文摘

PPAR配体已经被证明在许多细胞类型有抗增殖作用。我们在此报告一个合成显性负(DN) PPAR突变体的功能就像一个生长因子促进细胞周期进程和人类冠状动脉平滑肌细胞细胞增殖(CASMCs)。在静止CASMCs adenovirus-expressed DN-PPAR提升G1细胞周期进程,增强BrdU合并,增加细胞增殖。DN-PPAR表达也显著增强细胞周期的积极监管机构,增加Rb和CDC2磷酸化和细胞周期蛋白的表达,B1, D1和MCM7。相反,过度的野生型(WT)或constitutively-active PPAR (CA)抑制细胞周期进展和积极监管机构的活动和表达的细胞周期。DN-PPAR表情,然而,没有在PPAR积极调控细胞周期调控有缺陷的细胞,强烈建议DN-PPAR影响细胞周期阻断内源性野生型PPAR的作用的结果。DN-PPAR表达增强的磷酸化ERK MAPKs。此外,ERK的抑制DN-PPAR PD98059阻塞全身的Rb和表达的细胞周期蛋白的磷酸化和MCM7。我们的数据表明DN-PPAR促进细胞周期进程和细胞生长在CASMCs调制基本细胞周期调节蛋白和MAPK促有丝分裂的信号通路在血管平滑肌细胞(VSMCs)。

1。介绍

VSMC增殖是早期对动脉壁损伤,以及更广泛的血管重建的主要事件增加和动脉粥样硬化病变(内膜-中膜厚度1]。损坏和激活VSMCs分泌生长因子和细胞因子,引发多种促有丝分裂的信号通路,包括Ras / Raf MEK / ERK信号级联(2]。ERK激活诱导细胞周期蛋白D1表达式,从而促进cyclinD1-CDK4/6复杂的形成,静止细胞进行细胞周期的关键一步条目(3]。活跃cyclinD1-CDK4/6复合物使磷酸化蛋白质视网膜母细胞瘤(Rb),释放隐藏E2F绑定到hypophosphorylated Rb促进S期所需的关键细胞周期基因转录DNA复制(4]。E2F释放诱导调控蛋白的表达与染色体DNA复制的起始步骤,如minichromosome维护(MCM)的蛋白质,而被雇来复制起源细胞周期G1期期间,建立这些DNA复制起始的起源的能力在随后的S期(5]。

几组,包括我们自己的,表明PPAR配体,如噻唑烷二酮类),在体外抑制VSMC增殖和细胞周期进展(6- - - - - -11和内膜的增生体内7]。尽管有广泛的研究,然而,机制(s)潜在的PPAR的抗增殖作用配体在VSMC仍有待确定。罕见和自然PPAR突变与胰岛素抵抗有关,高血压,和血管肥大(12- - - - - -14),大多数的突变迄今报告中发现的受体的配体结合域(精神的小黑裙)(15]。格内尔et al。16人工PPAR)创建了一个小黑裙突变引入L486A E471A氨基酸替换。这个突变体表现出显性负活动,抑制的活动cotransfected WT PPAR和屏蔽TZD-induced脂肪生成3 t3-l1 preadipocytes。这个突变的深刻的显性负影响归因于释放辅阻遏物受损(NCoR和SMRT)和减少招聘的辅活化因子(CBP和SRC)。一个DN-PPAR构造已经被证明可以促进neointima形成balloon-injured鼠动脉和增强VSMC增殖和迁移17]。他们报告说,创伤性内膜中层比率(IMR)减少在动物感染腺病毒表达WT PPAR;然而,老鼠感染腺病毒表达DN-PPAR显示出了明显imr比未经处理的控制,无论PPAR配体的治疗。最近,Meredith et al。18)表明,VSMC隔绝转基因老鼠窝藏PPAR的显性负突变显示更大的扩散和迁移VSMC孤立于野生型小鼠相比。

基于这些研究,我们假设DN-PPAR突变会引起反抗WT-PPAR活动取消或逆转对VSMC细胞生长的影响。因此,我们检查DN-PPAR的效果表达在细胞周期进展,G1, G2 / M细胞周期调控,MAPK在VSMCs,发现DN-PPAR促有丝分裂的信号通路促进了积极的表达和活性细胞周期的监管机构,G1年代发展和细胞增殖,这些影响是通过ERK激活介导的。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

主要人类CASMCs SmGM-2和SmBM细胞培养基从Cambrex购买(Walkersville博士)。早期的通道(4 - 9)CASMCs培养75%的融合SmGM-2生长介质,然后培养从24到48小时SmBM基础培养基补充0.4%的边后卫诱导细胞周期阻滞。鼠标PPAR缺陷的胚胎干细胞(ES)提供的细胞被好心的r·埃文斯(霍华德休斯医学博士,Ins。Lo拉,CA)和前面描述的19]。小鼠胚胎成纤维细胞作为主要ES馈线细胞从干细胞技术购买(加拿大温哥华BC)。ES细胞与ES-Cult产品维护和分化(干细胞技术)根据制造商的协议。

2.2。腺病毒程序

一个包含完整的人类野生型PPAR的表达载体1 (20.)请提供的亚历克斯博士Elbrecht(默克研究实验室,怀特豪斯站,新泽西),和用于创建DN-PPARdouble-mutant被格内尔et al。16]L468A的突变和E471A使用QuikChange多定点诱变工具包(Stratagene拉霍亚,CA)。一个包含constitutively-active鼠标PPAR的表达载体1 (CA-PPAR)突变体,由融合单纯疱疹VP16 transactivation域鼠标WT PPAR的n端1 (21),是一种礼物从巴里·福尔曼博士(希望之城医疗中心,Duarte, CA)。只一个表达式向量编码VP16 transactivation域(pTet / VP16)从Clontech购买。腺病毒表达WT-PPAR(背景),DN-PPAR(Ad-DN) CA-PPAR(Ad-CA) VP16 transactivation域(Ad-VP16)和绿色荧光蛋白(Ad-GFP)创建Adeno-X表达系统(Clontech山景,CA)根据制造商的协议,经DNA测序,然后扩大在HEK293细胞纯化Adeno-X病毒净化用品(Clontech)。病毒滴度测定与Clontech Adeno-X快速效价装备,使用和病毒在感染复数(MOI)的20到80感染性粒子每个细胞,如表示。CASMCs被文化growth-arrested SmBM基础培养基的0.4%的边后卫24至48小时,48小时前表示,感染腺病毒。指定的文化补充有或没有血清,生长因子或ERK MAPK抑制剂PD98059(细胞信号技术,丹弗斯,MA)在指定的时间和条件。

2.3。荧光素酶检测

NIH / 3 t3细胞(美式文化收藏、马纳萨斯,弗吉尼亚州)转染48小时有1g DN -、WT -或CA-PPARCMV-renilla荧光素酶质粒DNA,和5 ng (pRL-CMV;Promega,麦迪逊,WI)和1克酰coa氧化酶PPAR响应元件(PPRE 3 x) -tk-firefly荧光素酶DNA (Peter Tontonoz博士的礼物,加州大学洛杉矶分校)使用LipofectAMINE 2000(表达载体,罗克维尔市,MD)根据制造商的协议。转染24小时后,细胞治疗10M罗格列酮(显示)在DMSO或DMSO孤单。荧光素酶活性与双荧光素酶转染后48小时化验后记者分析系统(Promega)制造商的指示。PPRE-driven萤火虫荧光素酶活性是规范化CMV-driven renilla荧光素酶活性调节的不同转染效率。

2.4。细胞周期分析

serum-starvation之后,CASMCs用于被感染病毒的细胞周期分析48小时有或没有PDGF +胰岛素,然后resuspended胰蛋白酶化,离心5分钟,享年250岁g,用PBS,离心5分钟,享年250岁g,吸气将上层清液从细胞颗粒。CASMC DNA染色的细胞球被resuspended缓冲区(3.4毫米醋酸钠,0.3% Triton x - 100, 1.5毫米propidium碘,和20g / mL核糖核酸酶在4°C)和孵化30分钟。细胞核染色流式细胞术收购的数据使用FACScan正欲,和细胞的比例在G0 / G1, G2 / M期测定ModFit LT正欲使用软件。

2.5。DNA合成和细胞增殖化验

CASMCs用于BrdU合并和细胞增殖测定生长60毫米板融合75%,serum-starved SmBm 48小时的基础培养基含有0.4%的边后卫,与腺病毒感染48小时表达GFP, DN -或CA-PPAR。细胞被胰蛋白酶化然后resuspended和山肩96 -孔板的密度细胞/好,培养3天SmBm基础培养基含有0.4%的边后卫。BrdU合并分析然后使用商用BrdU免疫测定(Calbiochem,圣地亚哥,CA)根据制造商的指示。被感染病毒的细胞用于DNA增殖分析48小时然后recultured 12-well板块细胞/ 3天在SmBm基础培养基含有0.4%的边后卫。细胞被胰蛋白酶化然后resuspended和血细胞计数器的计数。

2.6。免疫印迹分析

如前所述CASMC完整的细胞溶解产物生成(22),大小分级,sds - page和转移到Hybond ECL硝化纤维素膜(Amersham生物科学,皮斯卡塔韦,新泽西)前免疫印迹分析。特定抗体phospho-Rb (Ser807/811) phospho-cdc2 (Thr161),细胞周期蛋白D1,磷的和总ERK (p44/42)和辣根过氧化物酶共轭二次抗体购自细胞信号技术。细胞周期蛋白(sc - 751), MCM7 (sc - 9966), p21 (sc - 6246), p27 (sc - 1641)和PPAR(sc - 7196)特定抗体购自圣克鲁斯生物技术。特定的抗体细胞周期蛋白B1 (05 - 158;微孔),GFP和β肌动蛋白(Abcam、剑桥、MA)和VP16 (Clontech)从指定的公司购买。特定的抗体杂交检测使用ECL试剂和x射线胶片(Amersham)和产生的信号被测密度术量化。免疫印迹蛋白质表达规范化肌动蛋白,除了pERK1/2,对总ERK1/2规范化。

2.7。统计分析

数据给出平均值±标准平均误差(SE)。由2-tailed学生的各个组之间的差异进行了分析以及或1路的方差分析(方差分析)其次是Tukey-Kramer期末测验来确定个体之间的差异意味着当比较多个组。一个价值,对于所有的测试被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。DN-PPAR表情完全抑制WT-PPAR活动

NIH / 3 t3成纤维细胞,不表达检测PPAR(23),与PPRE-luciferase记者向量和质粒转染表达WT - DN -或CA-PPAR,或空的表达载体在PPAR的存在与否配体显示(图1)。配体治疗荧光素酶活动增加三倍与WT-PPAR细胞转染向量。细胞转染CA-PPAR矢量显示荧光素酶活性大于13倍增加相比与空的表达载体转染结构。转染与DN-PPAR有或没有显示,不导致明显的荧光素酶活性相对于基准面的变化。然而,当cotransfected WT-PPAR,突变PPAR压抑WT-PPAR转录活动58%(图1)。这些数据同意之前报道的结果16),确认L486A / E471A double-mutant PPAR表现为一个完全抑制野生型PPAR的显性负活动。

3.2。DN-PPAR促进G1发展和细胞生长

为了评估DN-PPAR的效果表达在细胞循环发展,CASMCs血清饥饿诱导细胞周期阻滞于G0 / G1,感染Ad-GFP, Ad-CA或Ad-DN,然后接受PDGF +胰岛素刺激细胞周期进程。流式细胞术分析(图2)表明,CASMCs Ad-GFP感染细胞周期配置文件类似于未感染细胞在细胞周期的所有阶段,在逮捕和刺激增长。CASMCs Ad-DN感染,然而,显著降低细胞的数量在G0 / G1期细胞周期的感染和Ad-GFP感染细胞相比,逮捕在增长(65.0%,77.2%和76.9%)和刺激(39.4%比57.0%和55.8%)。Serum-starved CASMCs感染Ad-DN S期细胞比例的增加,相对于未感染和Ad-GFP感染CASMCs(22.6%, 11.3%和12.5%),但显示相似比例的细胞G2 / M。刺激这些细胞PDGF和胰岛素增加的百分比S期和G2 / M期细胞,但Ad-DN感染细胞有更大比例的年代和细胞G2 / M比任何其他样本。

Serum-starved CASMCs感染Ad-CA没有显著不同于未感染或Ad-GFP感染细胞在细胞周期的任何阶段。然而,Ad-CA-infected CASMCs与PDGF和胰岛素诱导了细胞周期进展显著衰减,说明细胞周期配置文件不出现不同于增长CASMCs被捕。如图3(一个),DNA合成衡量BrdU显著增加合并Ad-DN-infected CASMCs(2.8倍与Ad-GFP),确认DN-PPAR的能力刺激G1血清饥饿条件下发展。这些发现表明,在CASMCs DN-PPAR表达促进G1年代过渡,CA-PPAR表达式可以完全阻止mitogen-stimulated细胞周期进程。这个数据与先前的报道,表明PPAR吻合良好配体可以抑制细胞周期进展,因为显性负PPAR的抑制活动推广G1在静止和模拟CASMCs年代进展,而constitutively-active PPAR似乎没有影响G1静止细胞S期过渡,但完全减毒G1S期增加通常观察到在增长和PDGF刺激胰岛素。

自从DN-PPAR刺激G1细胞周期进程和DNA合成,即使没有外生有丝分裂原,我们下一个检查DN-PPAR的能力促进细胞周期进程通过G2 / M促进CASMC扩散。如图3 (b)serum-starvation下后,为期3天的文化,Ad-DN-infected CASMCs表现出显著增加细胞数量相比Ad-GFP-infected细胞(2.1倍和1.2倍开始细胞数量,resp)。。相反,Ad-CA-infected CASMCs显示在细胞数量显著下降(0.8倍开始手机号),这也可能被解释成我们的之前的数据表明PPAR配体可以诱导VSMC凋亡[22]。

3.3。DN-PPAR诱发关键调控细胞周期蛋白的表达

自诱导细胞周期进展,DN-PPAR细胞生长表达可能导致细胞周期检查点蛋白质的变化,我们检查了发展所需的关键调控蛋白的表达在G0 / G1, G2 / M细胞周期检查点和表达的两个细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKIs)调节几个检查点蛋白质的活动。

如图4,CASMCs感染Ad-DN明显调节多个基因的活动所需的细胞周期检查点,增加Rb磷酸化(G1年代),细胞周期蛋白表达(SG2和G2米),MCM7表达式(S期DNA合成),和细胞周期蛋白B1表达/ CDC2磷酸化(G2米),这些影响主要存在剂量依赖的相关性。例如,在serum-starved CASMCs Ad-DN,我40岁,增加细胞周期蛋白B1(2倍),p-CDC2和MCM7(4倍),复审委员会(八)和细胞周期蛋白(19-fold)与serum-starved,未感染的细胞。血清诱导类似增加这些蛋白的表达(细胞周期蛋白B1, p-CDC2 MCM7 3 - 4倍,14倍,和细胞周期蛋白20倍)。类似的结果观察到当20 ng / mL PDGF + 0.1M胰岛素被用来刺激细胞增殖而不是5%的边后卫(数据没有显示)。Ad-GFP没有影响基底或serum-stimulated这些蛋白质的表达,而在没有血清刺激背景抑制只有MCM7表达式。Ad-DN剂量依赖性增加serum-induced细胞周期蛋白表达。Ad-DN感染40我只增加了细胞周期蛋白(2倍),而Ad-DN 80莫伊p-CDC2增加,复审委员会,和细胞周期蛋白表达(2 -三倍),serum-stimulation条件下。相比之下,背景和Ad-CA抑制serum-induced复审委员会的增加,细胞周期蛋白,细胞周期蛋白B1和MCM7,但不是p-CDC2。背景下减少细胞周期蛋白A和B1、MCM7和复审委员会表达30% -50%的serum-induced CASMC表达式没有外源性配体。Ad-CA明显减少复审委员会和细胞周期蛋白(2% - -3%的血清控制),细胞周期蛋白B1(控制)的12%,和MCM7(控制)的30%,表明PPAR激活强烈的表达或活动减少这些监管细胞周期蛋白。

令人惊讶的是,Ad-DN感染还增加了两个重要的蛋白质水平负监管CDKIs, p21和p27(图5),大约2倍与未感染或Ad-GFP感染样本。我们没有观察到任何Ad-DN影响CDKI p16(数据没有显示)。这些结果表明,DN-PPAR表达调控细胞周期进程的积极的和消极的监管机构。

3.4。DN-PPARPPAR对细胞周期的影响依赖

为了证实PPAR的角色在细胞周期的调控蛋白,我们检查了DN-PPAR的影响和GFP表达调控细胞周期蛋白的表达在鼠标PPAR^{- / -}胚胎干细胞(ES)细胞(19]。再次,PPAR^{- / -}呈现出胚胎干细胞的诱导细胞周期蛋白,MCM7,复审委员会对血清刺激(图表达6)。但是,与我们之前的结果与Ad-DN-infected CASMCs, Ad-DN PPAR的感染^{- / -}ES不诱导细胞周期蛋白、MCM7或复审委员会表达与Ad-GFP-infected serum-starvation或刺激条件下细胞。从微分PPAR这似乎没有结果在ES与CASMC反应,因为Ad-DN诱导的细胞周期蛋白,MCM7,复审委员会WT ES细胞中表达类似于观察CASMCs(数据没有显示)。这些数据表明,DN-PPAR对经济增长的促进作用通过内生PPAR的衰减活动来抑制细胞增殖。

3.5。DN-PPAR激活erk 1/2细胞周期蛋白的诱导表达

血清或促有丝分裂的生长因子诱导有丝分裂原激活蛋白激酶的磷酸化ERK 1, 2,激活信号转导级联,促进细胞生长。激活ERK 1/2调节细胞周期,在某种程度上,通过转导信号导致增加的细胞核的细胞周期蛋白D1的表达,G1的监管的关键蛋白S相变(2,24]。血清和Ad-DN同样诱导CASMC ERK1/2磷酸化(2 -和3重、职责)和细胞周期蛋白D1蛋白表达(10 -和19-fold resp),这两个被ERK的抑制减弱PD98059(图7(一))。同样,治疗CASMCs PD98059也减毒DN-PPAR介导的诱导一些积极的细胞周期调控(图7 (b)),这表明先前DN-PPAR观察细胞周期和生长的影响是介导的,至少在某种程度上,通过ERK1/2信号通路的激活。此外,明显减毒DN-PPAR PD98059治疗介导Rb磷酸化和细胞周期蛋白和MCM7表达,但p27的表达增加,表明DN-PPAR激发积极的和消极的表达细胞周期的监管机构通过不同的机制。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们证明了一个显性负PPAR突变窝藏L486A / E471A替换的小黑裙是一个有效的激活细胞周期进程和细胞增殖在人类CASMCs静止(serum-starved)。我们发现Rb CDC2磷酸化和细胞周期蛋白A和B1、表达和MCM7强烈诱导静止CASMCs Ad-DN感染后,一般剂量依赖性的方式。因此,DN-PPAR的促有丝分裂的活动有可能通过这些细胞周期调控蛋白介导的。血清刺激Ad-DN-infected CASMCs进一步调节这些蛋白质,而serum-induced增加这些蛋白质被背景或Ad-CA大幅抑制。我们的体外结果与最近的报告,DN-PPAR一致压制WT-PPAR的抗增殖作用并增加老鼠和老鼠动脉内膜的形成和促进VSMC增殖和迁移17,18]。Lim et al。17)也报道称,DN-PPAR移植c-fos的表达,一个重要的组成部分MAPK促有丝分裂的信号通路。

这些数据进一步有助于解释PPAR的重要功能脉管系统中已定义的vascular-specific基因敲除小鼠模型的港口核受体。最近,Halabi et al。14)开发出一种转基因小鼠与VSMC-specific DN-PPAR的表达式小黑裙突变相似L486A / E471A PPAR我们在这个报告中描述的小黑裙突变。这只老鼠发达高血压、硝酸oxide-mediated受损血管舒张、增强内皮素血管收缩反应,改变小动脉的重建和血管肥大。这只老鼠还演示了一个健壮的血管骨桥蛋白,增加粘附分子,我们展示了在加速动脉粥样硬化中发挥着关键作用,而表达式可以被PPAR镇压配体治疗(25]。老鼠cre / flox-generated内皮或VSMC-specific PPAR缺乏开发高血压也已经证明,尽管没有组织学提出了为这些模型及其血管舒张药和血管收缩剂的反应相反的那些报道VSMC DN-PPAR小鼠模型(26]。的cre /液氧模型也展示了一种削弱的昼夜血压和心率的变化(26]。最近,张等人证明VSMC-specific PPARKO小鼠表现出vasoactivity受损和低血压与增强beta-2-adrenergic活动(27]。综上所述,这些研究表明,PPAR对血管功能有着重要的影响,包括心血管调节节奏,血压,和VSMC增殖,强调定义机制调解这些行动的重要性。

CDK抑制剂,特别是如p21和p27,通常被视为强有力的G1的级联事件负调控因子诱导生长因子。在目前的研究中,p21和p27表达被DN-PPAR调节一个较小的程度上,虽然比积极的细胞周期调控。CDKIs可以防止静止细胞进入细胞周期,抑制CDK活动和防止Rb磷酸化(28]。然而,在这项研究中,我们发现DN-PPAR表达诱导健壮的磷酸化Rb即使在高水平的p21和p27和最终的结果支持细胞周期进程。数据从最近的研究表明,新兴CDKIs p21和p27也可以发挥积极作用在G1期事件。CDKIs都是细胞周期素D所需装配到和它的稳定性和核本地化(29日],p27与细胞周期蛋白D1和E水平显著相关表达式在某些乳腺癌细胞系(30.,31日]。我们还报道说,PPAR配体抑制Rb磷酸化和G1对大鼠主动脉VSMC[年代过渡6]。在这个研究中,我们发现,PDGF +胰岛素诱导VSMC p21表达和增强p27退化,而PPAR激活减弱mitogen-induced p21表达,可能导致G1逮捕PPAR VSMC的反应配体。因此,CDKIs的普遍观点普遍CDKs抑制剂可能描述太简单的图片他们的监管对细胞周期的影响29日]。

Ras / Raf MEK / ERK信号级联似乎是不可或缺的细胞增殖在各种不同的细胞类型3]。ERK调节细胞生长所需的生产材料,包括嘧啶和核糖体合成(3),瞬态的表达ERK1反义RNA或kinase-deficient ERK1突变已被证明会降低细胞生长(32]。在G1 ERK激活也起着关键的作用相变。形成的细胞周期蛋白D-CDK4/6复合物是一个关键的一步静止细胞进入细胞周期,和激活ERK通路增加周期蛋白D1的表达式,同时抑制ERK表达活动的主导MEK的否定形式已经被证明可以减少细胞周期素D表达(33]。我们以前报道,PPAR配体troglitazone抑制mitogen-induced MAPK信号下游VSMC ERK的磷酸化和激活,伴随着经济增长的抑制ERK MAPK-controlled表达MCM6 MCM7,这是DNA复制复杂的中心组件(7,34]。我们还发现,PPAR配体和ERK的抑制PD98059抑制mitogen-induced p27退化和细胞周期蛋白D1上调,导致延迟G1这些细胞[年代过渡6]。在目前的研究中,我们发现DN-PPAR表达式有说服力地激活Rb ERK磷酸化和细胞周期蛋白D1表达式,所有这一切被预处理与PD98059减毒。综上所述,这些数据强烈建议DN-PPAR调节CASMC扩散,至少在某种程度上,通过诱导ERK 1/2磷酸化激活细胞周期蛋白D1表达式,并且由此产生的细胞周期蛋白D1-CDK4/6复合物进而使磷酸化Rb促进G1年代的进展。

进一步的研究是必要的定义DN-PPAR的确切机制ERK MAPK活性增加。PPAR可能活跃的基础条件下,在没有药物配体的情况下,由于存在的内源性配体,如氧化脂肪酸,我们最近显示驻留在大型绑定PPAR的口袋吗和生物相关的方式来激活它(未公开的数据)。我们发现中等链C8-C10脂肪酸产生的细菌结晶核受体的克隆,和许多丰富的食物,可以稳定螺旋PPAR的12为一个活跃的构象,证明了它能够促进脂肪细胞的分化,一个著名的PPAR的函数。DN-PPAR表达式可能因此块基底CASMC PPAR活动,引起的内源性配体,这可能抑制ERK MAPK通路。格内尔et al。13)之前的双突变DN-PPAR展示了令人印象深刻的能力构建基础转录沉默活动,增加辅阻遏物协会。我们发现基底PPAR活动是大约30%的活动获得的药物配体(图1),类似于格内尔等人报道的25%。13]。因此,似乎这些细胞含有内源性PPAR的可能性配体,这可能在PPAR抑制细胞生长特殊的方式。这个建议是我们观察WT-PPAR超表达的支持在缺乏合成配体特异性抑制阳性细胞周期调控蛋白表达(图4),而DN-PPAR表达式不改变细胞周期调控PPAR的缺失(图6)。刺激的边后卫和DN-PPAR只是它们对p21和p27的影响不同,由前减少,增加了后者,但这些差异的原因和影响尚不清楚。令人惊讶的是,DN-PPAR刺激ERK1/2磷酸化在serum-starved CASMC相当于5%的边后卫和导致细胞周期调控的变化相似,这表明内生PPAR配体可能大幅增长的抑制效果。有趣的是,梅雷迪斯等人也观察到适度mitogen-independent ERK激活诱导serum-starved VSMCs来源于小鼠表达DN-PPAR(P465L),而从只老鼠表达野生型PPAR VSMCs(18]。更健壮的影响mitogen-independent ERK活化后我们观察adenoviral DN-PPAR超表达可能是由于更高水平的表达通过我们的体外方法可以实现的。梅瑞迪斯等人发现DN-PPAR表达VSMCs表现出增强的扩散和迁移,他们指出,这种影响可能是介导的,至少在某种程度上,通过Ets-1,我们以前是由ERK信号在VSMCs [35]。

VSMCs的过度增长会导致动脉粥样硬化的形成和restenotic病变。然而,DN-PPAR的刺激经济增长的能力在几个基因疗法可能是有益的设置,重新激活休眠细胞周期将是可取的。例如,成人胰岛细胞的增殖是有限的(36),并增加他们的增长能力可以有利于治疗I和II型糖尿病。心脏几乎没有,如果有的话,在损伤后再生潜力,因为成人心脏细胞终末分化细胞,不扩散。许多研究试图诱导cardiocmyocyte overexpressing增殖的细胞周期调控分子,促进细胞周期进程(37]。潜在的DN-PPAR或化合物,模仿它的影响,促进活化的细胞周期这些设置值得进一步探索。

缩写

PPAR:	过氧物酶体proliferator-activated受体γ
WT:	野生型
DN:	显性负
CA:	Constitutively-active
CASMCs:	冠状动脉平滑肌细胞
Rb:	视网膜母细胞瘤蛋白
MCM7:	Minichromosome维护蛋白7
兵:	细胞外signal-regulated激酶
VSMCs:	血管平滑肌细胞(VSMCs)
服用tzd:	Thiazolidinediones
小黑裙:	配体结合域
IMR:	内中膜比
PPRE:	PPAR响应元件
显示:	罗格列酮
CDKIs:	细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。

确认

作者非常感谢PPAR的礼物缺乏小鼠胚胎干细胞r·埃文斯博士(霍华德休斯医学Ins。Lo拉,CA)和CA-PPAR表达载体巴里·福尔曼博士(希望之城医疗中心,Duarte, CA)。HL07171支持的工作。