腺苷受体A1-A2a异构体通过yy1诱导的PPAR抑制调控EAAT2表达和谷氨酸摄取γ转录

摘要

腺苷受体A1 (A1AR)和A2a (A2aAR)在调节谷氨酸摄取中起重要作用，以避免谷氨酸在脑内积聚引起的兴奋性毒性;然而，A1AR和A2aAR作用的确切机制尚不清楚。在此，我们报道了在氧-糖剥夺(OGD)条件下，星形细胞膜中A1AR蛋白的表达和细胞内谷氨酸水平降低，而A2aR蛋白的表达升高。共免疫沉淀(Co-IP)实验表明，在OGD条件下，A1AR与A2aAR相互作用。2-氯- n6 -环戊基腺苷(CCPA)和SCH58251分别激活A1AR和灭活A2aAR，部分逆转了ogd介导的谷氨酸摄取功能障碍、EAAT2升高和PPARγ并抑制Ying Yang 1 (YY1)的表达。YY1的沉默和PPAR的激活γ调节EAAT2表达式。此外，YY1静音提高了PPARγ水平，在正常和OGD条件下。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)1与YY1相互作用，HDAC1沉默可改善PPARγ启动子活动。综上所述，我们的研究结果表明，A1AR-A2aAR异构体通过yy1介导的HDAC1向PPAR募集来调节EAAT2的表达和谷氨酸摄取γ启动子区域。

1.介绍

缺血性脑卒中是脑卒中最常见的亚型，严重威胁着我国公众健康，每年新增脑卒中病例高达250万例，死亡率很高[1，2］．星形胶质细胞暴露于氧 - 葡萄糖剥夺（OGD）条件下诱导谷氨酸间隙和炎症介质的释放，在局部缺血过程导致兴奋性中毒的神经元死亡的功能障碍[3.- - - - - -7］．因此，星形胶质细胞，最丰富的神经胶质细胞类型，在缺血性中风的病理过程中发挥了至关重要的作用[8]，星形胶质细胞谷氨酸清除功能的恢复是缺血性卒中神经保护的一种治疗方法[9］．

星形胶质细胞细胞外谷氨酸快速清除的作用依赖于兴奋性氨基酸转运体(EAATs)，也称为谷氨酸转运体(GluTs) [10，11］．EAAT家族包含5种亚型:EAAT1, EAAT2, EAAT3, EAAT4和EAAT5 [12］．研究表明，EAAT1和EAAT2主要在星形胶质细胞中表达，EAAT3、EAAT4和EAAT5位于神经元中[13，14］．特别是EAAT2，大脑中最丰富的供过于求[15，在摄取细胞外谷氨酸方面起主要作用[16- - - - - -18］．一些研究报告称，EAAT2的表达在患有神经系统疾病的脑组织中受到抑制，包括缺血、锰中毒和阿尔茨海默病(AD) [10］．进一步的研究报道，EAAT2/GLT1的表达在转录和翻译水平上通过涉及PI3K-Akt等因子的复杂机制受到调控[19), NF -κB (20.]和后生改性剂组蛋白脱乙酰酶（HDAC）I和II [21.］．然而，EAAT2调控的机制尚未完全阐明。

腺苷受体(Adenosine receptor, AR)是G蛋白偶联受体(GPCR)超家族中的一员，由四种AR亚型组成:腺苷受体A1 (A1AR)、腺苷受体A2a (A2aAR)、A2bAR和A3AR [22.］．特别是A1AR和A2aAR在脑组织中高表达，并且与腺苷有较高的亲和力[23.，24.］．腺苷结合A1AR和A2aAR，然后启动几个生物学过程，如调节谷氨酸释放[25.，26.］．研究人员发现，在纹状体、尾状核和海马体的皮质谷氨酸神经元突触前末梢中，A1AR和A2aAR共同表达的比例为61% [27.，28.］．最近，Cristovao-Ferreira等人证实了A1AR和A2aAR共定位于细胞表面[28.- - - - - -30.］．进一步的研究表明，A1AR可以与A2AAR相互作用形成A1AR，A2AAR杂聚。A2AAR的激活可以唯一地抑制A1AR介导的生物学反应〔31.］．在缺血性中风中，高浓度腺苷激活A2aAR可提高细胞内谷氨酸水平，并加剧神经元损伤[32.，33.]，而腺苷或药物激动剂诱导的A1AR激活已被证明在缺血下发挥保护作用[34.，35.];A1AR激活降低谷氨酸释放，促进缺血耐受性[36.，37.］．然而，A1AR与A2aAR是否密切相互作用形成A1AR-A2aAR异构体以及A1AR-A2aAR异构体在缺血性卒中中的作用尚不清楚。

鉴于星形胶质细胞调节谷氨酸清除的主要功能，本研究的第一个目的是明确OGD是否诱导A1AR-A2aAR异构体形成并调节星形胶质细胞谷氨酸摄取。此外，我们还探索了A1AR-A2aAR异构体调控星形胶质细胞中EAAT2表达和谷氨酸摄取的新机制。

2.方法和材料

2．1.材料和试剂

DMEM(含高糖或无糖)、Opti-MEM™-还原血清培养基(Opti-MEM)、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶- edta(0.25%)均来自Gibco(中国上海)。抗a1ar抗体，A2aAR, GFAP, S100β, anti-PPARγ抗体、谷氨酸检测试剂盒和2-氯- n6 -环戊基腺苷(CCPA)购自Abcam公司(中国上海)。Anti-EAAT2抗体,抗-α/β微管蛋白抗体，抗β肌动蛋白的抗体和抗荥阳1（YY1）抗体来自Cell Signaling Technology，Inc.的蛋白A / G购加琼脂糖购自Santa Cruz公司（上海，中国）。CCPA，SCH58261和CGS21680从塞立克公司（上海，中国）。HRP-山羊抗兔IgG（H + L），HRP山羊抗小鼠IgG（H + L），Alexa的488山羊抗兔IgG（H + L），和Alexa 594羊抗- 兔IgG抗体（H + L）是从杰克逊免疫公司（费城，USA）进行排序。GoTaq®qPCR的预混，萤光素酶报告基因检测试剂盒，GoScript™RT混合物，和FuGENE®HD转染试剂购自Promega生物技术有限公司（北京，中国）。T-PER™组织蛋白抽提试剂和MEM-PER™Plus试剂盒从默飞世尔科技有限公司（上海，中国）。西方的Immobilon HRP化学发光底物（ECL试剂盒）从默克密理博有限公司（上海，中国）。聚偏氟乙烯（PVDF）膜购自GE公司（德国）购买。TRIzol试剂和其它试剂购买和使用作为自Sigma-Aldrich（上海，中国）获得。材料和试剂的细节显示，在补充文件（可在这里）.

２.２.小鼠原代星形细胞培养与OGD治疗

根据以前的报道，初级皮质星形胶质细胞被分离和培养[38.］．简单地说，用剪刀将幼鼠斩首。用细钳分离皮质半球，切成小块，37℃水浴30分钟胰酶化。将皮层组织块分离成单细胞悬液，置于培养瓶中培养。培养7-8天后，摇匀去除小胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞。星形胶质细胞再培养6天后用于进一步研究。

OGD处理时，去除培养基，用PBS冲洗星形胶质细胞2次。在培养瓶中加入无糖DMEM，将星形胶质细胞暴露于1% O₂6 h。

２.３.免疫荧光分析

原代星形胶质细胞用4%甲醛固定15分钟，PBS冲洗。用5%正常山羊血清阻断1小时，用抗gfap或抗s100b抗体在4°C孵育过夜。PBS洗涤三次后，用Alexa Fluor®488山羊抗兔IgG (H+L)或Alexa Fluor®594山羊抗兔IgG (H+L) rt孵育1小时。细胞核用二胺基苯基吲哚(DAPI)染色。

２.４.共免疫沉淀(Co-IP)和Western Blotting

根据之前的一项研究进行联合ip和western blotting [39.］．简单地，收集处理过的细胞，然后在14000 × g和4°C条件下离心15分钟。将上清转移到新管中，与抗a1ar抗体(1:50)或抗yy1抗体(1:50)与蛋白A/G琼脂糖珠在4℃下孵育2 h过夜。然后用western blotting对溶液进行评估。

2．5．谷氨酸摄取试验

对于谷氨酸盐摄取测定，经处理的星形胶质细胞弃去培养基，并洗涤所述细胞与d-Hank溶液。The cells were preincubated with 300 nM glutamate for 7 min, and glutamate uptake was terminated with ice-cold Hank’s solution, followed by immediate analysis using a glutamate assay kit [40，41.］．根据制造商的说明书使用谷氨酸检测试剂盒(比色法)分析细胞内谷氨酸水平。简单地，收集处理过的细胞和培养基，将细胞重悬在检测缓冲液中。取标本置于冰上孵育30分钟，4℃离心5分钟。收集上清，加入反应混合物与样品孵育。在450nm处测定样品的吸光度值。

2.6。EYFP-A1AR质粒、A2aAR siRNA、YY1 siRNA、HDAC1 siRNA转染

pcDNA3.1/opto-a1AR-EYFP来自Karl Deisseroth (Addgene plasmid #20947)。A2aAR和YY1 siRNA购自中国上海GenePharma。A2aAR siRNA序列为5 -AAACTTCTTCGTGGTATCTCT-3［42.］．YY1 siRNA的序列为5 -TTGTTCAATGTAGTCGTCG-3 ，HDAC1的siRNA序列为5 -GTTGGAAGAGTTCTTCGGG-3 ．星形胶质细胞在6孔培养皿中培养μg质粒或200 nM siRNA用FuGENE®HD转染试剂转染星形胶质细胞48 h。处理过的细胞用于进一步研究。

2.7。荧光素酶检测

PPAR的启动子区γ合成并插入Peter Cockerill赠与的pXPG质粒(Addgene plasmid #71248)。将质粒与pRL Renilla荧光素酶对照报告载体共转染293 T细胞。荧光素酶测定是按照制造商的方案进行的。

2.8。统计分析

至少三个独立实验的数据表示为 （S.E.）。单因素方差分析（ANOVA）和学生 -试验中进行。 表示差异有统计学意义。

结果

3.1。OGD管制A1AR A2AAR和表达式

星形胶质细胞在摄取过量谷氨酸以避免对神经元的兴奋性毒性方面起着重要作用[11］．在本文中，我们分离和培养的小鼠原代皮质星形胶质细胞（图1(一)）.免疫染色显示星形细胞标记物S100B和GFAP在星形细胞胞浆中强烈表达(图)1 (b)）.OGD可用于建立脑缺血的体外模型。在我们的研究中，星形胶质细胞处于OGD状态1小时和6小时。Western blotting显示OGD处理后细胞表面A1AR表达降低，而A2aAR蛋白水平升高。此外，细胞暴露于OGD后，EAAT2蛋白的表达也降低(图)1 (c)）.有趣的是，Co-IP实验显示，OGD促进了A1AR和A2aAR之间的相互作用(图)1（d））.此外，与0 h相比，OGD处理1和6 h后细胞内谷氨酸水平显著降低( ）(图1（e））.这些数据表明，A1AR与A2aAR相互作用，形成A1AR-A2aAR异源二聚体，参与调控EAAT2表达和谷氨酸摄取。

(一)

(b)

（C）

（d）

（e）

(一)
(b)
（C）
（d）
（e）

图1

OGD促进A1AR的相互作用与A2AAR星形胶质细胞。用相差显微镜观察（a）正常初级星形胶质细胞形态并且在上（×100）被示出，并降低（200倍）面板。（b）中星形胶质细胞通过免疫荧光测定法鉴定。在S100b的（红色）和星形胶质细胞中GRAFP（绿色）抗原的阳性表达通过免疫荧光（×200）来测定。细胞核用DAPI（蓝色）染色。星形胶质细胞暴露于OGD条件指定的时间。（c）中A1AR，A2AAR，和EAAT2的蛋白质表达通过western印迹评估。（d）共IP测定用于评估A1AR和A2AAR之间的相互作用。（e）中使用谷氨酸测定试剂盒检测细胞内谷氨酸水平。数据代表 ． ． vs. the 0 h group and^＾ 与1h组比较。数据表示为 （ ）.

3.2。A1AR A2AAR和调控EAAT2和谷氨酸摄取的表达

我们探讨了A1AR和A2aAR在调节EAAT2和谷氨酸摄取中的作用。在OGD条件下，CCPA激活A1AR, SCH58261失活A2aAR可提高星形胶质细胞中EAAT2蛋白水平(图)2（a））.同样，与单独OGD组相比，OGD/CCPA、OGD/SCH58261和OGD/CCPA+SCH58261组细胞内谷氨酸水平升高( ）.有趣的是，OGD/CCPA+SCH58261组的谷氨酸水平高于OGD/CCPA组( ）(图2（b））.此外，OGD/CGS21680+CCPA组与单独OGD组相比，EAAT2表达和谷氨酸水平均无显著性升高( ）(数据2（c）和2 (d)）.这些数据表明，在OGD条件下，A1AR激活和A2aAR失活可提高星形胶质细胞中EAAT2的表达，提高谷氨酸摄取。为了进一步证实A1AR和A2aAR在调控EAAT2表达中的作用，我们用A2aAR siRNA敲除A2aAR(图)2 (e)）.与单独OGD相比，a2aar沉默的细胞中EAAT2蛋白和细胞内谷氨酸水平升高( ）(数据2 (f)和2 (g)）.同样，EYFP-A1AR质粒强制表达A1AR，部分逆转了ogd介导的EAAT2表达下调和谷氨酸摄取受损(图)2 (h)- - - - - -2 (j)）.这些数据提示A2aAR与A1AR相互作用，形成A1AR/A2aAR异源二聚体，通过抑制EAAT2表达，抑制A1AR活性和谷氨酸摄取。

(一)

(b)

（C）

（d）

（e）

(f)

(g)

(h)

(我)

(j)

(一)
(b)
（C）
（d）
（e）
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)

图2.

在A1AR / A2AAR异二聚体调节EAAT2和谷氨酸摄取的表达。Astrocytes were subjected to OGD conditions in the absence or presence of 30 nM CCPA (an A1AR agonist) and 200 nM SCH58261 (an A2aAR antagonist). (a, b) The expression of EAAT2 and the intracellular glutamate level were detected by western blotting or with a glutamate assay kit, respectively. The data represent as the （ ）. Vs.对照组;^＾ vs. OGD组;^＃ vs. OGD/CCPA组。星形胶质细胞在缺乏或存在30 nM CCPA和200 nM CGS21680(一种A2aAR激动剂)时处于OGD状态。(c, d)分别用免疫印迹法和谷氨酸检测试剂盒检测EAAT2表达和细胞内谷氨酸水平。数据表示为 （ ）. 对比对照组。(e) western blotting检测A2aAR siRNA转染星形胶质细胞48 h后A2aAR蛋白水平。在缺乏或存在30 nM CCPA的情况下，a2aar沉默的星形胶质细胞处于OGD状态。(f, g)分别用western blotting和谷氨酸检测试剂盒检测EAAT2表达和细胞内谷氨酸水平。数据表示为 （ ）. 和控制组相比 vs. OGD组。(h) western blotting检测EYFP-A1AR质粒转染星形胶质细胞48 h后A1AR蛋白水平。用EYFP-A1AR质粒转染星形胶质细胞48小时，然后在200 nM SCH58261存在或不存在的条件下进行OGD实验。(i, j)分别用western blotting和谷氨酸检测试剂盒检测EAAT2表达和细胞内谷氨酸水平。数据表示为 （ ）. Vs.对照组;^＾ vs. OGD组;^＃ 与OGD/EYFP-A1AR组比较。

３．３．PPARγEAAT2调节谷氨酸摄取

然后我们评估是否PPARγ调节EAAT2表达和谷氨酸摄取。星形胶质细胞用PPAR罗格列酮(RSG)预处理γ激动剂和OGD。PPARγ与单纯OGD组相比，激活增加了EAAT2的表达和细胞内谷氨酸水平(图)3(一个)和3 (b)）.这些数据表明PPARγ能促进EAAT2的表达，减弱ogd受损的谷氨酸摄取。我们进一步研究了A1AR/A2aAR异源二聚体是否调控PPARγ表达式。数字3 (c)显示PPAR的表达γ增加星形胶质细胞时，用CCPA和SCH58261预孵育，然后用OGD处理，而单独处理OGD星形胶质细胞。A2AAR沉默升高PPAR的水平γ在没有或存在CCPA的OGD下培养(图3 (d)）.GW9962是PPAR的抑制剂γ在OGD条件下，消除了CCPA-和sch58261诱导的EAAT2表达增加(图)3 (e)和3 (f)）.这些结果提示A1AR/A2aAR异源二聚体通过PPAR调控EAAT2水平γ．

(一)

(b)

（C）

（d）

（e）

(f)

(一)
(b)
（C）
（d）
（e）
(f)

图3.

PPARγ调节星形胶质细胞EAAT2表达和谷氨酸释放。(a, b) OGD下星形胶质细胞EAAT2蛋白和细胞内谷氨酸水平μM罗格列酮分别用免疫印迹法和谷氨酸检测试剂盒检测。数据代表 （ ）. 和控制组相比^＾ vs. OGD组。（c）中PPAR的表达的Western印迹分析γ30 nM CCPA和200 nM SCH58261处理的星形胶质细胞暴露于OGD 6 h。d .的PPARγ检测转染A2aAR siRNA的星形胶质细胞在30 nM CCPA的OGD条件下转染48 h后的蛋白水平。(e, f) Western blot分析30 nM CCPA和200 nM SCH58261处理星形胶质细胞中EAAT2的表达μM GW9662，其次是OGD暴露6h。

3.4。该A1AR / A2AAR异源二聚体调控YY1的表达

在本研究中，我们发现YY1蛋白，一个转录因子的表达增加了(图4(一)）星形胶质细胞OGD条件下放置后。进一步的研究表明，当星形胶质细胞用CCPA和SCH58261预温育，然后与单独OGD OGD条件下放置（图YY1的表达减少4 (b)）.此外，在没有CCPA或有CCPA的OGD下a2aar沉默培养中YY1的表达减弱(图)4 (c)）.这些数据表明，A1AR/A2aAR异质二聚体调控YY1的表达。数字4 (d)表明YY1 siRNA降低了YY1蛋白水平。YY1沉默促进了正常和OGD细胞中EAAT2的表达(图)4 (e)）.谷氨酸摄取实验表明，在OGD条件下，YY1沉默增加了细胞内谷氨酸水平(图)4 (f))，提示YY1沉默可减弱ogd受损的谷氨酸摄取。

(一)

(b)

（C）

（d）

（e）

(f)

(一)
(b)
（C）
（d）
（e）
(f)

图4.

在A1AR / A2AAR异二聚体经由YY1调节EAAT2表达。(一)The YY1 protein level in astrocytes under OGD conditions for 1 h and 6 h was evaluated. (b) Western blot analysis of YY1 expression in cells treated with 30 nM CCPA and 200 nM SCH58261 that were exposed to OGD for 6 h. (c) The YY1 protein level in astrocytes transfected with A2aAr siRNA for 48 h, followed by exposure to OGD conditions with 30 nM CCPA, was evaluated. The expression of PPARγwestern blotting检测星形胶质细胞YY1水平。(d) YY1 siRNA转染星形胶质细胞48 h后，用western blotting检测YY1蛋白。yy1沉默的星形胶质细胞在没有或存在30 nM CCPA的情况下均处于OGD状态。(e, f)分别用免疫印迹法和谷氨酸检测试剂盒检测YY1和EAAT2的表达和细胞内谷氨酸水平。数据代表 （ ）. NC组和^＾ vs. OGD/NC组。

3．5．YY1抑制PPAR的HDAC1募集γ

以上结果表明YY1和PPARγ可以调节EAAT2的表达;而YY1和PPAR之间的关系γ是未知的。我们发现YY1沉默提高了PPAR水平γ在正常和OGD条件下(图5(一个)）.此外，OGD刺激后HDAC1的表达增加(图)5 (b)）.进一步研究表明，OGD促进了YY1和HDAC1之间的相互作用(图)5 (c))，说明YY1可以在OGD条件下招募HDAC1。荧光素酶检测显示HDAC1沉默显著促进PPARγ推广活动(数据5 (d)和5 (e)）.这些数据表明，YY1新兵HDAC1抑制PPARγOGD条件下启动子的活性，导致星形胶质细胞中EAAT2表达和谷氨酸摄取的抑制。

(一)

(b)

（C）

（d）

（e）

(一)
(b)
（C）
（d）
（e）

图5.

YY1监管PPARγHDAC1。(一)PPARγ用YY1 siRNA转染星形胶质细胞48 h，然后用OGD处理6 h，观察星形胶质细胞的蛋白水平。(b)测定OGD暴露6h星形胶质细胞中HDAC1蛋白水平。(c).共同ip试验用于评价YY1和HDAC1之间的相互作用。(d) western blotting检测HDAC1 siRNA转染星形胶质细胞48 h后HDAC1蛋白水平。(e)荧光素酶测定评估PPARγ用HDAC siRNA转染293 T细胞48小时，然后用OGD处理6小时。数据表示为 （ ）. NC组和^＾ vs. NC/OGD组。

4.讨论

应力诱导GPCR的均低聚体和杂低聚体复合物的形成，并可能中断A1AR或A2aAR的功能[31.］．在此，我们发现，OGD促进A1AR-A2AAR异聚体的形成和A1AR的激活或失活的A2AAR减毒OGD介导的抑制EAAT2和谷氨酸摄取功能障碍。PPARγ能够调节EAAT2介导谷氨酸摄取[43.］．因此，我们研究了A1AR-A2aAR异构体是否通过PPAR调控EAAT2γ．这些数据表明A1AR/A2aAR异源二聚体通过激活A1AR或A2aAR失活减弱ogd介导的PPAR抑制γ谷氨酸抑制，导致细胞内谷氨酸水平升高接下来，我们进一步研究了A1AR-A2aAR异构体通过PPAR调控EAAT2的机制γ．已知YY1可以抑制EAAT2的表达[21.]，是调控靶基因如PPAR的转录因子γ［44.］．我们通过实验发现YY1通过将HDAC1招募到PPAR中来抑制EAAT2的表达γ启动子区域。这些数据表明，A1AR-A2aAR异源二聚化通过yy1诱导HDAC1向PPAR募集调控EAAT2表达和谷氨酸摄取γ启动子区域。

GPCRs，如A1AR和A2aAR，检测并将细胞外化学物质传递到细胞内，并激活下游信号，导致生理和病理反应的启动[45.］．一般来说，GPCRs是存在于细胞表面并起作用的单体受体[46.］．然而，最近的研究揭示了在培养的细胞的表面同源寡聚和异源寡聚GPCR复合物的存在[47.，48.］．这些homo/ hetero二聚体可能通过不同的方式被调节，例如通过激动剂/拮抗剂。特别是，GPCR异源二聚体的功能，包括其药理特性和活性，可能与GPCR单体有显著不同[49.，50.］．一些研究表明，A2aAR和A1AR在海马和皮质突触体中相互作用并异二聚[28.，29.，51.］．此外，这种异源二聚体中的A2aAR可以降低A1AR对其激动剂的亲和性[28.］．在本研究中，OGD促进星形胶质细胞中A1AR与A2aAR的相互作用，抑制EAAT2的表达和谷氨酸摄取。先前的一项研究表明，A2aAR的激活也会损害谷氨酸的清除[33.]， A1AR的活化在缺血中起保护作用[34.，35.，52.］．因此，我们怀疑OGD诱导A1AR-A2aAR异源二聚，A2aAR的激活抑制了a1ar介导的EAAT2表达。进一步研究表明，A1AR激活和A2aAR失活均可改善ogd介导的EAAT2蛋白水平下降和谷氨酸摄取损伤。有趣的是，A2aAR激动剂预处理阻断了A1AR激活诱导的EAAT2表达和谷氨酸摄取的变化。这些数据证明，OGD介导A1AR- a2aar异源二聚并抑制A1AR活性，通过抑制EAAT2表达导致谷氨酸摄取受损。

PPARγ，配体活化转录因子核受体超家族成员，通过结合靶基因启动子区域的过氧化物酶体增殖反应元件(PPREs)调控基因转录[53.］．激活PPARγ在免疫、炎症等方面起着关键作用[54.和新陈代谢[55.］．最近，Tureyen等人研究发现PPAR的活化γ通过RSG抑制炎症反应，减少脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠的梗死体积和神经功能缺损[56.］．庆和他的同事发现，细胞外谷氨酸的含量被控制PPARγU87MG和U251MG细胞的活性[57］．另一项研究表明PPARγ通过上调星形胶质细胞中EAAT2启动子的活性，具有神经保护作用[43.］．与之前的报告一致，PPARγ能够促进EAAT2的表达并减弱ogd受损的谷氨酸摄取。我们发现A1AR的激活和A2aAR的失活均可使PPAR水平升高γ星形胶质细胞暴露于OGD条件下。这些数据表明，A1AR/A2aAR异构体通过调节PPAR控制EAAT2水平和谷氨酸摄取γ表达式。

YY1，转录因子，调节参与细胞增殖和分化，细胞凋亡的多种蛋白质，和染色质重塑在多种细胞类型[58- - - - - -63］．最近的研究表明，YY1在神经发育、神经元功能、发育髓鞘形成和神经系统疾病中发挥着关键作用[64］．Aguirre等和Rosas等发现YY1通过结合鸡胶质细胞中的启动子抑制GluT (GLAST)/EAAT1表达[65，66］．进一步的研究也表明YY1负调控大鼠星形胶质细胞中EAAT1和EAAT2的表达[21.，67］．与上述文献一致，在我们的研究中，诱导的OGD YY1表达，YY1沉默升高EAAT2蛋白质水平和衰减了的小鼠星形胶质细胞OGD受损谷氨酸的摄取。有趣的是，通过A1AR的激活或A2AR的失活受到抑制YY1的表达。这些数据表明，OGD介导的A1AR / A2AAR异聚上调YY1表达，随后压制YY1 EAAT2表达和损害谷氨酸间隙。

以前的研究报道YY1在转录水平上调控许多基因[68］．YY1的负调控效应被发现依赖于HDACs，一类组蛋白去乙酰化酶[69，70］．我们的研究结果表明，OGD诱导了HDAC1的表达，HDAC1与YY1相互作用。Romera等人发现，succbpd /HDAC1/HDAC3复合物在HepG2细胞中脂肪样脂肪生成过程中灭活了PPARG2转录[43.］．在此，我们还发现YY1或HDAC1抑制升高的PPARγ正常和OGD条件和HDAC1击倒可抑制PPAR下细胞水平γOGD条件下启动子活性。这些数据表明，YY1新兵HDAC1抑制PPARγOGD条件下启动子活性。

综上所述，这些结果提示了A1AR-A2aAR异源二聚体介导的EAAT2表达和谷氨酸摄取通过yy1诱导的HDAC1向PPAR募集的机制模型γ启动子区域。在这个模型中，OGD促进A1AR-A2aAR异质二聚体的形成。这种复合物提高YY1蛋白水平，抑制EAAT2的表达，并损害星形胶质细胞对谷氨酸的吸收。这些作用可以通过A1AR的激活或A2aAR的失活部分逆转。此外，YY1通过将HDAC1招募到PPAR中来抑制EAAT2的表达γ启动子区域（图6）.这些发现使我们深入了解多种ARs调节EAAT2的机制，并应该促进缺血性中风治疗方法的发展。

图6.

腺苷受体A1-A2a异构体调控PPAR的示意图γ星形胶质细胞EAAT2的转录和表达。OGD促进A1AR-A2aAR异构体形成，上调YY1表达，抑制PPARγ通过HDAC1向PPAR募集转录γ启动子区，从而消除eaat2介导的谷氨酸摄取。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

李贵和侯宪华设计了研究和实验。侯献华，李媛，黄媛媛负责数据收集。侯献华和赵欢分析了数据。侯献华起草了手稿。侯献华和李贵对稿件进行了修改，所有作者都通过了最终稿件。

致谢

国家自然科学基金面上项目(no . 81371274);国家自然科学基金面上项目(no . 81601025);军事医学科技创新计划(no . SWH2017YBXM-15)http://www.aje.cn/)，以便在准备本手稿时提供语言协助。

补充材料

补充文件显示了材料和试剂的信息，包括品牌和批号。（补充材料）

参考文献

1. L.刘，王D.，K. S. Wong，来Y.王，“中风和中风护理在中国：巨大的负担，显著的工作量，并成为国家优先事项，”中风，第42卷，第2期12, pp. 3651-3654, 2011。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
2. 王颖，李志刚，赵旭东等，“中国卒中护理质量的显著改善，巨大的挑战和机遇，”国际中风杂志，第12卷，第2期3, pp. 229-235, 2016。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
3. P. Karki, P. Hong, J. Johnson Jr.等，“Arundic acid通过ERK, Akt和NF-增加星形细胞谷氨酸转运体EAAT1的表达和功能κB通路。”分子神经生物学，第55卷，第55期6，第5031-5046页，2018。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
4. A. H. Cornell-Bell, P. G. Thomas和S. J. Smith，“兴奋性神经递质谷氨酸导致培养海马星形胶质细胞丝状伪足的形成”神经胶质，第3卷，第2期。5，第322-334页，1990。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
5. 赵宁，徐旭东，蒋勇等，“脂磷脂-2可能通过诱导星形胶质细胞经典活化对脑缺血后损伤作用”，中国神经炎杂志CHINESE，第16卷，第5期。1, 2019。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
6. G. J. Zipfel, D. J. Babcock, J. M. Lee, D. W. Choi，“中枢神经系统损伤后的神经元凋亡:谷氨酸和钙的作用”，神经统治杂志，第十七卷，第二期10，页857-869,2000。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
7. U. Dirnagl, C. Iadecola, M. A. Moskowitz，“缺血性中风的病理生物学:综合观点”，神经科学的趋势第22卷第2期9，第391-397页，1999。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
8. S. A. Liddelow和B. A. Barres，“反应性星形胶质细胞:产生、功能和治疗潜力”，免疫第46卷，第46期6, pp. 957-967, 2017。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
9. Liu Z.和M. Chopp，“星形胶质细胞在缺血性中风中的神经保护和神经恢复的治疗靶点，”神经生物学的进展，第144卷，第103-120页，2016。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
10. E. Pajarillo, A. Rizor, J. Lee, M. Aschner，和E. Lee，“星形细胞谷氨酸转运体GLT-1和GLAST在神经疾病中的作用:神经疗法的潜在靶点”神经药理学，第161卷第107559条，2019年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
11. S.马哈茂德，M. Gharagozloo，C.锡马德和D.格里斯，“星形胶质细胞维持在CNS谷氨酸稳态通过控制谷氨酸吸收和释放之间的平衡，”细胞，第8卷，第2期2，页184,2019。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
12. C. B. Divito和S. M. Underhill，《兴奋性氨基酸转运体:在谷氨酸神经传递中的作用》，国际神经化学， vol. 73, pp. 172-180, 2014。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
13. T.斯托克，S.舒尔特，K.霍夫曼和W.史托菲尔，“结构，表达和中的Na（+）的功能分析 - 依赖性谷氨酸/从大鼠脑天冬氨酸转运，”美国国家科学院的诉讼程序，第89卷，第89期。22，第10955-10959页，1992。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
14. K. P. Lehre, L. M. Levy, O. P. Ottersen, J. Storm-Mathisen, N. C. Danbolt，“大鼠脑中两种胶质谷氨酸转运体的差异表达:定量和免疫细胞化学观察，”神经科学杂志，第15卷，第3卷，第1部分，第1835-1853页，1995。视图:谷歌学术搜索
15. K. Tanaka, K. Watase, T. Manabe等，“缺乏谷氨酸转运体GLT-1的小鼠癫痫和脑损伤加重”科学第276卷第2期5319，第1699-1702页，1997。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
16. L. N.切尔内绍夫，E. D. Maiburd和L. S. Tambulatova，“物理和患者的霍奇金病心理容忍”TerapevticheskiĭArkhiv，第55卷，第55期第9页，134-136页，1983。视图:谷歌学术搜索
17. M. B. Robinson，“钠依赖谷氨酸转运蛋白家族:GLT-1/EAAT2亚型的研究”国际神经化学，卷。33，不。6，第479-491，1998。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
18. P. Karki, A. Webb, A. Zerguine, J. Choi, D. S. Son, E. Lee，“雷洛昔芬诱导大鼠初级星形胶质细胞谷氨酸转运蛋白上调的机制”，神经胶质第62期8, pp. 1270-1283, 2014。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
19. J. M. Decker, L. Krüger, a . Sydow等，“Tau/A152T突变是额颞谱紊乱的危险因素，导致NR2B受体介导的兴奋性毒性，”EMBO报告，第十七卷，第二期4, pp. 552-569, 2016。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
20. V. Lutgen, S. D. Narasipura, A. Sharma, S. Min, L. Al-Harthi，”β-连环蛋白信号正调节星形胶质细胞的谷氨酸摄取和代谢。”中国神经炎杂志CHINESE，第13卷，第2期1，页242,2016。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
21. P.卡尔基，A.韦伯，K. Smith等人，“阴阳1是谷氨酸转运EAAT2的阻遏，并且其介导在星形胶质细胞表达EAAT2的锰诱导的降低，”分子与细胞生物学第34卷第3期7、pp. 1280-1289, 2014。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
22. M. Lazarus, Y. Oishi, T. E. Bjorness，和R. W. Greene，“门控与睡眠需求:腺苷A1和A2A受体的解离效应”，神经科学前沿《中华人民共和国刑法》第13卷第740页，2019年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
23. J. W. Daly, P. Butts-Lamb，和W. Padgett，“中枢神经系统中腺苷受体的亚类:与咖啡因和相关甲基黄嘌呤的相互作用”，细胞与分子神经生物学，第3卷，第2期。1，第69-80页，1983。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
24. A. K. Dixon, A. K. Gubitz, D. J. S. Sirinathsinghji, P. J. Richardson, T. C. Freeman，“大鼠中腺苷受体mrna的组织分布”，英国药理学杂志，第118卷，第118号6，第1461-1468页，1996。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
25. B. B. Fredholm, A. P. IJzerman, K. A. Jacobson, J. Linden, and C. E. Müller，“国际基础和临床药理学联盟”。LXXXI。腺苷受体的命名和分类——更新药理评价，第63卷，第2期1, pp. 1 - 34, 2011。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
26. J. Fastbom和B. B. Fredholm，“l -苯基异丙基腺苷抑制大鼠海马片[3H]谷氨酸释放”，生理学斯堪的纳维亚，第125卷，第5期1，页121-123,1985。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
27. F. Ciruela, V. Casadó， R. J. Rodrigues等，“腺苷A对纹状体谷氨酸神经传递的突触前控制₁——一个_2A受体heteromers。”神经科学杂志第26卷第2期7, pp. 2080-2087, 2006。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
28. E. M. O’kane和T. W. Stone，“体外大鼠海马中腺苷A1和A2受体介导的反应之间的相互作用”欧洲药理学杂志，第362卷，第2期1，页17-25,1998。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
29. S.费雷，F. Ciruela，J. Borycz等人，“腺苷A1-A2A受体杂聚：对于大脑中咖啡因的新目标，”。生命科学前沿，第13卷，第2391-2399页，2008。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
30. S. Cristóvão-Ferreira, G. Navarro, M. Brugarolas et al.，“A₁R-甲_2AR异构体与G耦合_年代和G_{i / 0}蛋白质调节伽马氨基丁酸转运到星形胶质细胞，”Purinergic信号，第9卷，第5期。3, pp. 433-449, 2013。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
31. L. V. Lopes, R. A. Cunha, J. A. Ribeiro， " A₁和一个_2A年轻成年鼠和老年鼠海马和皮质中的腺苷受体，神经生理学杂志，卷。82，没有。6，第3196-3203，1999。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
32. J. F. Chen, P. K. Sonsalla, F. Pedata et .， "腺苷A_2A受体和脑损伤：神经保护作用的广谱性，多方面的行动和“微调”调制”神经生物学的进展，第83卷，第83期5，页310-331,2007。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
33. Li w, S. Dai, J. An et al.，“腺苷A2A受体的基因失活减弱小鼠皮层撞击模型的急性创伤性脑损伤，”实验神经学第215卷第1期1，第69-76页，2009。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
34. J. A. Ribeiro, A. M. Sebastiao, and A. de Mendonca，《神经系统中的腺苷受体:病理生理学意义》，神经生物学的进展第68卷第2期6，第377-392页，2002。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
35. R. Ciccarelli, I. D'Alimonte, P. Ballerini et al.，“分子信号介导A₁腺苷和mGlu3代谢性谷氨酸受体激活对氧/葡萄糖剥夺培养星形胶质细胞凋亡的影响分子药理学，第71卷，第71期5, pp. 1369-1380, 2007。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
36. 周明明，李文斌，李庆军，刘慧卿，冯瑞芳，赵宏光，“短时间脑缺血预处理对大鼠海马CA1区腺苷受体的调节作用，”神经科学研究，第48卷，第48期4，页397-404,2004。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
37. T.五Dunwiddie和S. A.马西诺，“在中枢神经系统中的作用和腺苷调节，”神经科学年刊，第24卷，第31-55页，2001。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
38. S. Schildge, C. Bohrer, K. Beck和C. Schachtrup，“小鼠皮质星形胶质细胞的分离和培养”，可视化实验杂志,没有。71, article e50079, 2013。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
39. “阻断Notch信号通路抑制脊髓损伤后神经毒性A1星形胶质细胞的活化，”细胞周期第18卷第2期21，第3010-3029页，2019。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
40. S. Duan, C. M. Anderson, B. A. Stein，和R. A. Swanson，“谷氨酸诱导星形胶质细胞谷氨酸转运和GLAST细胞表面表达的快速上调，”神经科学杂志第19卷第2期23, pp. 10193 - 10200,1999。视图:谷歌学术搜索
41. W.白，李P.，Y L.宁等人，“腺苷_2A受体抑制可以恢复大脑中内皮谷氨酸转运体的正常运输。”生物化学与生物物理研究通讯号，第498卷。4, pp. 795-802, 2018。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
42. Y. J.日，L.黄，H.叶，J.林登和M. D. Okusa，“肾缺血再灌注损伤和腺苷A2A受体介导的组织保障：巨噬细胞的作用，”美国生理学-肾生理学杂志号，第288卷。4，页F722-F731, 2005。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
43. C. Romera, O. Hurtado, J. Mallolas等，“缺血预处理揭示GLT1/EAAT2谷氨酸转运体是参与神经保护的一种新的PPARgamma靶基因。”杂志脑血流与代谢，卷。27，不。7，第1327-1338，2007年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
44. “HDAC1/HDAC3调节PPARG2在肝脏脂肪生成中通过糖基化CEBPD的转录，”生物化学与生物物理学报-分子细胞研究年第1783卷第1期10，页1803-1814,2008。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
45. J. P. Vilardaga, L. F. Agnati, K. Fuxe，和F. Ciruela，“g蛋白偶联受体异构体动力学”，细胞科学杂志， vol. 123, Part 24, pp. 4215 - 4220,2010。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
46. M. Chabre, P. detree，和B. Antonny，“某些GPCRs的明显协同性并不一定意味着二聚作用，”药理学趋势，第30卷，第2期4，第182-187页，2009。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
47. W. Guo, E. Urizar, M. kalikova等人，“多巴胺D2受体在生理表达水平上形成更高阶的低聚体。”在EMBO杂志，卷。27，不。17，页。2293年至2304年，2008年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
48. G蛋白偶联受体异二聚化:对药理学和功能的贡献英国药理学杂志第158卷第1期1，第5-14页，2009。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
49. S. Terrillon和M.布维尔，“G蛋白偶联受体二聚化中的作用，”EMBO报告，第5卷，第5期。1，页30-34,2004。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
50. p . S. C. Prinster, C. Hague, R. A. Hall，“g蛋白偶联受体的异源二聚化:特异性和功能意义”，药理评价(第57卷)3，页289-298,2005。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
51. S.Ferré的，F. Ciruela，C.基罗斯等人，“腺苷受体异聚和纹状体功能其整合作用，”ScientificWorldJournal，第7卷，第829039条，第74-85页，2007。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
52. J. Wu, M. R. Lee, T. Kim等，“星形胶质细胞中通过腺苷A1受体调控乙醇敏感的EAAT2表达”，生物化学与生物物理研究通讯号，第406卷。1, pp. 47-52, 2011。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
53. J. Berger和D. E.莫勒，“PPAR的作用机制，”医学年度审查，第53卷，第409-435页，2002。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
54. L. Szeles, D. Torocsik, L. Nagy，“PPARγ在免疫和炎症中:细胞类型和疾病生物化学与生物物理学报(BBA) -脂类分子和细胞生物学，第1771卷，第2期8, pp. 1014-1030, 2007。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
55. M. Ahmadian, J. M. Suh, N. Hah等，“PPARγ信号和新陈代谢:好的、坏的和未来。”自然医学第19卷第2期5, pp. 557-566, 2013。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
56. K. Tureyen, R. Kapadia, K. K. Bowen等，“过氧化物酶体增殖物激活的受体-激动剂在正常血压、正常血糖以及高血压和2型糖尿病啮齿动物短暂局性缺血后诱导神经保护，”神经化学杂志，第101卷，第1期。1，页41-56,2007。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
57. J. Ching, S. amirridis, S. S. styli等，“过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂吡格列酮增加人胶质母细胞瘤细胞中谷氨酸转运体兴奋性氨基酸转运体2 (EAAT2)的功能性表达”Oncotarget，第6卷，第2期25, pp. 21301-21314, 2015。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
58. Z.邓，曹P.，M. M.万和G穗，“阴阳1：多方面的蛋白质以外的转录因子”转录， vol. 1, no. 12，页81-84,2010。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
59. S. Gordon, G. Akopyan, H. Garban和B. Bonavida，“转录因子YY1:结构、功能和在癌症生物学中的治疗意义”，致癌基因，第25卷，第2期8，页1125-1142,2006。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
60. F. H.威尔金森，K.公园和M. L.艾奇逊，“梳募集到DNA在体内由YY1 REPO结构域”，美国国家科学院的诉讼程序号，第103卷。51，页19296-19301,2006。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
61. M. Wan, W. Huang, T. E. Kute et al，“阴阳1在乳腺癌中起重要作用并负调控p27，”美国病理学杂志，第180卷，第1期。5, pp. 2120-2133, 2012。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
62. D. Chinnappan，D.肖，A. Ratnasari，C.安德里，T. C. King和H. C.韦伯，“在人胃肠癌细胞转录因子YY1表达式中，”国际肿瘤学杂志第34卷第3期5，第1417-1423页，2009。视图:谷歌学术搜索
63. “阴阳1号在病毒感染过程中动态调节抗病毒固有免疫反应”，“阴阳1号在病毒感染过程中动态调节抗病毒固有免疫反应”，细胞生理学与生物化学，卷。44，不。2，第607-617，2017。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
64. Y.他和P. casacia - bonnefil，《y1在神经系统中的阴阳》，神经化学杂志，卷。106，没有。4，第1493至1502年，2008年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
65. S. Rosas, M. a . Vargas, E. Lopez-Bayghen和a . Ortega，“GLAST/EAAT1谷氨酸依赖的转录调控:YY1的作用”，神经化学杂志，第101卷，第1期。4，页1134-1144,2007。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
66. G. Aguirre, S. Rosas, E. Lopez-Bayghen和A. Ortega，“丙戊酸盐依赖的GLAST/EAAT1表达的转录调控:与Ying-Yang 1有关”国际神经化学号，第52卷。7，第1322-1331页，2008。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
67. P. Karki, C. Kim, K. Smith, D. S. Son, M. Aschner, E. Lee，“星形细胞兴奋性氨基酸转运体1 (EAAT1)通过NF-的转录调控κB和阴阳1（YY1），”生物化学杂志第290期39, pp. 23725-23737, 2015。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
68. 问：张D. B.斯托维尔，K.井上和G穗，“阴阳1的致癌作用，”肿瘤发生的关键评论，第16卷，第5期。3-4，第163-197，2011。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
69. W. M. Yang, C. Inouye, Y. Zeng, D. Bearss, E. Seto，“YY1的转录抑制是通过与酵母整体调控因子RPD3的哺乳动物同源物相互作用介导的”，美国国家科学院的诉讼程序，卷。93，没有。23，第12845-12850，1996。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
70. M.珠，J.G。莱特，N. N. Hu等人，“阴阳1个增强环氧合酶-2在巨噬细胞的基因表达，”美国生理学杂志-肺细胞和分子生理学，卷。292，没有。5，第L1219-L1226，2007年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索

版权

版权所有©2020侯先华等人。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。