文摘
过氧物酶体proliferator-activated受体配体依赖性转录因子核受体功能。其中,过氧物酶体proliferator-activatedβ/δ受体(PPARβ/δ)是心脏中高度表达,认为由于其有利影响心血管功能在代谢综合征。我们已经表明,PPARβ/δ激活了一个增强心脏血管生成和增长,而心脏功能的损害,我们想确定特定的PPAR激活的影响β/δ在心脏上的血管性能在正常和慢性缺血性心脏病条件。我们分析一个特定的PPAR的影响β/δ过度使用诱导内皮细胞在心脏条件vascular-specific小鼠模型。我们证明vessel-specific PPAR的过度β/δ诱发心脏血管生成和快速增长与增加心肌细胞的大小。在心肌梗死血管PPAR的过度β/δ尽管增强心脏血管形成,没有预防慢性缺血性损伤。我们的研究结果表明,PPAR的适当平衡β/δ激活不同心脏细胞类型需要获得有益的影响结果在慢性缺血性心脏病。
1。介绍
过氧物酶体proliferator-activated受体配体依赖性转录因子(PPARs)属于核受体超家族。有三个PPAR家族成员(α,β/δ,γ与不同),但重叠的空间,时间,和监管的表达模式。PPARs,脂质内源性配体和PPARs视为重要的脂质代谢基因转录监管机构和心脏能源生产(1]。
PPARβ/δ心中是主要的亚型,和一些证据表明PPAR的心血管功能吗β/δ。心脏PPARβ/δ删除小鼠心脏功能障碍,导致肥厚,充血性心力衰竭(2]。此外,它已经表明,PPARβ/δ受体激动剂l - 165041抑制药物诱导心肌细胞肥大通过PPAR之间的交互β/δNF -κB和NF -差别随后对这些κB目标基因(3,4]。一个在活的有机体内研究表明,心脏PPAR的具体超表达β/δ导致心肌葡萄糖利用率和增加不改变心脏功能,但倾向于产生缺血/ reperfusion-induced心肌损伤的保护作用。这是归因于PPAR Glut-4启动子的激活β/δ和随后增加了心肌葡萄糖利用率(5]。最后,我们最近表明,PPAR的药理活性β/δGW0742或GW501516保存在小鼠心肌细胞快速增长导致心肌功能。我们证明了PPARβ/δ直接激活钙调磷酸酶基因(6诱导心脏生长),这是众所周知,(7,8]。最有趣的是,我们在研究中观察到的快速感应心脏血管生成在药理PPARβ/δ激活,令人惊讶的是之前没有调查,尽管心脏生长和血管生成之间的关系似乎很明显。PPARβ/δ表达内皮细胞已经被报道在1999年由Bishop-Bailey和Hla (9]。药理和PPAR激活内皮细胞和内皮祖细胞β/δ受体激动剂已经提升了迁移,增殖,管这些细胞的形成(10,11]。
此外,PPARβ/δ基因敲除小鼠表现出减少血液流动和不成熟在皮下注射诱导肿瘤微血管结构,这可能被PPAR的reexpression获救β/δ(12]。在人类胰腺肿瘤,PPARβ/δ表达强烈与先进的肿瘤分期和肿瘤复发和远处转移的风险增加。PPARβ/δ因此被认为是参与调节肿瘤血管生成开关的发展(13]。
PPARβ/δ还参与生理血管生成。当我们和其他人显示,PPAR的治疗β/δ受体激动剂GW0742和GW501516诱导心脏的运动(如表型。这两种受体激动剂诱导一个出人意料的快速(24小时后)改造的老鼠心脏6和骨骼肌14通过增加微血管密度。
然而,直到现在还不清楚如果增加心肌肥大的心脏血管驱动器或增强心脏血管生成可能是一个潜在的间接影响cardiomyocyte-specific PPARβ/δ超表达。
在我们目前的工作,我们解决这个问题通过诱导条件的代转基因老鼠vascular-specific PPAR的过度β/δ并分析正常心脏表型和功能以及实验性心肌梗死后功能和组织学。
我们表明,诱导vessel-specific PPAR的过度β/δ导致快速诱导血管生成,心脏肥大,和心脏功能障碍所反映的增强的舒张和收缩末期容量,减少部分缩短,减少射血分数。此外,我们表明,心肌梗死后,尽管高抵押品血管形成,动物vascular-specific PPARβ/δ超表达显示更大的梗塞病变,更高的心脏纤维化,进一步减少心脏功能。这指向一个更仔细的查看关于PPAR的潜在好处β/δ受体激动剂治疗心血管疾病,如cardiomyocytic和血管性PPAR之间的适当平衡β/δ似乎对心脏健康至关重要,尤其是在缺血条件下。
2。材料和方法
2.1。动物
所有的动物被用于符合当地内政部规定。PPARβ/δ液氧+ /−(15),Tie2-CreERT2(16动物是交叉生成Tie2-CreERT2; PPARβ/δ液氧+ /−老鼠,进一步被称为Tie2-CreERT2; PPARβ/δ。的Tie2 -到C57BL6 Cre-line backcrossed四倍。年龄和sex-matchedTie2-CreERT2; PPARβ/δ动物被注射一周腹腔内和向日葵油(车辆)或三苯氧胺溶解在向日葵油的剂量33毫克/公斤/天(17]。Tie2-CreERT2动物注射他莫昔芬作为一个额外的控制。麻醉小鼠被超声心动图检查使用iE33 xMATRIX系统12 MHz换能器(荷兰飞利浦医疗、DA最好)。心肌梗死是左冠状动脉的结扎引起的(小伙子)所描述的18]。短暂,麻醉小鼠气管内插管,皮肤是雕刻的左胸,胸肌的肌肉被动员,第三和第四根肋骨之间的开胸了,和小伙子永久关闭7缝合远左心耳。这导致大量的心肌梗死。开胸和皮肤伤口被关闭4 - 0缝合线和老鼠仍然插管直到自发呼吸恢复。杀伤力过程大约50%的独立基因的老鼠。
2.2。基因分型
动物的基因型由PCR鉴定。PCR条件和引物序列可以在请求。
2.3。组织样本、组织学和免疫组织学
组织学和心肌细胞直径进行测量建立协议(19]。样品从每组(至少五个不同的动物Tie2-CreERT2; PPARβ/δ+车辆,Tie2-CreERT2+三苯氧胺,Tie2-CreERT2; PPARβ/δ+三苯氧胺)进行了分析。调查人员也不清楚老鼠的基因型。三个μm石蜡部分被用于组织学和immunohistological程序。
Haematoxylin-Eosin染色是经常上执行所有组织样本;此外,部分是沾三色的马森,Picrosirius红色。对于PPARβ/δ和Pecam-1免疫组织学heat-mediated抗原后,检索和内源性过氧化物酶活动的淬火,抗原抗体后检测到应用程序Pecam-1 (CD31)(1: 100年,兔多克隆、ab28364 Abcam)或PPARβ/δ(1:100年,兔多克隆、ab154395 Abcam)使用设想™过氧化物酶/民建联检测系统从Dako(特拉普、法国)。部分与苏木精复染色(σ)。遗漏的第一抗体作为消极的控制。此外,一些幻灯片与免疫球蛋白g同形像孵化控制(1:100年,兔单克隆,克隆SP137, Abcam)。幻灯片是一个数字化的显微镜下看(DMLB、徕卡、德国)连接到一个数码相机(现货RT滑块、诊断仪器、苏格兰)。
所有immunohistological染色面积密度测定使用ImageJ软件。船在至少五个不同的部分区域密度进行了分析每鼠心。
2.4。实时rt - pcr
总RNA从心脏和心脏内皮细胞,分离排序和CD31微(Miltenyi研究)的老鼠心脏使用试剂盒试剂(表达载体)。RNA颗粒溶解在二乙基pyrocarbonate-treated H2o .合成第一链cDNA与0.5执行μ总RNA的g使用益生元(dT)引物,上标三世逆转录酶(表达载体)。一个μL的实时rt - pcr反应产物被放大(ABI棱镜7000,应用生物系统公司)使用商业SYBR®绿色装备(Eurogentec、激怒、法国)。引物序列都可以在请求。每个基因的表达是各自的规范化Gapdh、Actb Rplp0表达式。
2.5。统计分析
数据表示为±SEM手段。方差分析与Bonferroni测试事后执行测试或Mann-Whitney测试表示。一个小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。
3所示。结果与讨论
3.1。PPARβ/δVascular-Specific过度迅速增加心脏血管密度
免疫组织化学的PPARβ/δ证明了PPAR的upregulation的心脏部分β/δ内皮细胞的蛋白表达Tie2-CreERT2; PPARβ/δ老鼠比vehicle-treated诱导与三苯氧胺Tie2-CreERT2; PPARβ/δ动物(图1(一))。定量rt - pcr从心脏内皮细胞富含Pecam-1 / CD31微进行确认PPAR的血管过度β/δCre-mediated重组。内皮细胞与三苯氧胺诱导的心Tie2-CreERT2; PPARδ动物表现出温和upregulation PPARβ/δ和钙调磷酸酶表达相比,心脏血管细胞vehicle-treated动物(图1 (b))。相比之下,PPAR无显著变化β/δRNA表达水平在全心准备可以发现(图1 (c)),另外确认血管PPAR的特异性β/δ超表达,内皮细胞只贡献约百分之七的细胞总数在鼠标的心20.]。心脏血管密度的增加变得明显在RNA(图1 (c))以及在蛋白质水平(图1 (d))已经Cre-mediated血管PPAR后一周β/δ超表达。此外,增加心脏以挪士表达增强心脏血管生成(图确认1 (c))。通过免疫组织化学方法检测Pecam-1蛋白质表达的允许确定这upregulation Pecam-1微血管的形成是由于新(相比之下,见图1 (d)正确的显微照片,描绘了更高的微脉管的形成Tie2-CreERT2; PPARβ/δ动物比vehicle-treated诱导与三苯氧胺Tie2-CreERT2; PPARβ/δ动物在左边或他莫昔芬治疗Tie2-CreERT2动物在中间)。测定Pecam-1区域密度表示(图一倍Pecam-1积极的血管结构1 (d))。这种血管生成反应PPAR转基因超表达β/δ在内皮也观察到肾和胰腺(图1 (e)),表示一般proangiogenic PPAR的行动β/δ在内皮细胞。这些发现与之前的研究一致,报告船舶密度在药理PPAR的快速增强β/δ激活(6,14)和PPAR的普遍观点β/δ作为proangiogenic因素(21]。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.2。特定的PPAR血管过度β/δ诱发心脏肥大
已经一个星期后PPAR的感应β/δ表达血管,很明显,心脏增长相比,动物与Cre-mediated复合增强控制,vehicle-treated Tie2-CreERT2; PPARβ/δ和Tie2-CreERT2老鼠用他莫昔芬治疗。心脏/体重测量证实了肉眼观察。这种增长感应更加提高了三周后,保持稳定的长达两个月,最新的时间点(图进行了研究2)。心脏的增长的原因是增加心肌细胞大小,由心肌细胞直径测量在不同的时间点。平均而言,心肌细胞直径增加约30%相比各自的控制(图3)。血管形成胚胎发育过程中是至关重要的器官增长;例如,冠状血管形成的抑制破坏心脏增长(22];然而,因素决定成年有机体器官大小不是完全理解,但也有一些证据表明,在组织修复或在生理刺激血管形成是所需的器官肿大(23]。一些证据表明,至少对心脏血管增长确实导致增加心脏质量在正常情况下来自一个研究使用转基因小鼠cardiomyocyte-specific开/关regulatable系统分泌的PR39 proangiogenic因素。作者得出结论,三周后观察到心肌肥大是由于诱导血管生成。他们建议不增加生产由于质量增加内皮细胞介导的观察肥大(24]。这是按照我们发现增强以挪士表达的小鼠的心vascular-specific PPAR的过度β/δ(图1 (b))。然而,PR39巨噬细胞衍生肽,抑制缺氧诱导因子1的退化α通过诱导VEGF蛋白,从而激活血管生成和纤维母细胞生长因子信号作用于心脏和其他细胞类型。因此不可以排除这部分在这项研究中观察到的效果是由于行动PR39其他细胞类型的心脏相比,唯一的内皮细胞。我们可以观察心脏肥大已经一周后vascular-specific PPAR的过度β/δ主要是由于过度PPAR吗β/δ在内皮细胞,诱导血管生成导致心肌细胞的肥大。我们的方法是更直接针对proangiogenic因素像PR39通过心肌细胞的分泌,从而影响其次内皮和最后的增加心肌细胞大小完全归因于增加血管生成。然而,在上述研究中,它不能被排除在外,迫使proangiogenic分子通过心肌细胞的分泌也作用于其他细胞相比,只有内皮细胞,包括心肌细胞本身。PPAR的endothelial-specific条件感应β/δ在我们的模型排除了一个潜在的并行干扰可能持续的行动在其他心脏细胞类型。
3.3。PPARβ/δVascular-Specific过度也会增加毛细血管密度在心肌梗死的设置,但不能改善慢性缺血性心脏病后的结果
PPAR的影响进行调查β/δ血管生成在病理性心肌功能设置,驱动(小伙子)冠状动脉左前降枝的Tie2-CreERT2; PPARβ/δ动物与他莫昔芬诱导或处理车辆的结扎。Pecam-1表达的免疫组织化学研究表明显著增加毛细血管密度不仅在梗死区还在边境地带的在偏远的心肌梗塞的面积和区域的右心室Tie2-CreERT2;PPARβ/δ动物诱导与汽车相比它莫西芬治疗。这是另外经量化Pecam-1区域密度(图4)。心脏/体重的决心证明vascular-specific肥厚性效应PPAR的过度β/δ慢性缺血性心脏病的设置,由于心肌细胞大小的增加(图5(一个))。有趣的是,组织学分析显示更大的梗塞大小动物vascular-specific PPAR的过度β/δ与控制(图5 (b))和一个增强心脏纤维化,由Picrosirius红染色胶原蛋白(图5 (c))。这与研究使用cardiomyocyte-specific开/关regulatable proangiogenic因子的分泌系统PR39从心肌细胞;的分泌PR39减少心肌梗死后梗死大小(24]。然而,正如之前提到的,这项研究是基于PR39的影响,巨噬细胞衍生proangiogenic分子,可能作用于心脏细胞类型而不是仅仅在内皮细胞。我们的研究结果与临床研究协议表明心脏肥大作为动脉硬化的危险因素,心肌梗死,心力衰竭(25]。这可能是由于肥厚性心肌能量消耗的增加。
(一)
(b)
(c)
测试是否血管生成诱导心脏肥大影响心脏功能,我们执行premyocardial三周postmyocardial梗死超声心动图检查Tie2-CreERT2; PPARβ/δ动物诱导与他莫昔芬和各自的控制处理车辆。符合观察心脏肥大,老鼠vascular-specific PPAR的过度β/δ显示左心室舒张末期(lv)和增加收缩压(母体)体积。部分缩短和射血分数略减少相比各自的控制(图6(一))。
(一)
(b)
三周后心肌梗塞,控制Tie2-CreERT2; PPARβ/δ动物处理车辆还显示左心室舒张和收缩量的增加以及减少部分缩短和射血分数相比,慢性缺血性心脏病之前他们的健康状态。然而,情况更糟的小鼠vascular-specific PPAR的过度β/δ;lv和母体体积都高度增加,部分缩短和射血分数严重减少(图6 (b))。大多数研究归因于PPARβ/δ心血管的作用,在体外和在活的有机体内数据表明,PPARβ/δ抑制心肌细胞凋亡(26],防止lipotoxicity [2),减少心肌细胞肥大(27),如果在心肌细胞,减少由于缺血/再灌注心肌损伤(5]。动物对待PPARβ/δ受体激动剂显示心脏血管的迅速增加和增强心脏增长没有功能障碍(6]。好像PPAR之间的适当平衡β/δ激活内皮细胞和心肌细胞(或者其他心脏细胞与成纤维细胞)需要限制PPAR的属性“护心”β/δ。我们的研究结果表明,特定的、不平衡的PPAR激活β/δ只有在脉管系统,尽管其对血管和心脏的影响增长,不足以防止慢性缺血性心脏病。然而,有可能是PPAR的激活β/δ脉管系统可能的有利影响较小的梗塞大小的设置或在慢慢发展中动脉硬化,这将是未来研究的主题。
4所示。结论
在这项研究中,我们调查的影响vascular-specific PPAR的过度β/δ在心脏表型和功能。的快速感应心脏血管的形成是伴随着一个感应心脏生长,表现为心肌细胞直径的增加。心肌梗死后,增加心脏血管生成减少梗塞大小和改善心脏功能。PPAR的适当平衡β/δ激活不同心脏细胞类型可能是PPAR的重要潜在的心血管效应β/δ。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
PPARβ/δ液氧+ /−动物被m Rassoulzadegan和p·格里马尔迪友情提供。基金会支持的研究是Cœur等阿特(FCA R09038AA),协会倒说是关于癌症(R13026AA-ARC-WAGNER)和法国基金会(FDF-U1081-WAGNER)。支持的工作是法国政府(国家研究机构,ANR)通过“投资未来”LABEX SIGNALIFE程序(参考ANR - 11 - labx - 0028 - 01)。作者感谢a . Borderie s Destree m . Radjkhumar p·洛佩兹,m . Cutajar-Bossert和s . m .瓦格纳技术援助。