通过调节GATA转录分化潜能的维修在小鼠胚胎干细胞因子

抽象

背景。通过聚集和/或维甲酸(RA)处理可在体外诱导小鼠胚胎干细胞分化。体外分化的主要谱系是胚外原始内胚层。Dab2、层粘连蛋白、GATA4、GATA5和GATA6在胚胎原始内胚层中表达，并在其谱系承诺中发挥重要作用。结果. 我们发现在没有GATA4或GATA5的情况下，RA诱导的ES细胞原始内胚层分化降低。GATA4（−/−）ES细胞表达较高水平的GATA5、GATA6和肝细胞核因子4α标记物。GATA5（−/−）ES细胞表达较高水平的甲胎蛋白标志物早期肝脏发育。GATA6（−/−）ES细胞表达更高水平的GATA5以及中胚层和心肌细胞标记物，即胶原IIIα-1和原肌球蛋白1α。因此，GATA6的缺失排除了内胚层分化，但促进了中胚层谱系的形成。结论。GATA4、GATA5和GATA6各传递一种独特的基因表达模式，并影响ES细胞的分化。我们发现，通过调节GATA因子，胚胎干细胞可以避免向原始内胚层分化，并在体外采用独特的细胞系。这一发现提供了一种从胚胎干细胞中产生理想细胞类型的潜在方法，可用于再生细胞治疗。

1.背景

从preimplanting胚胎的内细胞团衍生的胚胎干（ES）细胞可在体外维持和培养扩增[1,2]。这些多能细胞可以潜在地分化并产生生物体的每组织[3.,4]。使用人ES细胞在医学应用用于组织工程的含义是巨大和探索来操纵它们分化成所期望细胞类型正在进行[4,5]。

维甲酸可诱导胚胎干细胞在体外分化[6- - - - - -8]和/或通过聚集[9,10，遗传和细胞外因素都会影响这些过程[11- - - - - -14]。体外分化的主要途径是胚外内胚层谱系，在体内的内细胞团的细胞的分化，以形成原始内胚层[指模拟8,10,11]。该GATA转录因子在preimplanting囊胚，属于表达了对组中胚层发展中发挥关键作用的基因[12- - - - - -19]。缺失gata4的ES细胞在聚集时不能自发地向内胚层谱系分化，但细胞会对维甲酸产生反应，从而进行分化[20,21]。GATA6为内胚层发育所必需并且还需要用于ES细胞的体外内胚层谱系分化[22,23]. 在ES细胞中转染/表达GATA4或GATA6足以诱导内皮细胞分化[24,25，该分析提示胚胎干细胞感知聚集信号需要GATA4，内胚层分化需要GATA6响应维甲酸[25]。与斑马鱼和爪蟾相反，在斑马鱼和爪蟾中，GATA5对内胚层和心脏发育都至关重要[26- - - - - -29]中，GATA5纯合敲除小鼠的表型是在相对温和的[三十]。GATA5缺陷的胚胎干细胞的分化以前尚未报道。

原始内胚层细胞是胚胎中最早表达层粘连蛋白和IV型胶原并产生基底膜的上皮细胞类型[31,32]。因此，层粘连蛋白和IV型胶原的诱导是ES细胞的内胚层分化的指示[25]。辛-3/4（也称为POU 5F1）是与胚胎干细胞的多能性相关的转录因子，并在ES细胞的分化中的表达丢失[33]。伴随ES细胞分化的是诱导GATA因子表达，提示ES细胞原始内胚层分化[25]。其中一个gata调控基因disabled-2 (Dab2)是胚胎干细胞向内胚层分化的信息标记[34]。在围着床小鼠胚胎，DAB2专门在胚外内胚层中表达，并且其表达没有在胚胎中发现正确直到E8.5后[35]。此外，DAB2为胚外内胚层的发展至关重要：DAB2小鼠敲除是早期胚胎致死由于内胚层细胞的解体[35]。在这项研究中，我们研究了通过删除GATA4、GATA5或GATA6基因来修饰多能性小鼠胚胎干细胞的分化。我们确定了个体GATA因子的缺失是否改变了胚胎干细胞的分化谱系，并通过表达芯片分析对分化细胞的基因表达谱进行了表征。本实验旨在探讨体外改变胚胎干细胞谱系测定和分化的方法。

2.材料和方法

2.1。试剂

全反式 - 视黄酸购自Sigma Aldrich（密尔沃基，WI）购买。组织培养瓶（Falcon）中，媒体，胰蛋白酶和100X抗生素 - 抗真菌剂溶液（的Cellgro，Mediatech公司，Inc）中进行自Fisher Scientific公司（斯普林菲尔德，NJ）购买。TRIZOL和脂质体2000购自Invitrogen（卡尔斯巴德，加利福尼亚州）购买。白血病抑制因子（LIF）是自Chemicon（蒂梅丘拉，CA）购买。ES细胞培养基和血清被Fox Chase癌症中心的组织文化设施准备。对于免疫检测，使用超级信号西杜拉持续时间延长底物（Pierce，罗克福德，IL）。初级抗体，包括兔抗GATA4，山羊抗GATA5，山羊抗GATA6，和小鼠抗OCT-3/4的购自Santa Cruz公司（Santa Cruz公司，CA）购买。抗波形蛋白和抗肌动蛋白抗体购自Sigma Aldrich（密尔沃基，WI）购买。自兔抗GATA-6也被用于免疫印迹和免疫荧光试验。Alexa氟488种596结合的二级抗体和DAPI核复染染料购自Invitrogen / Molecular Probes公司（俄勒冈州尤金）购买。

2.2。细胞培养

Mouse ES cells were cultured on gelatin-coated tissue culture plates in ES cell media containing HEPES (6 g/l), 1X antibiotic-antimycotic,-巯基乙醇（0.14 M), 15% heat inactivated FBS, and LIF (1,000 U/mL). The plates were precoated overnight at使用无菌明胶溶液(0.1%)，使用前用PBS洗涤三次。

RW-4小鼠ES细胞和遗传的GATA4纯合敲除细胞(−/−)[20]、GATA5(−/−)和GATA6(−/−)[22根据标准方案维持基因型。在实验之前，将胚胎干细胞接种在涂有明胶的平板或载玻片上，置于含有LIF且不含饲养细胞的胚胎干细胞培养基中。用1诱导细胞分化M维甲酸，四天。另一种方法是在培养皿中培养细胞，在没有LIF的ES细胞培养基中培养4天，使细胞聚集并形成胚状体。

2.3。免疫荧光显微镜

简言之，将ES细胞在6孔培养皿中接种于明胶包被的玻璃盖玻片上。将细胞在室温下用PBS洗涤两次，用4％多聚甲醛15分钟，并用0.5％Triton X-100透化处理5分钟。然后将细胞用PBS洗涤三次，用3％BSA的PBS含有0.1％Tween-20的30分钟，并在温育1小时一抗在1% BSA中稀释1:20 00,PBS中含0.1% ten -20。使用AlexaFluor 488标记(绿色荧光)或AlexaFluor 546标记(红色荧光)二抗检测GATA因子表达和定位。细胞在室温下DAPI(蓝色)溶液中孵育3分钟，使细胞核染色。细胞清洗三次，然后在抗褪色试剂(Invitrogen/分子探针)中固定和密封。在尼康日蚀TE 300显微镜上使用60X物镜观察染色，该显微镜连接Roper Scientific photometrics 12位测距相机。使用MetaVue软件获取图像，并使用Adobe Photoshop软件进行合并。

2.4。电泳迁移率转移测定法(EMSA)

为了分析小鼠Dab2启动子上GATA转录因子的结合能力，将ES细胞与维甲酸进行分化(1)M) 4天。收集胚胎干细胞微球，根据已公布的方案制备细胞质提取液和核提取液[34]。简单地说，为了分离细胞质提取物，细胞微球在200℃的冰中孵育10分钟L缓冲液A含HEPES (10mm, pH 7.9)， MgCl₂(1。5 mM), KCl (10 mM), DTT (0.5 mM), PMSF (0.2 mM), and a protease inhibitor cocktail (1X). Cell membranes were then ruptured with a pellet pestle (Fisher Scientifics) and the lysates were centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes to separate the cytoplasmic extracts from the nuclear pellets. To isolate nuclear extracts, nuclear pellets were incubated 30 minutes on ice in 50 含HepH9的缓冲液₂(1.5 mM)、NaCl (420 mM)、EDTA (0.2 mM)、DTT (0.5 mM)、PMSF (0.5 mM)、蛋白酶抑制剂鸡尾酒(1X)、甘油(25%)。核颗粒每5分钟被搅动一次。30分钟后，裂解液以10,000 rpm离心5分钟。上清(核提取物)的蛋白浓度采用Bio-Rad DC蛋白测定法测定，supernates的aliquots存储在−8C，直到使用。的寡核苷酸探针进行末端标记有32P和T4多核苷酸激酶，在G25旋转柱纯化，并通过液体闪烁计数定量。如先前所述进行结合试验[42]。The binding reaction contained HEPES-KOH (15 mM, pH 7.9), MgCl₂(1。5 mM), KCl (40 mM), DTT (0.5 mM), and glycerol (10%), 2 g聚(dI-dC)，核提取物(10g), and 20,000 cpm radiolabeled probe in a total volume of 20 湖结合反应混合物在冰上温育30分钟。对于超移位测定中，抗体与GATA4，GATA5和GATA6加入到相应的反应，并在冰上温育1小时。等份（20 l) of the binding reaction were loaded on 5% nondenaturing polyacrylamide gels and run at 120 V and使用垂直凝胶电泳仪(型号V15-17, GibcoBRL)在0.5 X TBE运行的缓冲液中分离3小时，分离结合和未结合的寡核苷酸。凝胶干燥1小时，x光胶片(富士)曝光18小时8C.我们鉴定并测试了小鼠Dab2基因ATG位点上游的四个GATA结合位点(−1904，−1926，−3943，−3894 bp)。来自区域- 1904 bp (PI)和- 1926 bp (PII)的GATA结合寡核苷酸对用维甲酸处理的胚胎干细胞或大鼠心肌细胞的核提取物中GATA复合物的形成最有效。与gata结合的寡核苷酸序列如下: PI，-阿卡塔特加塔塔特克特-; PII,- CAACTATATAGATAAAGACAAAGG-。

未标记的PI探针和SP1探针分别作为特异性和非特异性的竞争对手在超过300倍时使用[42]。为了检测GATA结合序列的特异性，我们还将该一致序列的“GAT”突变为CGC，合成m1P和M2P用于竞争分析。这些探针的顺序如图所示6。

2.5。逆转录实时聚合酶链反应分析

从模拟处理的胚胎干细胞（培养基）中提取总RNADMSO)或视黄酸处理4天使用Trizol试剂根据制造商的协议。使用Qiagen Rneasy mini kit对RNA进行纯化，去除污染物。使用TURBO无DNA试剂盒(Ambion)去除潜在的污染DNA。使用安捷伦2100生物分析仪结合RNA 6000纳米LabChip对RNA进行量化。使用M-MLV逆转录酶(Ambion)和固定的oligo dT和随机的decamers混合物进行RNA的逆转录(RT)。用两种不同量的输入RNA(100和20 ng)监测RT反应的线性度和PCR效率。Real-time PCR“按需测定”(应用生物系统)Taqman测定使用ABI 7900 HT仪器。real-time RT-PCR分析的基因信息见表2。

2.6。DNA表达阵列

Gene expression profiles were analyzed to compare undifferentiated and retinoic acid differentiated ES cells of wildtype and GATA-deficient genotypes using a mouse 32 K oligochip printed by the Microarray Facility of Fox Chase Cancer Center [43]。采用胍盐/异硫氰酸/苯酚/氯仿法从60%-80%融合ES细胞培养物中分离总RNA。使用“无DNA”试剂盒(Ambion, Austin, TX)根据制造商的规格对总RNA进行DNase处理。15微克经dnase处理的RNA被逆转录，氨基烯丙基dUTP被纳入含有500 ng oligo (dT)引物，1x第一链缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)， 0.01 M DTT, 500的反应中M each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP/aadUTP (2 : 3 ratio), 40 Units of rRNasin (Promega, Madison, WI), and 200 Units of SuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). After brief denaturation and annealing of the primers at8分钟后，反应在2小时，然后使用Microcon-30柱(Millipore, Bedford, MA)碱水解RNA和cDNA纯化，然后使用氟林tm单功能染料(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)偶联反应标记Cy3-或cy5 -染料。然后使用StrataPrep PCR纯化试剂盒(Stratagene, La Jolla, CA)对探针进行纯化。对样品(一个标记为Cy3，一个标记为Cy5)结合，变性，并在10的存在下进行预退火克婴儿床-1 DNA（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA）和10 克聚-DA的DNA。杂交和洗涤液如前所述进行[43]。对每个样本重复上述步骤，只是用于标记rna的染料被颠倒了。此外，对于每个时间点，使用独立的RNA源重复杂交。强度提取和斑点质量特征如前所述进行[43]。

然后将微阵列数据使用GeneSight 3软件（生物发现公司，玛丽安德尔，CA）进行分析。The data was (i) corrected for background by subtraction of the local group median, (ii) normalized using a piecewise linear normalization with 5 bins, typically greater than 1000 data points per bin, and (iii) limited to a minimum expression level equal to an estimate of the minimum background. The data was then converted to log₂值，以及通过组合“染料翻转”复制确定的每个强度比的平均值和标准差。每个样品至少进行两次“染料翻转”实验。计算这些值的平均值和方差系数，并用于统计分析和聚类。通过置信度分析确定单个基因的差异表达[44]和最大似然分析[45]，以取得最终的候选人名单99％的置信水平。采用分层聚类[进行了分析数据46]的欧几里得距离度量。

3.结果

3.1。由聚集和/或维甲酸诱导的野生型和GATA缺陷胚胎干细胞内胚层分化

我们首先通过Western blot比较了维甲酸处理和/或聚集后野生型和GATA缺陷ES细胞内胚层分化的一般标记(图)1(一)和1 (b))和北方斑点（图图1（c）)分析。Dab2、IV型胶原和层粘连蛋白的诱导被用作承诺胚胎外内胚层谱系的标记。如图所示1(一)和1 (b)），野生型ES任一视黄酸处理或聚合后分化成内胚层细胞的细胞，通过DAB2的表达所指示的。GATA4缺陷的胚胎干细胞，但是，并没有对细胞聚集反应;小DAB2诱导（图1 (b))但在单层或细胞聚集体中用维甲酸处理时确实发生了内胚层分化（图1(一)和1 (b)），与以前的报道是一致的[25]。值得注意的是，GATA4（ - / - ）ES细胞相比，在响应于任一视黄酸或聚集的野生型细胞显示定量减少内胚层分化。GATA5缺陷的ES细胞在单层培养物呈现到视黄酸应答降低为DAB2感应/内胚层分化。尽管如此，具有或不具有视黄酸诱导的内胚层分化的存在聚集（图1 (b))。（ - / - ）细胞既不DAB2也不GATA4是在GATA6诱导的聚集和/或视黄酸治疗。因此，GATA6被临界由视黄酸处理和/或聚集，与先前的研究一致[需要诱导ES细胞的内胚层分化或者22,23,25]. 在没有GATA6的情况下，GATA5由维甲酸诱导（图1(一)），但不足以诱导原始内胚层谱系分化。

OCT-3/4的还原作为ES细胞的多能性和分化的损失的一项指标。辛-3/4蛋白质水平在野生型类似地减少和所有GATA-缺陷（包括GATA6缺陷型）ES在视黄酸处理的细胞，这表明视黄酸诱导的ES细胞的分化而不管任何GATA因子。因此，视黄酸诱导GATA6的分化（ - / - ）胚胎干细胞比原始内胚层其它谱系。没有视黄酸处理，所述Oct-3/4水平没有在细胞聚集诱导分化在野生型或GATA-缺陷的ES细胞减少（图1 (b))，表明胚状体的形成可以保持胚胎干细胞亚群的多能性。免疫染色显示oct -3/4阳性细胞位于胚状体内部(图)1（d），Oct-3/4阳性细胞的示例用箭头表示）。通过Western blot在细胞聚集物（未显示）中很难检测到GATA5和GATA6蛋白，可能是因为经历原始内胚层分化的细胞数量较少。层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的表达也很难用westernblotting来测量，因为它们是分泌性蛋白。因此，我们使用了更敏感的检测方法，如Northern blot（图图1（c）)来测量球状体中的基因表达。Northern blotting也能够测量分泌蛋白层粘连蛋白和IV型胶原的表达，它们在球状体中形成基底膜。奇怪的是，在聚集的GATA5(−/−)ES细胞中诱导了Dab2 mRNA，但未诱导显著的GATA4、层粘连蛋白和IV型胶原(图)图1（c）)。下列视黄酸处理，GATA5（ - / - ）ES细胞表现出对视黄酸的反应过度和诱导的DAB2，GATA4和GATA6 mRNA的（图图1（c）)。northern blot结果显示mRNA之间存在差异(图图1（c））和蛋白质（图1 (b))这些细胞中Dab2和GATA4的水平。蛋白质和mRNA的测定来自相同的细胞制备，以显示重现性，这些结果在三次实验中重复获得。对这些数据的一种可能的解释是，GATA5可能在调控这些mrna向蛋白质的翻译中发挥潜在作用。野生型和缺乏gata的细胞中基因表达水平的差异，或者发生分化的细胞百分比的差异，可能是Western和Northern blot分析检测到的内胚层标记表达差异的原因。免疫荧光显微镜检测单个细胞中GATA4和Dab2的表达，解决了这个问题(图)图2（a）). 野生型ES细胞在维甲酸作用下，95%以上的细胞分化为GATA4和Dab2阳性的胚外原始内胚层细胞。然而，在缺乏GATA因子的ES细胞中，维甲酸诱导的胚外内胚层分化降低。分化为原始内胚层谱系（Dab2阳性）的细胞百分比为GATA-4（–/–），27%；GATA-5（–/–），38%和GATA-6（–/–），1％（图2 (b))。WT、GATA-4(−/−)、GATA-5(−/−)和GATA-6(−/−)的Dab2和GATA4阳性细胞的百分比通过在5个显微镜视野中计数100个细胞来确定，平均值以柱状图表示(图)2 (b)). 在WT-ES细胞中，大多数表达GATA4的细胞也表达Dab2。因为Dab2的表达是胚胎外胚层发育所必需的[35]，缺少DAB2的是缺乏内胚层分化的可能指示。在GATA-4（ - / - ）ES细胞DAB2的表达被限制在细胞和相关因素与GATA6的表达的一个子集（图2 (c))。GATA6(−/−)ES细胞Dab2阴性，但表达波形蛋白，波形蛋白是中胚层分化的干细胞标志物(图)图2（d）)。因此，维甲酸处理野生型胚胎干细胞的主要分化途径是胚胎外内胚层谱系。然而，GATA因子的缺失降低了胚外内胚层分化，促进胚胎干细胞选择不同的命运。

3.2。在胚体聚集诱导表达和基底膜的形成GATA5的要求

一个特殊的观察是从得到的GATA5该胚状体（ - / - ）ES细胞DAB2阳性但缺乏层粘连蛋白和IV型胶原的表达（图图1（c）)。我们检查了PAS染色形成的胚状体的形态和基底膜的存在或缺失，它检测基底膜的糖蛋白[36,37]。从GATA5衍生胚状体（ - / - ）细胞表现出的是由空洞（内脏内胚层）的细胞的内胚层外层。PAS染色在GATA5负（ - / - ）的胚状体，这表明不存在基底膜，而来自野生型形成的胚状体ES细胞显示出鲜明的基底膜壁内胚层样细胞的层的下面（图3.，箭头）。当用视黄酸处理过的胚状体。然而，基底膜存在于两个野生型和GATA5（ - / - ）。因此，GATA5需要层粘连蛋白和IV型胶原的聚集诱导的表达和基底膜的形成。另外，基底膜的形成是不适合的胚状体形成的内脏内胚层上皮[必不可少38,39]。该数据表明，GATA5可能需要的ES细胞的聚集诱导分化成壁内胚层细胞，这是在生产赖克特的膜的基底膜的形成和活性[40]。这种可能性一致，与野生型ES细胞形成覆盖有类似于壁内胚层（扁平细胞）表面的上皮细胞，并GATA5球状体（ - / - ）ES细胞形成覆盖有类似于空洞内脏内胚层细胞的上皮细胞的球状体（图3.)。

3.3。GATA因子与Dab2启动子的结合

接下来，我们研究了促进野生型和GATA-缺陷的胚胎干细胞[核提取物结合的GATA因子的活性41]。We identified and tested four GATA binding sites located upstream of the ATG site of the mouse Dab2 gene (−1904, −1926, −3943, −3894 bp). The GATA-binding oligonucleotides from region −1904 bp (PI) and −1926 bp (PII) were most potent for GATA complex formation in nuclear extracts from ES cells treated with RA or from rat cardiomyocytes. We used a predicted GATA-binding site from the mouse Dab2 promoter (referred to as Dab2-PI site, at −1904 bp) to perform electrophoretic mobility shift assays (EMSA) using nuclear extracts from retinoic acid-treated cells [42]。如图图4（a）的野生型ES细胞具有最高的GATA结合活性。大多数的低聚结合复合体（箭头）的通过抗体超移动到GATA4（doublearrowhead），但不通过抗体GATA5或GATA6（图图4（a）)。在GATA4(- / -)单元格中，一种复合物(箭头，图形)图4（a）)可被抗GATA6抗体消除，但抗GATA4或GATA5抗体不能。与野生型ES细胞相比，任何GATA因子的缺失都会大大降低与Dab2启动子探针上GATA位点的结合活性，这表明最佳结合需要所有三个GATA因子的存在。在GATA5(−/−)细胞中，表达GATA4和Dab2的细胞数较低;因此，抗gata4抗体仅能转移含有弱gata -4的复合物(图)图4（a）)。GATA6（ - / - ）ES细胞不表达GATA4或DAB2并DAB2启动子没有观察到GATA结合活性;但在GATA4的GATA6转染（ - / - ）ES细胞诱导DAB2（红色）和GATA4（绿色）的表达通过荧光显微镜观察到，并用于核染色计数器DAPI（蓝色）（图图4（b）)。该数据表明，GATA4需要DAB2的最佳表达和ES细胞分化成原始内胚层。所有的结合活性观察到似乎是特定到探针中，由于在过量的未标记的夹杂物特异性探针PI的300倍抑制GATA因子DAB2启动子的放射性标记探针PI的结合（图图4（c）)。此外，绑定是特定于GATA结合位点，因为在任一正向（m1PI）引入突变或反向（m2PI）GATA结合位点的序列中取消了未标记的探针与标记的竞争PI的能力（图图4（c）)。EMSA也对来自Dab2启动子的另一个预测的gata结合位点(称为Dab2- pii位点，在−1926 bp)进行。使用Dab2-PII探针得到的结果与使用Dab2-PI探针得到的结果相似，表明ES细胞的gata结合特性与两个gata结合位点相似(数据未显示)。

同样的探针还比较了胚胎干细胞的EMSA模式与大鼠心肌细胞的结合活性(图)图4（d）)。ES细胞或心肌细胞的核提取物含有含有GATA4的复合物(箭头)，可与GATA4抗体重叠(双箭头)，心肌细胞含有更多的GATA4阴性复合物(箭头)。因此，在维甲酸分化的胚胎干细胞和心肌细胞中，GATA结合活性只有细微的差异，这表明在两种不同类型的细胞中存在一些辅助因子。

3.4。单层培养野生型和GATA缺陷ES细胞内胚层分化的基因表达谱比较

为了进一步表征对ES细胞的分化各GATA因子的不足的影响，我们采用了cDNA微阵列分析[43为了比较野生型，GATA4的基因表达谱（ - / - ），GATA5（ - / - ），和GATA6（ - / - ）ES细胞以下作为单层培养这些胚胎干细胞的视黄酸诱导分化。该数据已经提交给国家生物技术信息中心（NCBI）的基因表达综合（GEO）库（链接将在发现http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/query/acc.cgi?acc=GPL4486和链路将在手稿的出版物被激活）。

对单个基因如Dab2、层粘连蛋白、胶原蛋白及各GATA因子的检测显示，变化与Western和Northern blotting分析一致(表)1)除了IV型胶原外，其与胚胎干细胞单层cDNA阵列和椭球体northern blot有一定差异。对于其他大部分基因，cDNA阵列方法验证了northern blotting和western blotting结果。未分化的野生型或缺乏gata的ES细胞的形态在缺乏维甲酸时是相似的。然而，维甲酸的处理，诱导独特的形态变化的细胞类型(图图5（a）），表明GATA的差异表达因子影响细胞的性质，包括形态。

通过微阵列显著性分析(SAM)和层次聚类分析比较维甲酸诱导的wildtype和GATA敲除ES细胞的表达谱(图)5 (b)）44- - - - - -46]。视觉观察表明，GATA4，GATA5，或视黄GATA6缺乏的效果酸诱导基因表达的变化是深刻和每个GATA因子示出了大幅改动基因表达谱缺失（图5 (b))。在比较相同细胞类型的不同制备(每种细胞类型2 - 4种)的RNA信号的实验中，表达谱是相似的，说明观察到的细胞类型之间的差异不是由于实验差异，而是反映了与基因型相关的表达差异。按数学模型分类[46]表明，与GATA4(−/−)或GATA6(−/−)胚胎干细胞相比，wildtype和GATA5(−/−)胚胎干细胞的表达特征更相似(图)5 (b))。因此，GATA4，GATA5和GATA6都可以显着地修改下列视黄酸处理的ES细胞的基因表达概况。虽然在基因表达的许多变化是显然与内胚层谱系相关联，这些变化多数（发生在GATA4（ - / - ）和GATA5（ - / - ）ES细胞）的不是为内胚层细胞的功能是至关重要的，并只有少数关键基因，如DAB2，可能需要在早期胚胎发育胚层的形成。的cDNA阵列表明，GATA6（ - / - ）ES细胞中胚层朝向谱系分化与心脏标记物（原肌球蛋白α1）中胚层标志物的表达（中胚层转录物，胶原蛋白III的α）和。

3.5。从cDNA微阵列分析鉴定的标记的一组验证

我们选择从与用于进一步验证大倍数变化（无论是上调或下调）表达阵列实验鉴定的基因的一个面板（表2)。已知重要性几个谱系标记在ES细胞分化，这也被鉴定为具有表达阵列中显著的变化，被用于比较。通过定量实时PCR分析这些基因的表达，并且将结果表示为“热图”（图5 (c))。在这个实验中，我们还研究了在具有或不具有视黄酸处理的胚状体的基因的这个面板的表达模式（图图5（d）)。

通过在单层比较基因表达（图5 (c)）和球状体（图图5（d）)，聚集诱导基因包括GATA4, GATA6, Dab2，层粘连蛋白(lama1)， Afp, H19，和Lrp2，在野生型ES细胞中不含维甲酸。在没有维甲酸的情况下，聚集可以降低野生型ES细胞中Tdgf1 (cripto)和Oct-3/4 (pou5f1)的表达。GATA5、Col3的表达1、MEST和Lrp1在野生型胚胎干细胞中依赖于维甲酸。在野生型和缺乏gata的ES细胞中，观察到对视黄酸和聚集反应的基因表达谱的一些独特和微妙的差异(图)5 (c)和图5（d）)。例如，在单层的GATA6培养（ - / - ）ES细胞，视黄酸诱导的COL3的更高表达1，MEST，和TPM1比球体培养。

表达式概要文件分析中的几个要点(图)5)可以被注意到。首先，GATA因子表达之间存在相互调节(图)图5（e）)。视黄酸诱导的GATA4表达依赖于GATA6但不能在GATA5;GATA5表达的维甲酸诱导通过任一GATA4或GATA6的缺失增强;要么GATA4或GATA5的缺失不显著ALTER视黄酸诱导的表达GATA6。

在GATA4 (- / -) ES细胞中，维甲酸强烈上调HNF4，并与上调的GATA6相关(图)图5（f）)。在不存在的GATA6，中胚层谱系似乎是有利的，由胶原3alpha1的表达所指示的（图图5（f）)，据报道在胚胎中胚层、巩膜、皮小体和结缔组织的形成中特异表达[47]。GATA6需要内胚层谱系分化，由内胚层标志物如DAB2，层粘连蛋白，和AFP在两者不存在或视黄酸的存在下的表达降低所指示的（图图5（G）)。

其他GATA6无关（但GATA4依赖型）基因包括胎肝转录H19 [48]，心脏标志物原肌球蛋白1α（TPM1），和t检验，中胚层特异性转录物[49,50]（图5 (h))。一般来说，单个GATA因子的缺失似乎促进ES细胞分化的替代谱系。

4讨论

我们研究了鼠的体外分化ES细胞用GATA4，GATA5，或GATA6的缺乏和对于野生型ES细胞进行比较。用于实验的理由是，GATA因子参与的内细胞团的多能细胞的细胞谱系判定早期的步骤中，ES细胞的体内当量，并且因此GATA因子改变可能影响ES细胞谱系决定。

GATA6(−/−)胚胎干细胞不能进行胚外内胚层分化，这与发现GATA6缺失导致内胚层发育缺陷和胚胎早期致死率一致[22,23]。尽管GATA4或GATA5的缺失会减少但不会损害胚胎干细胞的内胚层分化，但GATA4或GATA5的缺失并不会阻碍小鼠早期胚胎胚胎外内胚层的发育[三十,51]. 然而，GATA4阴性内胚层在心脏诱导中的作用是有缺陷的[19,52]。体外观察到的胚胎外诱导中对GATA4和GATA5的需求可能在体内得到补偿，但GATA因子可能参与了胚胎外内胚层的其他未特征性功能。

野生型ES细胞表达内胚层标志物，例如DAB2，GATA4，GATA6，层粘连蛋白，和在用视黄酸或聚集分化胶原IV。在用视黄酸处理的野生型ES没有观察到GATA5的表达，但在GATA4观察（ - / - ）ES或GATA6（ - / - ）ES用视黄酸处理的细胞。GATA4（ - / - ）ES细胞表达肝标志物HNF4和GATA6体外;实际上，研究报告指出，GATA6调节HNF4并且需要在小鼠胚胎内脏内胚层分化[22]。GATA6（ - / - ）ES细胞表达中胚层和心脏标志物（中胚层转录物，胶原蛋白3α1和原肌球蛋白1的α），而GATA5（ - / - ）细胞似乎在定形内胚层标志物蛋白的表达的调节作用。我们观察到，在GATA5（ - / - ）ES细胞中，mRNA和若干内胚层标志物，包括DAB2和GATA4被解离的蛋白水平（图1)。当由视黄酸刺激，内胚层标志物在球状体的mRNA水平从GATA5高度诱导（ - / - ）ES细胞，至比野生型ES细胞水平大得多。然而，从蛋白质水平，GATA5判断（ - / - ）ES细胞表达这些内胚层标志的少。因此，GATA5可能在这些mRNA翻译成蛋白质的调节作用。我们还发现，基底膜成分的细胞聚集诱导表达需要GATA5。产生适当的基底膜的能力被认为是早期胚胎发育的重要[36- - - - - -39]。然而，GATA5不足不会出现在小鼠胚胎发育影响原始内胚层的形成[三十]。

我们发现，GATA5（ - / - ）ES细胞胚状体的形成仅呈现细微的表型。有可能的，GATA5的原始内胚层发展中的作用是多余的GATA4和GATA6。可替换地，可能需要聚集诱导ES细胞分化成壁内胚层谱系GATA5。所述壁内胚层细胞表达高水平的基底膜成分（层粘连蛋白和IV型胶原），并负责在早期胚胎产生基底膜为厚赖克特的膜[8,10]。从这些实验中一些观察可能有生物学意义，建立再生疗法。ES细胞的分化可以通过缺失GATA6，其可提高效率，以产生由ES细胞衍生的心肌细胞被引导到中胚层形成。在ES细胞GATA4的缺失会直接到形成肝细胞的体外。然而，还有许多工作要做，以提高再生疗法使用任何GATA因素的缺失。

5。结论

我们发现，一个GATA因子GATA4、GATA5或GATA6的缺失，可以显著改变由维甲酸诱导分化的ES细胞的基因表达谱和谱系测定。胚胎干细胞缺乏单一的GATA因子(GATA4、GATA5或GATA6)，分化时表现出独特的基因表达模式。GATA6的缺失终止了胚胎干细胞向内胚层分化，但导致中胚层谱系分化。正常情况下，在体外分化过程中，大部分胚胎干细胞分化为原始的内胚层细胞[25]。因此，GATA6的缺失允许了卵黄囊内胚层以外的谱系的选择。这项研究证明了通过改变GATA因子的表达，在体外重新定位胚胎干细胞谱系的方法。

其他化验

Northern印迹，Western印迹，和免疫组织化学按照标准方法如先前所述进行[25,35]。转染按前面所述进行[25]。

作者的贡献

C. D.卡波 - 希希做了所有的免疫荧光显微镜分析，EMSA实验工作，她也做了北方和Western印迹所有的前期工作。她设计针对GATA6抗体，目前正在协调所有实验的主要负责人。M. RULA和J. L. Smedberg进行了使用Western印迹分析组织培养实验和反复的实验。J. L. Smedberg也进行免疫组织化学研究。E. Nicolas和A. T.杨做了实时PCR检测和分析。R. F.阿达莫，与C. D.卡波 - 集集工作，进行EMSA测定法。A.弗罗洛夫和A. K.戈德温进行的表达阵列实验和分析。十，十，许，与C. D.卡波 - 希希，提供理论基础和设计实验。X. X.许，与C. D.卡波 - 集集制备和编辑4个草稿的手稿。所有的作者促成了实验设计，数据解释，稿件写作和编辑，并通过了论文的最终版本。

致谢

这项工作是由格兰特R01 CA79716到X. X.徐从NCI，NIH，并通过从核心格兰特没有支架支撑。CA006927。笔者从欣赏试剂博士的慷慨馈赠。大卫·威尔逊，爱德华Morrisey和迈克尔Parmacek。他们承认丽莎Vanderveer为北方印迹和微阵列设施使用寡核苷酸芯片的基因表达分析实验中的大力协助。他们欣赏成像设施的桑德拉·雅布隆斯基博士的帮助和贡献，细胞培养基金的莎朗·霍华德，卡斯伦纳和病理设备，生物技术基金的方平陈，和DNA测序设备。他们感谢博士。伊丽莎白R.史密斯，冬华扬，科拉多Caslini，罗伯特·摩尔，约翰·伯奇进行的实验过程中，并在稿件的准备上都智力和技术方面的有益的建议。他们感谢伊丽莎白·史密斯博士，她在编辑稿件的帮助。

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