文摘

转化生长因子β1 (TGFβ1)促进纤维化等机制,激活沉寂的成纤维细胞为myofibroblasts和增加细胞外矩阵的表达式。最近的工作表明,过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ)是一个负面TGF调节器β1-induced纤维化的事件。然而,我们假设被PPAR antifibrotic通路介导γ受到了TGFβ1、对纤维发生造成不平衡。与此一致的是,主鼠主肺成纤维细胞对TGF做出回应β1 PPAR的差别与持续对这些γ记录。这种效应在肺成纤维细胞缺乏Smad3抑制,转录因子介导许多TGF的影响β1。矛盾的是,TGFβ1 PPAR的刺激激活γ基因启动子和诱导PPAR的磷酸化γ原发性肺成纤维细胞。TGF的能力β1调节PPAR的转录活动γ测试在NIH / 3 t3成纤维细胞含有PPAR吗γ响应的荧光素酶的记者。在这些细胞,刺激TGFβ1 TGF信号与既定的活跃β1受体转基因PPAR被削弱γPPAR端依赖记者troglitazone引起的表达式γ激活。过度的PPARγ预防TGFβ1镇压troglitazone-induced PPARγ端依赖基因转录,而coexpression PPARγTGF Smad3转基因重现β1的影响。我们得出结论,PPAR的调制γ由TGF控制β1,在通过Smad3信号部分,涉及PPAR的监管γ表达和转录的潜力。

1。介绍

转化生长因子β1 (TGFβ1)是一种多晶的生长因子和抗炎profibrotic属性被牵涉进很多形式的自然和实验组织纤维化(<一个href="#B1">1]。在肺癌、TGFβ1是由上皮细胞,肺泡巨噬细胞和组织,后成纤维细胞暴露在有害的药物如二氧化硅、博来霉素、氧过多,百草枯等(<一个href="#B2">2]。TGF的关键作用β1已经确认在肺纤维化动物研究表明肺纤维化的发展与TGF转染β1-producing腺病毒,通过工作证明针对TGF抑制实验性肺纤维化的干预措施β1或其下游信号[<一个href="#B3">3,<一个href="#B4">4]。

TGF profibrotic效果β1主要是,但不完全,由胞内信号引发的转录因子Smad3 [<一个href="#B5">5]。TGFβ1 / Smad3信号刺激结缔组织表达和epithelial-mesenchymal过渡,肺纤维化的发展[事件被认为是关键<一个href="#B6">6]。在成纤维细胞,TGFβ1 / Smad3信号刺激分化转化成myofibroblasts和矩阵基因的表达像纤连蛋白和胶原蛋白(<一个href="#B7">7]。重要的是,TGF击倒β1 / Smad3信号通路抑制实验性肺纤维化(<一个href="#B8">8]。在免疫介导气道纤维化的模型中,我们演示了抑制myofibroblast分化转移和矩阵沉积在动物缺乏Smad3 [<一个href="#B9">9]。

考虑它的重要性在肺纤维化的发展,研究针对TGF调查的因素控制β1 / Smad3信号加剧了。这项研究的探索过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ)ligand-activated核激素受体超家族成员能力著称的转录因子调节葡萄糖和脂类代谢与胰岛素敏感性,动脉粥样硬化,和炎症<一个href="#B10">10,<一个href="#B11">11]。在我们的实验室初步研究表明PPARγ抑制TGF的影响β1通过直接与Smad3交互(拉米雷斯et al .,未发表的观察)。此外,其他人则证明了TGF防护β1-induced myofibroblast分化转化细胞中PPAR对待γ催化剂(<一个href="#B12">12]。

这些观察表明PPAR的有前途的作用γ活化剂治疗肺纤维化疾病。然而,我们想知道TGFβ1影响PPARγ在组织表达和/或激活。为了测试这个想法,我们检查了TGF的影响β1 PPARγ在初选鼠肺成纤维细胞,发现TGFβ1、通过Smad3信号不同控制PPARγ表达水平、转录激活。这些观察表明,TGFβ1 / Smad3信号触发profibrotic事件,而与此同时影响PPAR的表达γ。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

NIH / 3 t3成纤维细胞从写明ATCC购买。主要从Smad3-deficient小鼠和野生型C57BL / 6小鼠肺生成和维护(如前所述)(<一个href="#B7">7,<一个href="#B9">9]。主肺成纤维细胞之间使用段落2 - 10在所有的实验条件。表示,serum-starved成纤维细胞第一次使用1小时TGF的存在与否β1 (10 ng / mL)(研发系统,明尼阿波利斯,美国)孵化10紧随其后μtroglitazone M(开曼化学,安阿伯市,美国)为指定的时间。研究动物研究机构审查委员会批准。

2.2。西方的屁股

完整的细胞提取物进行了处理和分析所描述(<一个href="#B7">7,<一个href="#B9">9与抗体phospho-PPAR]γ(美国Billerica的微孔,MA)和PPARγ蛋白(细胞信号技术)。β肌动蛋白是用作控制(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.3。逆转录-聚合酶链反应

总RNA分离和测试(如前所述)(<一个href="#B7">7]。小鼠正向和反向引物的PCR反应是基于基因银行发表的序列如下:PPARγ(5′广汽CAC TCG猫苑TTT-3′;5′cca CAG行动CGG CAC TCA-3′)和28 s rRNA(5′ttg AAA ATC CGG GGG AGA-3′;5′aca TTG TTC CAA猫GCC AG-3′)。扩增子决定1%琼脂糖凝胶,用溴化乙锭染色,显示为一个紫外线透照器。

2.4。免疫荧光显微镜

一个phospho-PPARγ抗体应用于paraformaldehyde-fixed,特里同x - 100 permeablized细胞在4°C隔夜紧随其后的是一个Alexa萤石555 -标记anti-rabbit二级抗体(表达载体)。幻灯片和延长cover-slipped黄金安装介质(表达载体),在数字化的显微镜下观察(美国奥林巴斯BX41,梅尔维尔,我)。图像捕获使用MagnaFire 2.1数字图像采集软件(Goleta、钙、美国)。

2.5。质粒

小鼠pCMX-PPARγ(<一个href="#B13">13)和人类的PPARγ启动子(<一个href="#B14">14]从l·詹姆逊慷慨的礼物,(美国西北大学、芝加哥、IL)和蔡玫哈特(美国佐治亚州亚特兰大埃默里大学),分别。Flag-Smad3 AP2 (PPRE)卢克,TβRI (CA)从Addgene购买(数字14827、8858和14833年,分别地。、剑桥、马、美国)。

2.6。转染和记者研究

磷酸钙瞬时转染协议后(<一个href="#B15">15]。短暂,融合50%,细胞暴露在新鲜增长媒体1小时。DNA沉淀是申请24小时。细胞被洗,无血清培养系统6小时完成媒体,作为表示。对记者分析,治疗细胞细胞溶解使用5 x被动裂解缓冲(美国WI Promega,麦迪逊)和荧光素酶试剂,制备据戴尔et al。<一个href="#B16">16]。与热发光测量Luminoskan提升光度计(美国沃尔瑟姆,MA)和归一化Renilla活动(<一个href="#B16">16]。

2.7。数据分析

西方墨点法和rt - pcr实验进行重复和重复至少三次,以确保一致性。记者和扩散数据也重复三次每3 - 4 /复制实验。所有结果都意味着±SE。GraphPad棱镜v3.0被用来分析数据通过单向方差分析计算图基的多个比较测试。一个P价值0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。TGF的影响β1 PPARγ表达式

开始评估TGF的影响β1 PPARγ表达,我们首先进行PPAR测试γ肺成纤维细胞的基因转录。后小而无意义的PPAR的增加γ表情,原发性肺成纤维细胞的PPAR差别显示一个戏剧性的对这些γ信使rna表达TGF。一个小时后开始β1、坚持至少48小时(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2012/375876/fig1/" target="_blank">1(一))。确定机制转化生长因子β1可能调节PPARγ表达式,我们对转录因子的作用和TGFβ1细胞内传感器,Smad3。肺成纤维细胞,主要是从Smad3-deficient小鼠和野生型小鼠的肺部同一遗传背景和培养在TGF的存在与否β1(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2012/375876/fig1/" target="_blank">1 (b))。在野生型原发性肺成纤维细胞,TGFβ1表达下调PPARγ信使rna表达如前所展示。然而,这种效应在细胞缺乏Smad3大大减弱,这表明Smad3信号负责PPAR的抑制γTGF中观察到的基因表达β1-treated成纤维细胞。

测试如果PPAR的抑制γ表达式由TGFβ1 / Smad3信号发生在基因启动子,NIH / 3 t3成纤维细胞转染了人类PPAR全身γ启动子的结扎荧光素酶记者(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2012/375876/fig1/" target="_blank">1 (c))。然而,而不是抑制PPARγ表达,我们观察到TGFβ1 PPAR的刺激活动γ基因启动子。

3.2。TGF效果β1 PPARγ磷酸化

接下来,我们决定如果TGF)β1可以诱导PPARγ转译后的修改,即磷酸化、TGFβ1激活细胞内信号分子的能力。为此,主要与TGF肺成纤维细胞治疗β1在几个不同的时间点和phospho-PPAR检查γ与抗体检测磷酸化丝氨酸PPAR的82γ1(对应于丝氨酸PPAR的112γ2)。通过免疫印迹,PPAR的磷酸化γ在3小时内检测到的TGFβ1接触,最大的影响在6小时,但持久的刺激,当实验结束后24小时(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2012/375876/fig2/" target="_blank">2(一个))。在平行实验,phospho-PPARγ是免疫荧光可视化的核间TGF开始后的一个小时吗β1治疗,三小时后达到高峰,但主要是缺席6个小时(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2012/375876/fig2/" target="_blank">2 (b))。

3.3。TGF的影响β1 PPARγ端依赖基因表达

然后我们调查了TGF功能的影响β1信号PPAR的转录功能γPPAR后激活γ配体,troglitazone。这些实验在NIH / 3 t3成纤维细胞含有荧光素酶记者PPAR的推动γ响应的元素。换句话说,荧光素酶诱导表明PPAR的刺激γ端依赖基因表达。如图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2012/375876/fig3/" target="_blank">3(一个),troglitazone刺激PPARγ演示的激活troglitazone诱导PPAR的能力γ端依赖基因转录。这种效应,削弱了constitutively-active I型转化生长因子的过度β受体,Tβ国际扶轮或activin-like激酶5 (ALK5),表明TGF的角色βTGF 1受体激活β1-dependent镇压PPAR的基因转录γ。然而,PPAR的转录抑制能力γ由TGFβ1信号被强迫克服长篇PPAR的过度γ基因(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2012/375876/fig3/" target="_blank">3 (b))。正如预期的那样,当一个Smad3转基因是cotransfected PPARγ转基因在化学计量的等量,TGFβ1又能部分抵消PPAR的激活γtroglitazone引起的响应基因启动子(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2012/375876/fig3/" target="_blank">3 (c))。这些数据表明TGF的刺激βTGF 1-dependent途径,通过激活β1受体和Smad3信号,调节PPAR的活动γ在基因转录。

4所示。讨论

我们的研究表明,TGFβ1影响PPAR的表达和活性γ与潜在影响肺部炎症和纤维化。PPARs被认为是万能ligand-activated核激素受体超家族的成员包括类固醇受体的转录因子,甲状腺激素,视黄酸,维生素D等(<一个href="#B10">10,<一个href="#B11">11]。PPARs被认为扮演关键角色在不同生理过程从脂质代谢炎症和疾病,如涉及癌症,动脉粥样硬化,肺损伤(<一个href="#B17">17]。三种亚型的PPARs已确定和克隆:PPARα,PPARβ/δ,PPARγ。的三个PPARs确定到目前为止,PPARγ代表了最有前途的PPAR目标在肺部疾病的新兴报告暗示这个分子在各种肺过程(<一个href="#B17">17]。重要的是,PPARγ被描述为消极的调节巨噬细胞功能的激活抑制炎性细胞因子的生产以来,趋化因子,金属蛋白酶和一氧化氮<一个href="#B18">18]。这些PPARγ介导的抗炎作用不限于与PPAR单核细胞的细胞治疗γ在抑制细胞因子和趋化因子受体激动剂结果生产其他细胞(<一个href="#B18">18- - - - - -<一个href="#B20">20.]。最近,据报道,PPARγ激活物抑制TGFβ1-induced myofibroblast分化转移(<一个href="#B12">12]。

在病变组织,PPARγ表达式被证明与TGF负相关β1 (<一个href="#B21">21]。因此,看来TGF之间的平衡β1和PPARγ可能决定等因素,纤维发生组织损伤后主导。然而,在许多病人和在实验模型中,内源性PPARγ无法计数的影响TGF吗β1。我们认为,组织损伤导致的表达因素抑制PPAR的能力γ表达式或削弱其antifibrotic效果。我们进一步假设TGFβ1本身可以直接影响PPARγ表达式。这里的观察报告显示,这确实是如此。我们观察到,TGFβ1有一个早期,但瞬态,PPAR诱导效应γ信使rna表达主要肺成纤维细胞;这种效应可能是由于TGF的能力β1诱导PPARγ基因转录(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2012/375876/fig1/" target="_blank">1)。这与PPAR早期效应有关γ信使rna翻译成蛋白质和PPAR的磷酸化γ蛋白质。然而,这种影响后来与深刻的PPAR抑制有关γ信使rna的积累。负责后期效果的具体机制不明,但信使rna降解可能增加。根据这些观察,我们假定TGFβ1的表达和/或激活受伤组织与早期感应counterregulatory因素有关,PPARγ。然而,TGF的持久性β1表达/激活结果抑制PPAR年末γ信使rna的积累。应该强调,这种“两相的”TGF的效果β1 PPARγ(早期刺激和晚期镇压)已经被别人观察研究TGF的行为β1 PPARγ血管平滑肌细胞中表达(<一个href="#B22">22]。研究这些影响时,必须考虑细胞类型和其他因素可能会影响观察的响应。例如,其他人则证明了TGFβ增加PPARγ在H460细胞中表达,而不是Ch27细胞,而核积累p-Smad3只是Ch27细胞中观察到的<一个href="#B23">23]。

有趣的是,尽管晚PPAR的抑制γ信使rna的积累,我们观察到持续的PPARγ磷酸化TGF后至少24小时β刺激(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2012/375876/fig2/" target="_blank">2)。然而,这没有与持续的核PPAR的本地化γ通过细胞化学(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2012/375876/fig2/" target="_blank">2 (b))。这些事件负责的机制尚不清楚。

我们还研究了Smad3信号的作用效果观察。我们发现Smad3似乎调解,至少部分TGF的影响β1自细胞缺乏Smad3显示TGF的削弱β1对PPAR downregulatory影响γ。这不是令人惊讶的考虑到Smad3介导许多TGF的影响β1组织。这些数据是一致的观察在真皮成纤维细胞<一个href="#B21">21]。在其他工作中,我们报道,激活P38 MAPK在TGF扮演的角色β1-induced myofibroblast分化转移(<一个href="#B7">7),和其他记录TGF之间的相互作用β1和MAPKs在其他系统(<一个href="#B24">24]。林et al。(2011)报道,TGFβ全身的PPAR的表达γp38的激活有关,但这是测试H460细胞癌(<一个href="#B23">23]。有趣的是,他们还表明,PPARγ1可以绑定Smad3 p-Smad3。郑、陈,另一方面,报道称外生TGFβ抑制PPARγ表达在活化肝星状细胞和出现介导通过Smads [<一个href="#B25">25]。此外,与我们的数据一致,阻塞TGFβ主导- II型TGF信号β受体增加PPARγ。白菜和Derynck(2003)报道,TGFβ抑制脂肪生成信号通过Smad3,反过来,与C / ebp导致PPAR的转录抑制γ2启动子(<一个href="#B26">26]。

上述研究表明,TGFβ1控制PPARγ转录、信使rna的积累和蛋白质磷酸化微分方法。考虑到许多TGF点β1可能影响PPARγ表达和激活,这些研究并没有允许我们预测TGF的整体效果β1 PPARγ函数。这个关键问题解决了测试细胞转染PPARγPPAR转录响应元素只有在激活γ进入细胞核和与目标基因。测试系统,我们首先表明,troglitazone PPARγ激活,刺激PPARγ端依赖基因表达(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ppar/2012/375876/fig3/" target="_blank">3(一个))。有趣的是,持续活跃的转化生长因子的表达β1受体,TGFβ1国际扶轮,减少的影响troglitazone暗示这种受体在介导TGF的影响β1。在一起,TGFβRII和TGFβ国际扶轮形式中的激活能刺激下游信号的复杂像Smads<一个href="#B27">27]。

正如所料,PPAR的抑制转录的能力γ由TGFβ1被强迫克服长篇PPAR的表达式γ基因。这是一个重要的观察,因为它表明,针对TGFβ1 / PPARγ平衡提高PPARγ激活可能潜在的治疗相关性。几个天然和合成化合物已经被确认为PPAR的活化剂γ。的insulin-sensitizing抗糖尿病的药物称为thiazolidinediones确认为PPAR是第一个化合物γ受体激动剂(<一个href="#B28">28];troglitazone,本报告中使用,是一个thiazolidinedione,但它不再是商业上可用由于肝毒性<一个href="#B29">29日]。然而,其他thiazolidinediones可用,处于临床试验阶段,在不同的地区。

最后,我们测试的角色Smad3 cotransfecting Smad3和PPAR”细胞γ转基因在化学计量的等量。和之前一样,TGFβ1能部分抵消PPAR的激活γtroglitazone引起的响应基因启动子。这些数据表明TGF的刺激βTGF 1-dependent途径,通过激活β1受体和Smad3信号,调节PPAR的活动γ在基因转录。

总之,PPAR的调制γTGF控制的复杂吗β1,在通过Smad3信号部分,涉及PPAR的严格监管γ表达水平和转录的潜力。这些机制开始解释TGFβ1是能够克服PPAR的抗炎和antifibrotic效果γ并有可能影响在活的有机体内。PPAR的商业可用性γTGF活化剂的倾斜β1 / PPARγ资产减少,推迟,甚至逆转纤维化提出针对PPAR的可能性γ在人类与纤维化肺病。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

这个工作是由国家卫生研究院NHLBI格兰特1 k08hl077533 (a . Ramirez)。