Caffeoylquinic Acid-Rich提取的Aster glehnif·施密特通过PPAR的规定改善非酒精性脂肪肝δ并在ApoE KO小鼠脂联素

文摘

Aster glehni是很出名的,治疗属性。本研究进行调查的影响答:glehni在非酒精性脂肪肝病(NAFLD)在动脉粥样硬化的条件下,通过确定生物标志物的水平与血清脂质代谢和炎症有关,肝脏和脂肪组织。身体和腹部脂肪组织重量和血清甘油三酯水平降低在所有团体治疗答:glehni。血清脂联素浓度和蛋白质水平的过氧物酶体proliferator-activated受体δ5′腺苷单磷酸盐激活蛋白激酶,乙酰辅酶a羧化酶、超氧化物歧化酶和PPARγ共激活剂1α治疗组的肝组织中增加答:glehni。相反,蛋白质含量的ATP柠檬酸裂解酶、脂肪酸合酶,肿瘤坏死因子α,3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA还原酶和白介素6和活性氧物种的浓度降低答:glehni。小鼠的肝脏中甘油三酯浓度较低处理答:glehni比对照小鼠。HepG2和3 t3-l1细胞脂质积累减少答:glehni治疗;这种效应在PPAR的存在被压抑了δ拮抗剂,GSK0660。我们的研究表明,答:glehni提取物可能通过调节PPAR改善非酒精性脂肪肝δ脂联素,subgenes有关。

1。介绍

非酒精性脂肪肝病(NAFLD),表现为细胞内甘油三酯的积累,今天是最常见的一种疾病。代谢疾病如肥胖、糖尿病和高脂血症是主要危险因素为非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝炎(纳什),这是一种更严重的非酒精性脂肪肝(1,2]。此外,非酒精性脂肪肝临床指标可以作为代表的高血压,心血管疾病,糖尿病并发症(3,4]。脂联素是一个由244个氨基酸残基组成的adipocytokine,专门和脂肪组织中高度表达5]。它的表达密切相关,各种代谢性疾病,如肥胖、2型糖尿病、动脉粥样硬化和心血管疾病(6,7]。此外,通过脂联素介导的大豆胚改善非酒精性脂肪肝5′腺苷单磷酸盐激活蛋白激酶α(AMPKα)途径8]。通过几种机制AMPK纠正脂质稳态。它会使胆固醇和脂肪酸合成通过灭活酶3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA还原酶(HMGCR)和脂肪酸合成酶(FASN),分别。此外,AMPK上调脂肪酸氧化通过抑制乙酰辅酶a羧化酶(ACC) (9- - - - - -11]。

纵观人类历史,许多植物已经被消费不仅是食物,还有预防甚至治疗某些疾病。例如,Aster glehni被用于烹饪和作为韩国数百年的传统医学。在Dongui Bogam韩国传统医学百科全书,记录答:glehni展品解热和镇痛活动和减少痰和咳嗽。此外,各种治疗的功能答:glehni提取如典型药物、抗氧化作用、抗炎和抗皱活动最近报道(12- - - - - -14]。这些研究表明antiadipogenesis和典型药物的潜在影响答:glehni及其在治疗肥胖相关疾病治疗的潜力。

迄今为止,很少有研究的影响答:glehni对代谢疾病。因为许多研究已经报道的非酒精性脂肪肝密切相关,高血压和动脉粥样硬化等心血管疾病,我们调查的影响答:glehni在动脉粥样硬化小鼠和非酒精性脂肪肝与关注PPAR进行δ。目前的发现可以有利于进一步了解植物学期刊的作用在治疗动脉粥样硬化和脂肪肝。

2。材料和方法

2.1。植物材料

速煮和干答:glehnif·施密特(家庭菊科)从Ulleung岛购买Gyeongsangbuk-do,韩国,2012年11月,被教授(Yook(生药学、庆熙大学,首尔,韩国)。凭证标本(971 - 12 - a - p)沉积在韩国科学技术研究院的标本。

2.2。提取过程

碎叶和茎答:glehni(12公斤)与甲醇提取三次(70升)在室温下methanol-soluble提取。干提取残渣(2.6公斤)悬浮在水中,用乙酸乙酯分区。乙酸乙酯部分被蒸发压力减少产量41.0 g的残渣。提取过程中使用有机溶剂从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.3。高效液相色谱法(HPLC)分析乙酸乙酯提取的答:glehni

乙酸乙酯提取的答:glehni分析了用反相高效液相色谱法(水域1500系列系统),2998 PDA检测器(美国水域,伍斯特,MA)。分离进行了使用卢娜C18柱(5μ米、250×4.6毫米,Phenomenex托兰斯,美国CA) 25°C的进样体积10μl .流动相是一个梯度的甲醇和1%醋酸。以下使用梯度:30%甲醇(0分钟),40%甲醇(010分钟),60%甲醇(1020分钟),80%甲醇(2030分钟),和100%甲醇(3040分钟)。流动相的流速为1.0毫升/分钟。有机溶剂用于高效液相色谱分析从Sigma-Aldrich购买。

2.4。细胞培养

HepG2细胞培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)含10%胎牛血清(的边后卫)和1% antibiotic-antimycotic解决方案在37°C公司5%₂孵化器。媒介取代每48 - 72 h。HepG2细胞在95110通道被镀的密度5×10⁴细胞每在24-well文化菜或1×10⁶每口井的细胞在DMEM 6-well培养板包含10%的边后卫和1% antibiotic-antimycotic解决方案。细胞培养24 - 48 h在37°C公司5%₂孵化器,媒体被改为DMEM包含1%的边后卫。此后,细胞治疗高脂肪酸棕榈酸(0.1毫米)和高胆固醇(0.2毫米)条件下,答:glehni提取(25μg / mL)和过氧物酶体proliferator-activated受体δ(PPARδ)拮抗剂,GSK0660 (50μ米),24 h。HepG2细胞也接受dorsomorphin (AMPK拮抗剂、复合C) 10 uM 24 h。3 t3-l1 preadipocytes在含10%小牛血清DMEM培养在37°C和1% antibiotic-antimycotic解决方案有限公司5%₂孵化器。媒介取代每48 - 72 h。3 t3-l1细胞内8镀18章节5×10的密度⁴每口井的细胞在DMEM 24-well文化菜含10%小牛血清和1% antibiotic-antimycotic解决方案。当达到3 t3-l1细胞融合,分化媒体应用于细胞,在一起答:glehni提取和PPARδ拮抗剂。微分媒体包含0.0125嗯地塞米松,12.5 3-isobutyl-1-methylxanthine, 10μg / mL胰岛素,和10%的边后卫。分化了两天之后,媒体被替换成胰岛素含有10μg / mL胰岛素和10%的边后卫。在孵化后胰岛素媒体24天,媒体改变维护媒体只包含10%的边后卫。化学物质的浓度都是最后的治疗浓度。HepG2和3 t3-l1细胞系从朝鲜购买细胞株银行(首尔,韩国)。对细胞培养试剂都是购自Welgene Inc .(韩国大邱)。棕榈酸酯、胆固醇、GSK0660、复合C,试剂3 t3-l1细胞分化是从Sigma-Aldrich购买的。

2.5。动物研究

总的来说,男性四十载脂蛋白E淘汰赛(ApoE KO)小鼠被用于这项研究。老鼠(6周的年龄)适应了七天的饮食。老鼠的饮食含0.15%胆固醇和被分成以下四组:组(),美联储只有胆固醇饮食;集团(),美联储胆固醇饮食和100毫克/公斤/天答:glehni提取;集团(),美联储胆固醇饮食和300毫克/公斤/天答:glehni提取;和组(),美联储胆固醇饮食和500毫克/公斤/天答:glehni提取。所有浓度的提取是通过饮用水管理。四个星期后所有的老鼠都牺牲了。管理的答:glehni提取测定如下:首先,动物的身体重量估计每周在整个实验期间,然后管理的答:glehni提取的基础上计算平均体重每实验组和一般意味着水饮用量鼠标。

动物实验进行的动物实验伦理指导古鲁医院,韩国大学。实验动物研究韩国大学遵守规章制度,和协议批准机构韩国大学动物保健和使用委员会(批准文号:kuiacuc - 2014 - 40)。ApoE KO小鼠和0.15%胆固醇饮食由豆儿Yeol生物技术(首尔,韩国)。胆固醇的饮食是由豆儿Yeol生物技术添加0.15%胆固醇Teklad全球18%的蛋白质啮齿动物的饮食。原料组成为0.15%胆固醇饮食中描述表1。

2.6。估计甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇脂联素,白介素6(白细胞介素6),活性氧(ROS)浓度血清和肝脏

血清中甘油三酸酯和胆固醇的浓度估计通过酶比色测定试剂盒(Kyowa助理医生有限公司,有限公司,东京,日本)的实验室医学(诊断测试),高丽大学,古鲁医院(首尔,韩国)。

酶比色测定工具包(开曼化学,安阿伯市,美国)是用来测量肝组织甘油三酯浓度,根据制造商的指示。样品制备过程如下。肝组织在冰冷的PBS冲洗以去除多余的血液。300毫克的碎肝组织均相的标准稀释剂稀释2毫升。提取离心机在10000 g×10分钟在4°C,然后是浮在表面的被转移到另一个管。浮在表面的样品被稀释的比例1:在使用前5。标准和样品的解决方案(10μL)被添加到井,稀释酶缓冲溶液(150μL)被添加到每个。之后,盘子小心地动摇了几秒钟,覆盖着一个密封带,在室温下孵化15分钟。540纳米的吸光度测量使用标。甘油三酯浓度标准曲线的样本由插值准备使用标准的解决方案,并表示在mg / dL。

脂联素浓度在血清样本化验使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒可以检测脂联素球状域和完整的从Abcam(英国剑桥)。实验程序如下。50μL(脂联素的标准或样本添加到每个96孔板,和覆盖后井密封带,是在室温下培养1小时。洗后5 * 1 x 200洗缓冲μ50 L, 1 x生物素化的脂联素的抗体μL是添加到每个,孵化1小时。洗后5 * 1 x 200洗缓冲μ50 L, 1 x streptavidin-peroxidase共轭μL是添加到每个,孵化了30分钟。洗后5 * 1 x 200洗缓冲μ50 L,发色体基质μL是添加到每个,孵化到最佳的蓝色密度发展。停止解决50μL是添加到每个好,然后,吸光度是估计标在波长为450 nm。脂联素浓度的样品是由插值从标准曲线用标准样品由制造商提供,并表示在ng / mL。

白细胞介素6浓度在肝脏组织化验使用酶联免疫吸附试验(ELISA)工具包(Mybiosource、钙、美国)。样品制备过程如下。肝组织在冰冷的PBS冲洗以去除多余的血液。300毫克的碎肝组织均相的标准稀释剂稀释2毫升。提取离心机在5000 g×5分钟在4°C,然后是浮在表面的被转移到另一个管。浮在表面的样品被稀释的比例1:30前使用。标准和样品的解决方案(100μL)被添加到井,覆盖板封口机,孵化为2小时37°C。在每个好去除液体后,100年的检测试剂μL是添加到每个好,密封板是孵化为1小时37°C。吸气后,液体在每个好,与1 x洗井洗了三次缓冲区,和检测100 BμL是添加到每个好,密封板是孵化为2小时37°C。吸气和洗涤后,衬底90解决方案μL是添加到每个好,密封板是孵化为30分钟37°C。停止解决50μL是添加到每个好,然后,吸光度是估计标在波长为450 nm。白细胞介素6浓度样本是由插值从标准曲线用标准样品由制造商提供,并表示在ng / mL。

ROS浓度在肝脏组织化验使用酶联免疫吸附试验(ELISA)工具包(Mybiosource、钙、美国)。肝组织在冰冷的PBS冲洗以去除多余的血液。300毫克的碎肝组织均相的标准稀释剂稀释2毫升。提取在10000转离心10分钟在4°C,然后是浮在表面的被转移到另一个管。实验程序如下。标准和样品的解决方案(100μL)被添加到井,覆盖板封口机,孵化为2小时37°C。在每个好去除液体后,100年的检测试剂μL是添加到每个好,密封板是孵化为90分钟37°C。吸气后,液体在每个嗯,井与1 x洗水洗两次缓冲区,和生物素化的老鼠ROS抗体100解决方案μL是添加到每个好,密封板是孵化为1小时37°C。吸气和洗涤后,enzyme-conjugate 100解决方案μL是添加到每个(除了空白井),密封板是孵化为30分钟37°C。100颜色液体试剂μL和C试剂添加到每个颜色顺序,和吸光度是估计标在波长450纳米的10分钟。ROS浓度样本是由插值从标准曲线用标准样品由制造商提供,并表示在单位/毫升。

2.7。半定量逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)

总RNA提取试剂盒的试剂根据手册®。互补DNA合成的权力总RNA的互补脱氧核糖核酸合成装备,PPAR和聚合酶链反应δ,AMPKα1亚基,白介素6(白细胞介素6)、肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α),β肌动蛋白与PCR预混料箱管理。使用的引物序列如下:向前5′-GGCAGAGTTGCTAGGGTTCC-3′和奖励5′-CAAGGAACACCCCAAGACCT-3鼠标PPAR′δ(PCR产品尺寸是294个基点);提出5′-CCTGCTTGATGCACACACATGA-3′和奖励5′-TCATCAAAAGGGAGGGTTCC-3鼠标AMPK′α1亚基(PCR产品尺寸是213个基点);向前5′-TTCACAGAGGATACCACTCC-3′和奖励5′-AAGTGCATCATCGTTGTTCA-3′对小鼠白细胞介素6 (PCR产品尺寸是147个基点);提出5′-CTACTCCTCAGAGCCCCCAG-3′和奖励5′-CAGGTCACTGTCCCAGCATC-3′小鼠肿瘤坏死因子α(PCR产品尺寸是126个基点);向前5′-CTAGGCACCAGGGTGTGATG-3′和奖励5′-CTACGTACATGGCTGGGGTG-3′的老鼠β肌动蛋白(PCR产品尺寸是291个基点)。反应混合物cDNA预热5分钟在95°C作为初始变性步骤。聚合酶链反应包括变性步骤20秒在95°C,退一步55°C在10秒,30秒内扩展步骤72°C,和最终扩展步骤5分钟在72°C。

试剂盒试剂购买从英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。马克西姆PCR预混料装备,互补脱氧核糖核酸合成装备,并从基因内区PCR预混料得到生物技术(京畿道、韩国)。

2.8。估计的琥珀酸脱氢酶(SDH)活性在肝脏

组织样本中均质磷酸盐(PBS)包含1%的蛋白酶抑制剂。均质提取离心机在13000 rpm, 4°C为5分钟。上层清液转移到新管,与孵化混合解决方案包含1 mol / L磷酸盐缓冲剂(25μL), 0.2 mol / L琥珀酸钠(125μL), 10毫克/毫升氮蓝四唑(电视台;25μL)和蒸馏水(235μL)。20分钟的混合物是孵化37°C温控室。琥珀酸钠、氮蓝四唑和蛋白酶抑制剂是从Sigma-Aldrich购买的。一种酶解决方案(90μL(410)被添加到prewarmed孵化解决方案μL)和孵化37°C。反应完成后,反应混合物的吸光度测量的波长550纳米。酶活性是使用以下公式计算:酶活性=酶反应混合物的吸光度−稀释酶溶液的吸光度。

2.9。免疫组织化学

组织幻灯片被浸泡在二甲苯除去石蜡顺序,然后浸泡在100年75%的乙醇脱水的解决方案。Deparaffinized幻灯片和脱水反应有3% H₂O₂解决方案10分钟,洗净。幻灯片被封锁与正常血清1 h的解决方案。幻灯片被处理主要抗体1 h和洗Tris-buffered盐水含0.05%渐变20 (TBS-T)。主要对超氧化物歧化酶(SOD)的抗体得到罗福斯(美国利特尔顿有限公司)和HMGCR从圣克鲁斯生物技术,Inc .)和肿瘤坏死因子α从Abcam和4-hydroxynonenal (4-HNE)抗体。二次抗体反应30分钟的幻灯片。与TBS-T洗涤后,预拌Vectastain®ABC试剂反应了30分钟的幻灯片。幻灯片然后洗TBS-T反应和3,3′-diaminobenzidine衬底溶液直到观察颜色的变化。与自来水清洗5分钟后,幻灯片和苏木精复染色。幻灯片是再用自来水洗净,风干,最后安装。免疫组织化学设备(含二级抗体)购买从向量实验室(美国伯林盖姆,CA)。

2.10。油红O染色

24-well细胞培养板固定在4%甲醛溶液为30分钟,然后用PBS洗5分钟。这些细胞被沾油红O解决方案(Sigma-Aldrich) 1 h。40%异丙醇洗了30年代,细胞被洗两次与PBS 5分钟。细胞与光学显微镜观察和拍照。绝对异丙醇(1毫升)被添加到每个,筛选了油红O与Spectramax + 384标量化(分子设备有限责任公司,桑尼维尔,美国)的波长530纳米。

2.11。免疫印迹分析

布拉德福德蛋白质浓度估计的方法。提取的蛋白质(10μg)加载到10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶对硝化纤维素和蛋白质印迹膜进行了90分钟。膜被封锁在一夜之间有5%的脱脂牛奶,洗了三次与TBS-T 10分钟。主要抗体被绑定到膜在室温下2 h。主要抗体和磷酸化形式的AMPK, ACC,和ATP柠檬酸裂解酶(ace)是由细胞信号技术,Inc .(丹弗斯、马、美国)。主要抗体过氧物酶体proliferator-activated受体γ共激活剂1α(PGC-1α),PPARδ,PPARα从Abcam, FASN购买。主要抗体β肌动蛋白是采购从圣克鲁斯生物技术公司主要抗体稀释条件如下:PPARδ1:500年,AMPK, p-AMPK (Thr172)、ACC, p-ACC (Ser79), ac, p-ACLY (Ser455), FASN, PPAR吗α,PGC-1α1:1000,β肌动蛋白是1:800。与TBS-T洗涤三次后10分钟,二次抗体(圣克鲁斯生物技术有限公司)是绑定到膜在室温下1 h。二次抗体稀释条件如下:anti-rabbit PPAR的抗体免疫球蛋白δ,PPARα,AMPK p-AMPK ACC, p-ACC ac, p-ACLY, FASN, PGC-1α1:5000,anti-mouse IgG抗体β肌动蛋白是1:5000。三洗TBS-T 10分钟和后一个TBS冲洗10分钟,化学发光底物和增强剂的解决方案(Bio-Rad、大力神、钙、美国)应用于膜来确定蛋白表达率。图像处理与柯达手动GBX开发者和固定器试剂(Carestream健康,Inc .,罗切斯特,纽约,美国)使用图像J程序和分析。β肌动蛋白作为内部控制规范化加载的蛋白质。

2.12。苏木精和伊红染色())

每个老鼠的肝组织收集和固定在4%多聚甲醛。样本嵌入在石蜡,切成4 ~ 5μ米厚的部分使用切片机,沾染了)(Sigma-Aldrich)。的部分是可视化使用光学显微镜(BX51;奥林匹斯山,日本东京)和拍照。

2.13。免疫细胞化学

细胞室幻灯片与冰冷的甲醇固定15分钟。固有细胞过氧化物酶活动摆脱PBS含有0.3%的治疗H₂O₂和0.3%正常血清。PBS洗5分钟后,PBS含有0.25% Triton x - 100添加到细胞和孵化了10分钟。PBS洗5分钟后,细胞与正常血清阻断孵化20分钟在PBS稀释的比例1:100。去除阻塞血清后,细胞被孵化与初级抗体解决方案(PPAR 1小时γ主要从Abcam抗体购买)。PBS洗5分钟后,二次抗体的解决方案是添加到细胞和孵化30分钟。PBS洗5分钟后,Vectastain®ABC试剂添加到细胞和孵化了30分钟。PBS洗5分钟后,3、3′-diaminobenzidine (DAB)衬底的解决方案是添加和孵化到适当的颜色变化出现了。与PBS洗涤三次后,细胞与苏木精复染色。与蒸馏水洗涤后,细胞室幻灯片干,覆盖着玻璃,然后用光学显微镜观察。免疫组织化学设备(含二级抗体)购买从矢量实验室。

2.14。统计数据

数据提出了均值±SEM(均值的标准误差)。统计上显著的差异未配对的两组计算以及,一维方差分析测试是用来比较的三个或更多组。的值< 0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。乙酸乙酯提取物的高效液相色谱分析的状况答:glehni表明,提取主要包含Caffeoylquinic酸

乙酸乙酯提取物答:glehni包含主要caffeoylquinic酸六种,他们是:5-caffeoylquinic酸,3,4-dicaffeoylquinic酸,3,5-dicaffeoylquinic酸,4,5-dicaffeoylquinic酸,甲基3 4-dicaffeoylquinic酸,甲基4,5-dicaffeoylquinic酸(图1)。

3.2。身体的重量和腹部脂肪(附睾的)和甘油三酯浓度,总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和脂联素的血清载脂蛋白e KO小鼠胆固醇饮食和为0.15%答:glehni提取被提取规范化

饮食摄入总量没有明显不同的实验人群除了答:glehni提取物治疗组(图500毫克/公斤/天2(一个))。同样,饮用水摄入数量并不是所有实验中不同的组织(图2 (b))。

身体和腹部脂肪组织(附睾的)治疗组小鼠的体重答:glehni提取显著低于控制老鼠(数字2 (c)和2 (d))。所以饮食摄入量和体重量之间的相关性不明显。

血清中甘油三酯的浓度降低浓度的方式和显著差异中观察到治疗组与300和500毫克/公斤/天答:glehni提取(图2 (e))。脂联素是一个糖化adipokine,选择性地由脂肪细胞分泌的。据报道,改善胰岛素敏感,刺激脂肪酸氧化,减少炎症,抑制动脉粥样硬化(15]。脂联素水平增加时答:glehni(图提取治疗浓度2 (f))。另一方面,胆固醇的浓度变化答:glehni管理:在治疗后总胆固醇水平显著降低提取的500毫克/公斤/天(图2 (g)相同的治疗后),高密度脂蛋白胆固醇水平增加(图2 (h)治疗后)和低密度脂蛋白胆固醇水平降低与提取的300毫克/公斤/天(图2(我))。

3.3。半定量rt - pcr PPAR的结果δ,AMPKα1、白细胞介素6和TNFαApoE KO小鼠的肝脏胆固醇饮食和为0.15%答:glehni提取显示PPAR的高程δ和AMPKα1和白细胞介素6和TNF的减少α

PPAR的mRNA水平δ增加了答:glehni提取物的浓度(图3(一个)),AMPK的表达α1催化亚基的提取物治疗显著升高浓度(图100毫克/公斤/天3 (b))。白细胞介素6和TNF的mRNA水平α参与炎症被降低的提取物浓度(数据吗3 (c)和3 (d))。

3.4。PPAR的免疫印迹分析δ,AMPK, ACC, ac, PGC-1α,FASN表达式ApoE KO小鼠的肝脏胆固醇饮食和为0.15%答:glehni提取显示脂肪酸氧化的激活和抑制脂肪酸合成的提取物

磷酸化AMPK (P-AMPK)是酶的活性形式和调节ACC的激活。ACC磷酸化后,它就变成了灭活,不再催化malonyl-CoA-an至关重要的组件的生产在脂肪酸合成16]。交流的功能是将葡萄糖和脂质代谢。在其活性形式,磷酸化柠檬酸交流电变换成乙酰辅酶a,可以用作基质甲羟戊酸和脂肪酸合成途径(17,18]。的转录辅激活PGC-1α协调增加线粒体生物起源和呼吸率,以及吸收和利用能源生产的基板(19]。

PPAR的蛋白质水平δ实验组显著增加肝脏的处理300和500毫克/公斤/天答:glehni提取(图4(一))。同样,P-AMPK的表达显著增加的实验组接受300毫克/公斤/天答:glehni提取(图4 (b))。磷酸化ACC (P-ACC)的表达明显升高的治疗组和300毫克/公斤/天答:glehni提取(图4 (c))。相反,磷酸化的表达交流(P-ACLY)在100年所有组显著降低,300和500毫克/公斤/天答:glehni提取(图4 (d))。蛋白质水平的PGC-1α增加在治疗组与300和500毫克/公斤/天答:glehni提取(图4 (e)FASN减少的),而在所有的组织处理答:glehni提取(图4 (f))。

3.5。肿瘤坏死因子的免疫组织化学分析α,HMGCR SOD和4-HNE表达在肝脏的部分ApoE KO小鼠胆固醇饮食和为0.15%答:glehni提取表明TNF的减少αHMGCR和SOD的增加

通常知道高脂血症加剧炎症和刺激活性氧的生成(20.,21]。体内的炎症可以估计肿瘤坏死因子等炎性细胞因子的水平α;在这项研究中,肿瘤坏死因子的水平α减少在所有团体治疗答:glehni提取物。相反,SOD的表达,一种酶,这种酶的皈依者分子氧(O₂)或过氧化氢(H₂O₂),增加在所有团体治疗答:glehni提取物。HMGCR对照组的表达是显而易见的;然而,它的表达是减毒实验处理组答:glehni提取物。

4-Hydroxynonenal (4-HNE)通常是已知的与脂质过氧化的产物和氧化应激的诱导物,并加速肝细胞脂质积累的报道(22]。此外,4-HNE蛋白表达下降了AMPK受体激动剂,5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-D-ribofuranoside(爱卡)酒精诱导脂肪肝(23]。4-HNE表达降低答:glehni提取(图5)。

3.6。ApoE KO小鼠的肝脏胆固醇饮食和为0.15%答:glehni提取物、琥珀酸脱氢酶活性增加,甘油三酯的浓度、白细胞介素6、ROS减少,提高肝细胞的形态学的提取物治疗组300毫克/公斤/天

琥珀酸脱氢酶催化的反应将琥珀酸和黄素腺嘌呤二核苷酸(时尚)延胡索酸酯和柠檬酸FADH2周期,也参与电子传递链。此外,SDH称为线粒体生物起源的生物标志物,PGC-1一起α(24]。在这项研究中,SDH活性只有在增加小鼠接受300毫克/公斤/天答:glehni(图6(一))。肝脏中甘油三酯浓度显著降低在实验组接受300毫克/公斤/天答:glehni(图6 (b))。肝细胞的膨胀是纳什的组织学诊断的一个重要指标25]。肝脏中白细胞介素6浓度减少实验处理组答:glehni提取300和500毫克/公斤/天浓度(图6 (c))。还活性氧簇(ROS)的浓度减少实验处理组答:glehni提取物的浓度(图6 (d))。

球状细胞形态学观察在所有实验组除了组接受300毫克/公斤/天答:glehni,表现出肝脏形态学最类似于一个正常的肝脏(图6 (e))。这些结果表明,剂量300毫克/公斤/天答:glehni是最有效的预防和改善脂肪肝ApoE KO小鼠0.15%胆固醇的饮食。

3.7。油红O染色和免疫印迹分析PPARδAMPK, PGC-1αHepG2细胞治疗答:glehni提取和GSK0660高脂肪酸和高胆固醇条件显示的直接减少脂质积累和增加脂质氧化相关的生物标志物

虽然HepG2细胞的脂质含量增加到77.6%的cotreatment棕榈酸酯和胆固醇控制相比,高脂质水平显著降低cotreating棕榈酸酯的条件,胆固醇,和答:glehni提取。但的影响答:glehni抑制了PPAR的cotreatment吗δ拮抗剂,GSK0660(数字7(一)和7 (b))。蛋白质水平的PPARδ、P-AMPK PGC-1α在增加答:glehni提取治疗与对照组的水平相比。然而,这种效应答:glehni提取被PPAR的行动抑制δ拮抗剂,GSK0660(数字7 (c)- - - - - -7 (e))。

3.8。PPAR蛋白表达水平γ和PPARα不改变了答:glehniHepG2细胞中提取高脂肪酸和高胆固醇条件:AMPK拮抗剂,复合C,并不影响PPAR的蛋白质水平δ

Aster glehni提取并没有改变PPAR的蛋白质表达水平γ和PPARαHepG2细胞治疗高脂肪酸和高胆固醇(数字8(一个)和8 (b))。AMPK拮抗剂(复合C)没有减少PPARδ蛋白质水平(图8 (c))。

3.9。油红O染色的分化3 t3-l1细胞治疗答:glehni提取和GSK0660高脂肪酸和高胆固醇显示Antiadipogenic效应的提取条件,并为PPAR蛋白质含量δAMPK, PGC-1α从ApoE KO小鼠腹部脂肪组织胆固醇的饮食主要是增加0.15%的提取物治疗组500毫克/公斤/天

3 t3-l1分化细胞的脂质含量,增加了棕榈酸酯和胆固醇治疗,治疗后下降答:glehni,的影响答:glehni在这些细胞也被镇压的cotreatment GSK0660(数字9(一个)和9 (b))。蛋白质含量为PPARδ、P-AMPK PGC-1α从小鼠腹部脂肪最高接受500毫克/公斤/天答:glehni相比,控制数据9 (c)- - - - - -9 (e))。

4所示。讨论

肝脏有许多重要生理功能,如造血作用,分泌的胆汁,消灭外来杂质和细菌的枯氏细胞,身体的能量和维持体内平衡(26]。许多研究报道,在肝脏脂质代谢异常与各种代谢性疾病,如动脉粥样硬化、肥胖、2型糖尿病和高血压。例如,据报道,高血压和2型糖尿病的风险比那些更高的非酒精性脂肪肝患者non-NAFLD组(27- - - - - -30.]。此外,非酒精性脂肪肝患者颈动脉内膜中层厚度大于正常的健康人群(31日]。在肥胖人,多余的肝内甘油三酯代谢异常的一个强大的指标,独立于其他代谢测量体重指数、体脂百分比,内脏脂肪质量(32]。因此,肝脏的代谢功能是至关重要的维持代谢体内平衡和身体的整体健康。

在我们的研究的影响和机制Aster glehni在非酒精性脂肪肝ApoE KO小鼠血清中脂联素的浓度明显高于治疗组在实验答:glehni提取比对照组。此外,血清中甘油三酯的浓度,腹部脂肪组织的重量,身体的重量都是低的答:glehni治疗组比对照组。和答:glehni提取顺序调节脂肪酸代谢基因。例如,upregulation脂联素和PPARδ通过答:glehni诱导AMPK活化,因此增加PGC-1的水平α和p-ACC;这反过来提高SDH活性和降低FASN表达式。此外,答:glehni抑制蛋白质含量p-ACLY HMGCR。因此,最终的结果答:glehni行动是肝脏中甘油三酯水平降低(数字6和10)。从TG水平和SDH(图的数据6),最有效的治疗浓度Aster glehni提取,以防止非酒精性脂肪肝在动脉粥样硬化条件下应该是300毫克/公斤/天。但是,答:glehni提取显示-影响的浓度超过300毫克/公斤/天肝脏脂质代谢,并得到以下结果:肝脏TG水平表现出上升趋势提取物治疗组500毫克/公斤/天浓度组相比,接受300毫克/公斤/天的提取浓度。所以,可以推测答:glehni提取高浓度的负面影响在ApoE KO小鼠肝脏脂质代谢。

答:glehni另外治疗可能通过调节改善非酒精性脂肪肝SOD, TNFα4-HNE,白细胞介素6、ROS(数字5,6,10)。在这项研究中,减少体重的原因和腹部脂肪组织大规模的治疗答:glehni从高程提取可以解释相关的生物标记物脂肪酸氧化代谢的差别,对这些生物标志物参与脂质合成和炎症。的PPARδ拮抗剂(GSK0660)抵消的效果答:glehni刺激PPAR的蛋白表达δ、p-AMPK PGC-1αHepG2细胞(图所示7)和扭转效应的降低脂质积累HepG2细胞和分化3 t3-l1(数字7和9)。这些结果表明,PPARδ调节AMPK和PGC-1α。此外,答:glehniPPAR的提取并不影响蛋白表达α和PPARγ胆固醇和棕榈酸酯的条件cotreatment(数字8(一个)和8 (b)),所以可以认为答:glehni提取具体调节PPARδPPAR相比α和PPARγ。此外,PPARδ拮抗剂(GSK0660)减少P-AMPK的蛋白质水平(图7 (d)),但是AMPK拮抗剂(C)复合PPAR并未改变δ蛋白质水平(图8 (c))。所以这些结果意味着PPARδ是一个对AMPK上监管机构。

我们的研究结果与其他论文的结果几乎是一致的。

在脂肪组织炎症蛋白质c反应蛋白和肿瘤坏死因子等α负面调控脂联素;脂联素也会抑制肿瘤坏死因子α生产在心肌细胞(33]。此外,它专门抑制TNFα全身的激活的抑制剂κB -(我κB -)α/核转录因子κB (NF -κB)通过cAMP-dependent通路在人类主动脉内皮细胞(34]。患者血浆脂联素水平的代谢疾病,如高血压、2型糖尿病和肥胖是低于健康者(35- - - - - -37]。脂联素通过磷酸化激活AMPK。反过来,ACC磷酸化,激活AMPK灭活减少malonyl-CoA的生产,这是需要在新创脂肪酸合成16]。还PPAR的许多研究δ调控AMPK活化据报道如下:PPAR的激活δ诱导AMPK活化和影响葡萄糖运输在骨骼肌细胞(38),PPARδ激活受体激动剂诱导p-AMPK正常化和PGC-1α水平降低肝脏的老鼠给高脂肪饮食(39),血管紧张素ⅱ受体阻滞剂,替米沙坦,减少体重增加和提升跑步耐力通过PPAR的规定δAMPK途径的激活AMPK取决于PPARδ(40]。AMPK的作用在调节脂质代谢广泛被描述。例如,肿瘤坏死因子引起的细胞内甘油三酯积累α减少政府的AMPK受体激动剂如二甲双胍和5-aminoimidazole-4-carboxamide-1 -β-D-ribofuranoside(爱卡)HepG2细胞。此外,这些AMPK受体激动剂抑制机械的雷帕霉素靶(mTOR)和p70S6K磷酸化和减少的水平固醇调节元件结合蛋白1 (SREBP-1)和FASN [41]。因此可以认为AMPK可以降低肿瘤坏死因子等炎性蛋白的表达α以及其他参与脂肪酸合成的蛋白质。最近,周et al。42)表明,antiadipogenic影响亚麻酸是依赖AMPK,它被废除AMPK的影响α1,AMPKα2 KO小鼠。此外,激活AMPK的爱卡和二甲双胍增加SOD的活性。另一方面,AMPK拮抗剂像C降低SOD的活性化合物43]。此外,白藜芦醇证明增加SOD水平通过AMPK-dependent机制血管内皮细胞受到高glucose-induced氧化应激条件(43]。然而,据报道,本构内皮AMPK活化α1促进血管炎症和obesity-induced脂肪肝,主要通过诱导cyclooxygenase-2 [44]。在胆固醇代谢,AMPK活化爱卡抑制SREBP-2及其目标基因的表达,HMGCR和3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA合成酶(HMGCS),是胆固醇生物合成的关键酶(45]。基于这些研究脂联素/ PPAR之间的关系δ和脂质代谢,脂联素和PPARδ调节脂质代谢的AMPK激活肝脏。

脂联素基因的缺陷可以通过减少诱发纳什表达PGC-1等相关的线粒体生物起源α线粒体生物起源的,视为主调节器,在肝细胞(46]。AMPK和NAD-dependent脱乙酰酶sirtuin-1 (SIRT1)直接影响PGC-1α活动(19]。此外,PGC-1α表达式对应于严重的代谢变化由于锻炼,饥饿和寒冷47]。一项研究报道,PPARδ激活受体激动剂调节PGC-1α通过在PGC-1 PPAR-response元素mRNA的表达α启动子(48]。琥珀酸脱氢酶是参与三羧酸循环和电子传递链和在氧化代谢连同PGC-1中扮演至关重要的角色α。在肥胖2型糖尿病患者,罗格列酮增加胰岛素敏感通过upregulation PPAR的mRNA水平δ和PGC-1α,以及刺激骨骼肌(SDH活动49]。在代谢综合征大鼠模型(月/ NDmcr-cp)代表高血压和肥胖的特点,锻炼规范化SDH的活动和PPAR的mRNA的表达δ和PGC-1α(50]。因此,可以认为PPAR的刺激δ,PGC-1α,SDH诱发分解代谢的激活导致能量消耗,以及降低甘油三酯和血清脂联素水平的增加。此外,琥珀酸治疗的蛋白质含量增加α平滑肌肉肌动蛋白和G protein-coupled受体91,这是至关重要的标记纤维发生在人类肝星状细胞(51),这表明SDH的意义在改善肝脏疾病,如肝硬化。

因此,我们的研究结果表明,答:glehni提取改善代谢异常在血清和肝脏加速能量消耗和刺激PPAR的脂质分解代谢δ和脂联素可以通过脂联素/ PPAR此外改善肥胖δ-AMPK-PGC-1α通路(图10)。因为身体和腹部脂肪重量显著降低治疗浓度,减少饮食摄入量高剂量(500毫克/公斤/天)可能是由于强烈的味道Aster glehni;然而,确切的机制将被解释为进一步研究。在我们的研究中,PPAR之间的关系δ和其他生物标记研究相对较好;然而,脂联素对脂质代谢的反应机理是PPAR相比不足δ。所以在接下来的研究中,脂联素的额外的实验是必要的。

Caffeoylquinic acid-rich露兜树tectorius水果提取物改善高血脂和高血糖通过激活AMPK [52]。也5-caffeoylquinic酸改善肥胖和脂肪肝PPAR通过改善脂质代谢α激活和LXRα抑制(53]。在我们的研究中,乙酸乙酯提取的答:glehni包含主要caffeoylquinic酸六种。因此,可以认为的anti-NAFLD效果答:glehni提取依赖于caffeoylquinic酸。在我们的研究之后,anti-NAFLD caffeoylquinic酸纯化的效果和机制答:glehni应该另外尝试。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Yong-Jik李设计的研究,完成所有实验,写的手稿。Yoo-Na张成泽,Yoon-Mi汉、金队伍和Jong-Min宋参与动物和分子生物学实验。分钟Jeoung儿子和Chang Bae金导致实验植物的提取和制备样品。香港Seog Seo和Hyoung Ja金参与设计研究和研究方向。所有作者已阅读及同意出版的手稿。

确认

这项研究受到了韩国的校内格兰特科技研究所(2 e26990),韩国国家研究基金会的资助(nrf - 2016 r1a2b3013825),高丽大学拨款,高丽大学古鲁医院格兰特(O1600121)和格兰特BK21 +韩国大学医学研究生课程。作者感谢Yoon Namkung校对的手稿和Tae吸引荣格帮助在实验准备。

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