PPAR PPAR研究 1687 - 4765 1687 - 4757 Hindawi 10.1155 / 2020/2410264 2410264 研究文章 腺苷受体A1-A2a Heteromers调节EAAT2表达和谷氨酸摄取通过YY1-Induced PPAR的镇压 γ转录 侯 酰化 李 元 黄 渊源 赵 黄ydF4y2Ba https://orcid.org/0000 - 0002 - 7841 - 7223 Gui 李 画了 保罗D。 神经学部门 西南医院 第三军医大学(军队医科大学) 重庆400038 中国 tmmu.edu.cn 2020年 6 3 2020年 2020年 12 10 2019年 23 01 2020年 6 3 2020年 2020年 版权©2020酰化后et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

腺苷A1受体(A1AR)和负责(A2aAR)起着重要的作用在调节谷氨酸摄取谷氨酸以避免积累引起会引起大脑中;然而,A1AR和A2aAR的确切机制尚不清楚。在此,我们报告的表达A1AR星形胶质细胞的蛋白质膜和胞内谷氨酸水平的下降,而表达A2aR蛋白质在细胞暴露于高oxygen-glucose剥夺(OGD)条件。Coimmunoprecipitation (Co-IP)实验表明,A1AR OGD条件下与A2aAR交互。A1AR的激活和失活的A2aAR 2-chloro-N6-cyclopentyladenosine (CCPA)和SCH58251,分别在一定程度上逆转OGD-mediated谷氨酸吸收功能障碍,高架EAAT2, PPAR γ蛋白质含量,抑制的表达应杨1 (YY1)。YY1的沉默和PPAR的激活 γ调节EAAT2表达式。此外,YY1沉默PPAR升高 γ在正常和OGD条件下水平。组蛋白脱乙酰酶(HDAC) 1被发现与YY1交互,和HDAC1沉默PPAR的改善 γ启动子活动。综上所述,我们的研究表明,A1AR-A2aAR heteromers调节EAAT2表达和谷氨酸摄取PPAR HDAC1 YY1-mediated招聘的 γ启动子区域。

 军事医学科技创新项目 SWH2017YBXM-15 中国国家自然科学基金 81601025 81371274 1。介绍

缺血性中风,中风的最常见的亚型,严重威胁公众健康在中国,每年有250万新中风病例报道和高死亡率( 1, 2]。星形胶质细胞的接触oxygen-glucose剥夺(OGD)条件诱发障碍谷氨酸间隙和炎性介质的释放,导致excitotoxic在缺血性神经元死亡过程( 3- - - - - - 7]。因此,星形胶质细胞,最丰富的胶质细胞类型,发挥着至关重要的作用在缺血性中风的病理过程 8,恢复在星形胶质细胞谷氨酸间隙函数是神经保护治疗方法在缺血性中风 9]。

快速细胞外谷氨酸间隙的星形胶质细胞的作用取决于兴奋性氨基酸转运蛋白(EAATs),也称为谷氨酸转运蛋白(大规模)[ 10, 11]。EAAT家族包含五个亚型:EAAT1, EAAT2, EAAT3, EAAT4, EAAT5 [ 12]。研究表明,EAAT1和EAAT2主要是星形胶质细胞表达,EAAT3 EAAT4, EAAT5位于神经元( 13, 14]。特别是,EAAT2,大脑中最丰富的过剩 15),在细胞外谷氨酸的吸收中起着重要作用[ 16- - - - - - 18]。几项研究已经报道,EAAT2的表达抑制脑组织中患有神经系统疾病,包括缺血、锰中毒,和阿尔茨海默病(AD) [ 10]。进一步的研究报道,EAAT2 / GLT1表达调控在转录和翻译水平通过一个复杂的机制,涉及因素如PI3K-Akt [ 19),NF - κB ( 20.),表观遗传修饰组蛋白脱乙酰酶(HDAC) I和II [ 21]。然而,EAAT2监管的机制尚未完全阐明。

腺苷受体(AR)的成员G protein-coupled受体(GPCR)总科,由四个AR亚型:腺苷A1受体(A1AR)、腺苷受体负责(A2aAR) A2bAR, A3AR [ 22]。特别是A1AR和A2aAR高度表达在脑组织和腺苷(有一个高度的亲和力 23, 24]。腺苷结合A1AR A2aAR然后启动一些生物过程,如谷氨酸释放的规定( 25, 26]。研究人员发现,A1AR和A2aAR coexpressed 61%的皮质突触前终端glutamatergic纹状体神经元,尾状核和海马 27, 28]。最近,Cristovao-Ferreira等人证明A1AR和A2aAR与细胞表面( 28- - - - - - 30.]。进一步的研究表明,A1AR可能与A2aAR形成A1AR-A2aAR heteromers。A2aAR的激活可以抑制A1AR-mediated独有的生物反应( 31日]。在缺血性中风,激活A2aAR腺苷提升了细胞内的高浓度谷氨酸水平,加剧神经损伤( 32, 33),而腺苷——或者制药agonist-induced激活A1AR已被证明发挥保护性作用下缺血( 34, 35];A1AR激活减少谷氨酸释放和促进缺血性耐受( 36, 37]。然而,是否与A2aAR A1AR密切相互作用形成A1AR-A2aAR heteromers和A1AR-A2aAR heteromers在缺血性中风在很大程度上是未知的。

鉴于星形胶质细胞的主要功能谷氨酸间隙的规定,目前工作的第一个目的是澄清是否OGD诱发A1AR-A2aAR heteromer形成和调节星形胶质细胞谷氨酸摄取。此外,我们探讨了小说机制A1AR-A2aAR heteromers调节EAAT2表达与星形胶质细胞谷氨酸摄取。

2。方法和材料 2.1。材料和试剂

DMEM(高葡萄糖或没有葡萄糖),Opti-MEM™降低血清培养基(Opti-MEM),胎牛血清(的边后卫)和trypsin-EDTA(0.25%)来自Gibco(上海,中国)。Anti-A1AR抗体,A2aAR、GFAP、S100 β,anti-PPAR γ抗体、谷氨酸测定工具包和2-chloro-N6-cyclopentyladenosine (CCPA)从Abcam购买,Inc .(上海,中国)。Anti-EAAT2抗体,抗- α/ β微管蛋白抗体,抗- β肌动蛋白抗体,杨anti-Ying 1 (YY1)抗体购自细胞信号技术,Inc .蛋白质A / G +琼脂糖是购自圣克鲁斯生物技术有限公司(上海,中国)。CCPA、SCH58261 CGS21680买来谢立克,Inc .(上海,中国)。HRP-goat anti-rabbit免疫球蛋白(H + L), HRP-goat anti-mouse免疫球蛋白(H + L), Alexa萤石®488 -山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)和Alexa萤石®594 -山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)被命令从杰克逊ImmunoResearch Inc .(费城,美国)。GoTaq®qPCR大师,一个荧光素酶报告基因检测装备,GoScript™RT混合,和FuGENE®高清转染试剂购自Promega生物技术有限公司,有限公司(中国,北京)。T-PER™组织蛋白质提取试剂和Mem-PER™+工具包是购自热费舍尔有限公司有限公司(上海,中国)。止动剂西方化学发光合衬底(ECL工具包)购买从默克密理博有限公司有限公司(上海,中国)。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购买通用电气有限公司(德国)。试剂盒试剂和其它试剂购买和用作收到Sigma-Aldrich(上海,中国)。材料和试剂的细节都显示在补充文件(可用 在这里)。

2.2。老鼠主要星形胶质细胞文化和OGD治疗

分离、培养初级皮层星形胶质细胞根据以前的报告( 38]。短暂,老鼠幼崽被斩首牺牲使用剪刀。皮质半球分离细钳,然后切成小块胰蛋白酶化在37°C水浴30分钟。皮层组织块分离成单细胞悬液,在培养瓶培养。文化7 - 8天后,小胶质细胞和少突细胞前体细胞都被震动。星形胶质细胞后被用于进一步研究他们的文化一个附加的6天。

对于OGD治疗,培养基被删除,星形胶质细胞与PBS洗两次。Glucose-free DMEM被加入到培养瓶,O和星形胶质细胞暴露于1%<年代ub>26 h。

2.3。免疫荧光分析

主要星形胶质细胞与4%甲醛固定15分钟,用PBS洗。这些样本被封锁在5%正常山羊血清1 h RT和孵化anti-GFAP或anti-S100B抗体在一夜之间在4°C。与PBS洗了三次后,样本孵化与Alexa萤石®488 -山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)或Alexa萤石®594 -山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L) 1 H rt,细胞核被沾diamidino-phenylindole (DAPI)。

2.4。Coimmunoprecipitation (Co-IP)和免疫印迹

Co-IP和西方墨点法进行根据一项研究[ 39]。简单,治疗细胞收获然后离心机14000×g和4°C,持续15分钟。上层清液被转移到新管和孵化anti-A1AR抗体(1:50)或anti-YY1抗体(1:50)一夜之间蛋白质A / G为2 h琼脂糖珠4°C。解决方案被西方墨点法然后评估。

2.5。谷氨酸摄取试验

谷氨酸摄取试验,对星形胶质细胞中被丢弃,细胞被洗D-Hank的解决方案。细胞与300 nM preincubated谷氨酸7分钟,和谷氨酸摄取终止了冰冷的汉克的解决方案,其次是直接使用谷氨酸化验分析设备( 40, 41]。胞内谷氨酸水平进行了分析使用谷氨酸测定工具包(比色)根据制造商的指示。短暂,收集治疗细胞和培养基,细胞resuspended分析缓冲区。这些样品是孵化对冰和离心5分钟30分钟在4°C。收集上清液,反应混合物添加和孵化样本。样品测定的吸光度值在450海里。

2.6。EYFP-A1AR质粒,A2aAR核、YY1 siRNA和HDAC1核转染

pcDNA3.1 / opto-a1AR-EYFP礼物卡尔戴瑟罗斯(Addgene质粒# 20947)。A2aAR和YY1 siRNA从GenePharma购买(上海,中国)。A2aAR siRNA的序列是5 ′ -AAACTTCTTCGTGGTATCTCT-3 ′ ( 42]。YY1 siRNA的序列是5 ′ -TTGTTCAATGTAGTCGTCG-3 ′ 小干扰rna序列和HDAC1 5 ′ -GTTGGAAGAGTTCTTCGGG-3 ′ 。星形胶质细胞培养在6-well盘子,和2 μ克的小干扰rna被用来使转染质粒或200海里星形胶质细胞使用FuGENE®高清转染试剂48 h。细胞治疗被用于进一步的研究。

2.7。荧光素酶检测

PPAR的启动子区域 γ合成和插入到pXPG质粒,这是彼得的礼物Cockerill (Addgene质粒# 71248)。这个质粒和pRL Renilla荧光素酶控制记者向量cotransfected到293 T细胞。荧光素酶检测进行了根据制造商的协议。

2.8。统计分析

至少三个独立实验的数据表示为 的意思是 ± 标准 错误 (S.E.)。单向方差分析(方差分析)和学生的 t 以及。 p < 0.05 显示统计上显著的差异。

 3所示。结果 3.1。OGD A1AR监管和A2aAR表情

星形胶质细胞中扮演重要角色占用过多的谷氨酸,避免会引起神经元( 11]。在此,我们孤立和培养小鼠初级皮层星形胶质细胞(图 1(一))。免疫染色表明,S100B和GFAP,星形胶质细胞标记,强烈表达了在这些细胞的细胞质(图 1 (b))。OGD可以用来开发一个体外脑缺血模型。在我们的研究中,星形胶质细胞在OGD 1 h和6 h。免疫印迹显示A1AR的表达在细胞表面后减少OGD治疗,而A2aAR蛋白质含量升高。此外,EAAT2蛋白的表达也减少后细胞暴露于OGD(图 1 (c))。有趣的是,Co-IP试验表明,OGD提升A1AR和A2aAR(图之间的交互 1 (d))。此外,细胞内谷氨酸水平明显下降后细胞受到OGD 1和6 h比0 h ( p < 0.05 )(图 1 (e))。这些数据表明,A1AR与A2aAR形成A1AR-A2aAR异质二聚体参与的规定EAAT2表达和谷氨酸摄取。

OGD提升与A2aAR A1AR星形胶质细胞之间的相互作用。主要(a)正常星形胶质细胞形态学观察显示了通过相差显微镜检查和上层(×100)和低(×200)板。(b)星形胶质细胞被免疫荧光试验确定。S100b的阳性表达(红色)和GRAFP(绿色)星形胶质细胞的抗原是由免疫荧光(×200)。核与DAPI染色(蓝色)。星形胶质细胞暴露在OGD条件表示。(c)的蛋白表达A1AR, A2aAR, EAAT2被西方墨点法评估。(d) Co-IP分析被用来评估A1AR之间的交互和A2aAR。(e)使用谷氨酸测定细胞内谷氨酸含量检测设备。数据代表 意味着 ± 年代 。 E 。 n = 3 。 ∗ p < 0.05 与0 h组和<年代up>^ p < 0.05 与1 h组。数据表示的 意味着 ± 年代 。 E 。 ( n = 3 )。

 3.2。A1AR A2aAR监管EAAT2的表达和谷氨酸摄取

我们探索A1AR的角色和A2aAR EAAT2的规定和谷氨酸摄取。的激活与CCPA A1AR A2aAR的失活与SCH58261 EAAT2蛋白水平升高在星形胶质细胞OGD条件(图 2(一个))。同样,相比仅在集团OGD,细胞内谷氨酸含量增加OGD / CCPA OGD / SCH58261, OGD / CCPA + SCH58261组( p < 0.05 )。有趣的是,谷氨酸水平更高的OGD / CCPA + SCH58261组比OGD / CCPA集团( p < 0.05 )(图 2 (b))。此外,EAAT2的表达和谷氨酸水平没有显著增加OGD / CGS21680 + CCPA组与组仅在OGD ( p > 0.05 )(数据 2 (c)和 2 (d))。这些数据表明,A1AR激活和A2aAR失活可以提升EAAT2的表达,改善在星形胶质细胞谷氨酸摄取OGD条件。进一步确认的角色A1AR和A2aAR EAAT2表达式的规定,与小干扰rna(图A2aAR A2aAR被撞倒了 2 (e))。EAAT2蛋白质和细胞内的水平在A2aAR-silenced细胞谷氨酸增加OGD相比单独细胞受到OGD ( p < 0.05 )(数据 2 (f)和 2 (g))。同样,由EYFP-A1AR A1AR被迫表达质粒的差别部分逆转OGD-mediated对这些EAAT2表达和谷氨酸摄取受损(数字 2 (h)- - - - - - 2 (j))。这些数据表明,A2aAR与A1AR和形式A1AR / A2aAR异质二聚体,导致A1AR的抑制活动并通过抑制谷氨酸摄取EAAT2表达式。

A1AR / A2aAR异质二聚体监管EAAT2和谷氨酸摄取的表达。星形胶质细胞受到OGD没有条件或存在30 nM CCPA (A1AR受体激动剂)和200 nM SCH58261 (A2aAR拮抗剂)。(a, b) EAAT2的表达和细胞内谷氨酸水平检测到免疫印迹或谷氨酸化验设备,分别。数据表示的 意味着 ± 年代 。 E 。 ( n = 3 )。 ∗ p < 0.05 与对照组;<年代up>^ p < 0.05 与OGD组;<年代up># p < 0.05 与OGD / CCPA组。星形胶质细胞受到OGD条件没有或30 nM CCPA和200 nM CGS21680 (A2aAR受体激动剂)。(c, d) EAAT2的表达和细胞内谷氨酸水平检测到免疫印迹或谷氨酸化验设备,分别。数据表示的 意味着 ± 年代 。 E 。 ( n = 3 )。 ∗ p < 0.05 与对照组。(e)的蛋白质含量A2aARafter A2aAR siRNA成星形胶质细胞的转染48 h被西方墨点法评估。A2aAR-silenced星形胶质细胞受到OGD条件没有或30 nM CCPA的存在。(f, g) EAAT2的表达和细胞内谷氨酸水平检测到免疫印迹或谷氨酸化验设备,分别。数据表示的 意味着 ± 年代 。 E 。 ( n = 3 )。 ∗ p < 0.05 与对照组和 ∧ p < 0.05 与OGD组。(h)的蛋白质水平A1AR EYFP-A1AR质粒转染后为48 h星形胶质细胞被西方墨点法评估。星形胶质细胞与EYFP-A1AR质粒转染48 h,然后受到OGD条件没有或200海里SCH58261的存在。(i, j) EAAT2的表达和细胞内谷氨酸水平检测到免疫印迹或谷氨酸化验设备,分别。数据表示的 意味着 ± 年代 。 E 。 ( n = 3 )。 ∗ p < 0.05 与对照组;<年代up>^ p < 0.05 与OGD组;<年代up># p < 0.05 与OGD / EYFP-A1AR组。

 3.3。PPARγ<斜体> < /斜体>调节谷氨酸EAAT2所吸收

然后,我们评估是否PPAR γ调节EAAT2的表达和谷氨酸摄取。星形胶质细胞是使用罗格列酮(显示),PPAR γ受体激动剂和受到OGD。PPAR γ激活增加EAAT2的表达和细胞内谷氨酸水平相比仅在集团OGD(数字 3(一个)和 3 (b))。这些数据表明PPAR γ能促进EAAT2和减弱OGD-impaired谷氨酸摄取的表达。我们进一步研究是否A1AR / A2aAR异质二聚体调节PPAR γ表达式。图 3 (c)表明,PPAR的表达 γ增加时,星形胶质细胞与CCPA preincubated SCH58261然后对待OGD相比,星形胶质细胞治疗OGD孤单。A2aAR沉默PPAR的水平升高 γ在文化OGD没有或存在CCPA(图 3 (d))。此外,GW9962, PPAR的抑制剂 γ增加,废除了CCPA——SCH58261-induced EAAT2表达式OGD条件下(数字 3 (e)和 3 (f))。这些结果表明,A1AR / A2aAR异质二聚体调节通过PPAR EAAT2水平 γ。

PPAR γ规范的表达EAAT2并从星形胶质细胞谷氨酸释放。(a, b) EAAT2蛋白质和细胞内星形胶质细胞谷氨酸水平下OGD缺席或者1的存在 μM罗格列酮被免疫印迹检测或谷氨酸化验设备,分别。数据代表 意味着 ± 年代 。 E 。 ( n = 3 )。 ∗ p < 0.05 与对照组和<年代up>^ p < 0.05 与OGD组。(c)免疫印迹分析PPAR的表达 γ在星形胶质细胞治疗30 nM CCPA和200海里SCH58261暴露OGD 6 h。d .的PPAR γ蛋白质含量与A2aAR siRNA星形胶质细胞转染48 h在被接受之前OGD条件与30 nM CCPA评估。(e, f)表达的免疫印迹分析EAAT2在星形胶质细胞对30 nM CCPA或200海里SCH58261 30的存在 μM GW9662,紧随其后的是接触OGD 6 h。

 3.4。A1AR / A2aAR异质二聚体监管YY1的表达

在这项研究中,我们发现YY1蛋白质的表达,转录因子,增加(图 4(一))在星形胶质细胞被置于OGD条件。进一步研究表明,YY1减少当星形胶质细胞的表达与CCPA preincubated SCH58261然后放在OGD条件相比,OGD(图 4 (b))。此外,在A2aAR-silenced文化YY1 OGD的表达没有或存在CCPA减毒(图 4 (c))。这些数据表明,A1AR / A2aAR异质二聚体调节YY1表达式。图 4 (d)表明YY1 siRNA撞倒YY1蛋白质水平。YY1沉默提升EAAT2的表达在细胞在正常和OGD条件下(图 4 (e))。谷氨酸摄取试验表明,YY1沉默OGD条件下细胞内细胞的谷氨酸水平增加(图 4 (f)),这表明YY1沉默可以减弱OGD-impaired谷氨酸摄取。

A1AR / A2aAR异质二聚体通过YY1监管EAAT2表达式。星形胶质细胞(a) YY1蛋白水平下OGD 1 h和6 h条件评估。(b)的免疫印迹分析YY1表达在细胞治疗30 nM CCPA和200海里SCH58261暴露OGD 6 h。(c) YY1蛋白水平与A2aAr siRNA星形胶质细胞转染48 h,紧随其后的是30 nM CCPA接触OGD条件,评估。PPAR的表达 γ和YY1对待星形胶质细胞被西方墨点法评估。(d) YY1蛋白转染后YY1 siRNA成星形胶质细胞48 h被西方墨点法评估。YY1-silenced星形胶质细胞受到OGD条件没有或30 nM CCPA的存在。(e, f)的表达YY1 EAAT2和胞内谷氨酸水平检测到免疫印迹或谷氨酸化验设备,分别。数据代表 意味着 ± 年代 。 E 。 ( n = 3 )。 ∗ p < 0.05 与NC组和<年代up>^ p < 0.05 与OGD / NC组。

 3.5。HDAC1招聘由YY1压抑PPARγ<斜体> < /斜体>

上述结果表明,YY1和PPAR γ可以调节EAAT2的表达;然而,YY1和PPAR之间的关系 γ是未知的。我们发现YY1沉默PPAR的水平升高 γ在细胞在正常和OGD条件下(图 5(一个))。此外,HDAC1的表达增加后OGD挑战(图 5 (b))。进一步研究表明,OGD提升YY1和HDAC1(图之间的交互 5 (c)下),这表明YY1可以招募HDAC1 OGD条件。荧光素酶分析表明,HDAC1沉默显著提升PPAR γ推广活动(数据 5 (d)和 5 (e))。这些数据表明,抑制PPAR HDAC1 YY1新兵 γ启动子活性OGD条件下,导致EAAT2表达式的镇压和星形胶质细胞谷氨酸摄取。

YY1监管PPAR γHDAC1。(一)PPAR γ蛋白质含量在星形胶质细胞转染YY1 siRNA 48 h,然后暴露于OGD 6 h是评估。(b)的蛋白质水平在星形胶质细胞暴露于OGD HDAC1 6 h测量。(c)。Co-IP分析被用来评估YY1之间的交互和HDAC1。(d)的蛋白质水平在星形胶质细胞转染HDAC1 HDAC1 siRNA 48 h被西方墨点法评估。PPAR (e)荧光素酶检测评估 γ启动子活动293 T细胞转染HDAC siRNA 48 h,然后暴露于OGD 6 h。数据表示的 意味着 ± 年代 。 E 。 ( n = 3 )。 ∗ p < 0.05 与NC组和<年代up>^ p < 0.05 与NC / OGD组。

 4所示。讨论

应力诱导homo-oligomeric的形成和hetero-oligomeric GPCR复合物可能中断的功能A1AR或A2aAR [ 31日]。这里,我们发现OGD提拔的形成A1AR-A2aAR heteromers A1AR的激活或失活A2aAR减毒OGD-mediated EAAT2抑制谷氨酸和吸收功能障碍。PPAR γ可以调节EAAT2-mediated谷氨酸摄取[ 43]。因此,我们调查是否A1AR-A2aAR heteromers监管通过PPAR EAAT2 γ。这些数据显示,A1AR / A2aAR A1AR异质二聚体的激活或失活的A2aAR减毒OGD-mediated抑制PPAR γ抑制,导致升降胞内谷氨酸水平。接下来,我们进一步研究的机理A1AR-A2aAR heteromers控制通过PPAR EAAT2 γ。鉴于YY1可能抑制EAAT2的表达 21),是调节目标基因的转录因子,如PPAR γ( 44]。我们进行实验,表明YY1隐含的表达EAAT2通过招聘HDAC1 PPAR γ启动子区域。这些数据表明A1AR-A2aAR heterodimerization EAAT2表达和调节谷氨酸通过YY1-induced招聘HDAC1 PPAR的吸收 γ启动子区域。

GPCRs,比如A1AR A2aAR,检测和传输细胞外物质进入细胞并激活下游信号,导致生理和病理反应的起始 45]。一般来说,GPCRs单体的存在和功能的细胞表面受体( 46]。然而,最近的研究显示homo-oligomeric和hetero-oligomeric GPCR复合物在培养细胞表面的 47, 48]。这些人类/形成监管可能以不同的方式,如通过受体激动剂/拮抗剂。特别是,GPCR的功能形成,包括它们的药理特性和激活,可能比GPCR明显不同单体( 49, 50]。几项研究表明,A2aAR A1AR互动和二聚化海马和皮质突触体 28, 29日, 51]。此外,A2aAR在这种异质二聚体可以减少A1AR的亲和力的受体激动剂( 28]。在目前的研究中,OGD促进与A2aAR A1AR星形胶质细胞之间的相互作用和抑制EAAT2和谷氨酸摄取的表达。先前的研究表明,激活谷氨酸A2aAR也受损间隙( 33)的激活A1AR缺血中发挥保护作用[ 34, 35, 52]。因此,我们怀疑OGD诱发A1AR-A2aAR heterodimerization, A2aAR激活抑制A1AR-mediated EAAT2表达的调节。进一步研究表明,A1AR激活和A2aAR失活提高了OGD-mediated EAAT2蛋白质水平和减少谷氨酸摄取受损。有趣的是,A2aAR受体激动剂预处理阻塞A1AR activation-induced EAAT2表达和谷氨酸摄取的变化。这些数据证明OGD介导A1AR-A2aAR heterodimerization抑制A1AR的活动,导致通过抑制谷氨酸摄取受损EAAT2表达式。

PPAR γ,一个配体依赖性转录因子核受体超家族的成员,调节基因转录的绑定过氧物酶体扩散国的反应元素(ppr)在目标基因的启动子区域 53]。激活PPAR γ在免疫中起着至关重要的作用,炎症 54),和新陈代谢 55]。最近,Tureyen等人表明,PPAR的激活 γ显示抑制炎症反应,降低梗死体积和神经赤字在大脑中动脉阻塞(MCAO)模型大鼠( 56]。京和他的同事们研究发现,细胞外谷氨酸被PPAR控制的水平 γ活动在U87MG和U251MG细胞( 57]。另一项研究表明,PPAR γ具有神经保护作用,移植EAAT2星形胶质细胞(子活动 43]。与先前的报道一致,PPAR γ能够促进EAAT2的表达和减弱OGD-impaired谷氨酸摄取。我们发现A1AR的激活和失活A2aAR可能增加PPAR的水平 γ在星形胶质细胞暴露于OGD条件。这些数据表明,A1AR / A2aAR heteromers控制EAAT2水平,通过调节PPAR谷氨酸摄取 γ表达式。

YY1、转录因子调节多个蛋白参与细胞增殖和分化,细胞凋亡,染色质重塑在各种细胞类型( 58- - - - - - 63年]。最近的研究显示,YY1中起关键作用的神经发展,神经功能,发展髓鞘形成,和神经系统疾病( 64年]。Aguirre等人,罗萨斯等人发现,YY1压制过剩(GLAST) / EAAT1表达式通过绑定其启动子在小鸡胶质细胞( 65年, 66年]。进一步的研究还表明,YY1负调节EAAT1和EAAT2表达在大鼠星形胶质细胞( 21, 67年]。符合上述文件,在我们的研究中,OGD诱导YY1表达式,YY1沉默EAAT2蛋白水平升高和减毒OGD-impaired老鼠星形胶质细胞谷氨酸摄取。有趣的是,YY1的表达是通过A1AR的激活或抑制A2AR的失活。这些数据表明,OGD-mediated A1AR / A2aAR heteromers上调YY1表达式,YY1压制EAAT2表达式和损害后谷氨酸。

先前的研究已经报道,YY1调节许多基因在转录水平( 68年]。YY1被发现的负监管效果依赖于hdac,一种组蛋白去乙酰酶抑制剂( 69年, 70年]。我们的结果表明,OGD诱导HDAC1的表达,这与YY1互动。Romera等人表明,suCEBPD / HDAC1 HDAC3复杂灭活PPARG2转录在adipocyte-like脂肪生成HepG2细胞( 43]。在此,我们还发现YY1或HDAC1沉默PPAR升高 γ水平细胞在正常和OGD条件和HDAC1击倒PPAR可能会受到抑制 γOGD条件下推广活动。这些数据表明,抑制PPAR HDAC1 YY1新兵 γOGD条件下推广活动。

综上所述,这些结果显示的机械模型A1AR-A2aAR heterodimerization-mediated EAAT2表达和调节谷氨酸通过YY1-induced招聘HDAC1 PPAR的吸收 γ启动子区域。在这个模型中,OGD促进A1AR-A2aAR异质二聚体的形成。这个复杂的提升YY1蛋白质水平,压制EAAT2表达式,削弱了谷氨酸的星形胶质细胞。可以部分抵消这些影响A2aAR A1AR的激活或失活。此外,YY1抑制EAAT2的表达通过招聘HDAC1 PPAR γ启动子区域(图 6)。这些发现给洞察多个ARs的机制调节EAAT2,应促进对缺血性中风治疗的发展。

示意图说明腺苷受体A1-A2a heteromers调节PPAR γ在星形胶质细胞转录和EAAT2表达。OGD提升A1AR-A2aAR heteromer形成和调节抑制PPAR YY1表达式 γ通过招聘HDAC1 PPAR的转录 γ启动子区域,导致废除EAAT2-mediated谷氨酸摄取。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

李侯Gui和酰化设计的研究和实验。酰化后,黄元李,渊源是负责数据收集。酰化后,桓赵分析数据。酰化后起草了手稿。酰化侯和李Gui修订后的手稿和所有作者同意最后的手稿。

确认

这项工作是由美国国家科学基金会支持的中国(国家自然科学基金委,# 81371274)低速齿轮和美国国家科学基金会(国家自然科学基金委,# 81601025)和军事医学科技创新项目(SWH2017YBXM-15) X.H.感谢《美国专家( http://www.aje.cn/)语言的援助在准备手稿。

 补充材料

补充文件显示的信息材料和试剂,包括品牌和很多数字。

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