘤活性[57]。最近，这一研究小组成功地从诱导多能干细胞中产生功能性NK细胞，并显示它们具有抗艾滋病毒活性[58]。尽管有这些令人兴奋的发现，但由于需要两种不同类型的基质共培养，以及需要分离罕见的CD34/CD45双阳性细胞，限制了该方法用于大规模、低成本、临床级生产hESC/ ipsc生成的NK细胞。在这种基于hESC/ ipsc的NK疗法进入临床试验之前，还需要进行进一步的优化。

6.白细胞:T细胞

作为适应性免疫系统的部分，T细胞发育中的胸腺和可以被刺激以发动针对多种病原体细胞和癌细胞的抗原特异性免疫应答。它们存在于〜1×10的浓度⁹外周血细胞/L，代表约10%的白细胞或0.1%的循环血细胞(图)2)[4]。虽然关于T细胞生物学的详细背景超出了本文的范围，但根据功能和细胞表面标记物的表达，T细胞通常可以分为五种主要亚型:效应CD4或记忆辅助CD4⁺T细胞(59];效应或记忆细胞毒性CD8⁺T细胞(59];免疫抑制调节性T细胞(Tregs) [60];皮肤、内脏或肺部γδT细胞(61];cd1d受限的罕见NK T细胞[62]。

临床对T细胞作为治疗药物的兴趣很大程度上是围绕着分离和离体特异性抗原应答辅助体和/或细胞毒性t细胞亚群的扩大，以产生高度特异性免疫反应一旦注入病人。CD4⁺辅助性T细胞会分泌特定的细胞因子来响应MHC ii呈递的抗原，而CD8⁺细胞毒性T细胞会对MHC i呈递的抗原作出反应，并卸载细胞毒性酶诱导表达抗原的靶细胞凋亡。过继t细胞疗法(ACT)于1988年首次被描述为黑色素瘤的一种治疗选择[63，并且许多改进已经并且仍在进行，以提高ACT协议的效用、安全性和有效性[64- - - - - -66]。例如，数百个肿瘤相关抗原肽已被克隆[66并使肽脉冲APCs刺激T细胞成为可能在体外在使用之前。这种方法已经成功地用于制造抗原特异性T细胞，用于治疗黑色素瘤、HIV、白血病和其他疾病[67- - - - - -69]。另一个正在发展的改进ACT协议的策略包括使用基因工程在自体t细胞群中克隆和人工表达抗原特异性t细胞受体(TCRs)。这种方法已经成功地用于治疗黑色素瘤[70,71，并正在开发用于艾滋病毒和白血病的治疗[72,73]。

开发适应性免疫系统的风险和复杂性使得以t细胞为基础的治疗非常昂贵，而且在很大程度上仍处于实验阶段。然而，如上例所示，ACT的力量大到足以保证能够精简治疗或使其更具成本效益的努力。为此，几个研究小组已经设计出了将T细胞与多能人类细胞源区分开来的方案。

从各种小鼠研究的结果推断，使用固定的Notch配体，如delta-1 (DL1)，已被证明是一种有效的人类多能细胞淋巴细胞分化策略[74- - - - - -76]。例如，Awong等人。显示表达dl1的OP9基质允许CD34⁺CB细胞向CD7分化⁺t细胞的祖细胞。这些前t细胞可以移植到NOD/SCID/的胸腺中γc^-/-(NSG)小鼠，并继续向下分化t细胞谱系[75]。

第一个关于hESCs可分化为T细胞的报告发表于2006年[77]。Galić等人对常规OP9细胞培养H1为7 - 14天,于是CD34⁺分离细胞并注射到SCID或RAG2内的Thy/Liv植入物中^−−/老鼠。在类似胸腺的Thy/Liv环境中，发现hesc来源的细胞分化为T细胞[77]。Galić等人转向一个EB-based方法三年后,改善你的/ Liv-generated hESC-derived T细胞(78]。CD4⁺/ CD8⁺4周内开始出现双阳性细胞，而CD4细胞开始出现双阳性细胞⁺单阳性和CD8⁺在经受TCR重排单阳性细胞出现8周[内78]。

2009年发表的另一项研究表明，成熟的T细胞可以完全使用a从hESCs中获得在体外文化系统[79]。蒂默曼等。在OP9细胞上共培养H1 hESCsαMEM + 20%胎牛血清12天，观察“造血区”的出现，这似乎与巨核细胞生成的ES囊相似。他们孤立CD34^嗨CD43^罗在存在FL、SCF和IL7的情况下，将这些区域的细胞复制到表达dl1的OP9细胞上5 - 7周。CD45⁺CD7⁺CD117⁺cyCD3e⁺T细胞的祖细胞出现在6天内，而CD4⁺/ CD8⁺双阳性细胞从较大CD3E出现⁺CD5⁺14天内的人口。30天后，CD3⁺经过TCR重排的T细胞在检测其对植物血凝素和IFN反应的增殖时被发现具有功能γ生产 [79]。总的来说，这些t细胞生成的分化方案有潜力被进一步开发用于iPSCs，并且有希望有一天应用于人类免疫治疗的ACT方案。

7.其他白细胞:粒细胞和B细胞

其他白细胞群，包括粒细胞(中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞)和B细胞，可能作为基于hesc的治疗有用;然而，对这些细胞群的兴趣和/或发展没有对其他血细胞成分那么大。在体外理论上已经证实了hESCs沿b细胞谱系的分化[80，但仍需要详细的工作，以优化分化条件和功能特征的结果细胞。对于粒细胞，将基于hesc的治疗带到临床的费用和困难可能是不必要的。例如，中性粒细胞是一种趋化吞噬细胞，它会迁移到感染部位，提供保护，抵抗细菌。中性粒细胞减少(中性粒细胞计数少于5×10)⁸细胞/L)可使受感染的个体面临更高的感染风险。尽管30多年前同种异体中性粒细胞输血被证明可以减轻感染的风险，但抗生素、抗病毒药物和/或抗真菌疗法的使用已经在很大程度上取代了它们[81]。

尽管如此，2009年发表的两项研究描述了使用基于ebss的方法来生成CD11b⁺来自KhES hESCs的中性粒细胞[82,83]。这些来自于hesc的中性粒细胞表达了不同水平的其他中性粒细胞表面标记物，并且比那些来自外周血的中性粒细胞略大[83]。尽管有这些细微的差别，他们被发现有三个是有功能的在体外评价趋化性、吞噬作用和活性氧产物的测定[82,83]。一项研究还表明在活的有机体内hesc衍生中性粒细胞对IL1的趋化作用β在气袋炎性小鼠模型中表达[82]。是否将开发出嗜中性粒细胞(或其他类型的粒细胞)作为输血试剂还有待确定，但是在体外它们产生的分化系统可能有助于描述造血分化所需的细胞因子，药物筛选，或阐明某些遗传疾病的分子细节。

8.结束语及观点

外周血成分有许多不同的治疗应用，hESCs作为可再生的细胞源已经引起了人们的广泛关注。从用于输血治疗细胞减少的红细胞和血小板到用于免疫疗法治疗癌症和艾滋病毒的DCs、NK细胞和T细胞，hESCs可能在大量供应和成本效益的方式下有助于产生这些成熟细胞类型(表)1)。此外，诱导多能干细胞还可以从患者自身的细胞中产生成熟的细胞类型，从而减少困扰细胞疗法的免疫障碍。

再生医学的领域是仍处于起步阶段，但一些基于人类胚胎干细胞疗法开始在临床试验中进行测试。截至2010年年底，两个基于人类胚胎干细胞疗法已被美国FDA批准新药研究（IND）的状态和刚刚最近进入（或即将进入）I / II期临床试验。Geron公司的GRNOPC1，由hESC衍生的少突胶质细胞祖细胞的，被在临床试验中测试用于治疗亚急性胸脊髓损伤（http://www.geron.com/)。先进细胞技术公司的视网膜色素上皮细胞(RPE) (http://www.advancedcell.com/)将很快在两个临床试验中进行测试。第一个试验是治疗晚期Stargardt的黄斑营养不良，这是一种青少年黄斑变性，经常导致失明，第二个试验是治疗干性年龄相关性黄斑变性。这些疗法在早期临床试验中的安全性和有效性可能会对其他类型的基于hesc的疗法的发展以及FDA使用任何hesc衍生物治疗人类疾病的政策产生重大影响。

参考

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