文摘
索拉非尼是一线治疗方案针对对先进或转移性肝细胞癌(HCC)阶段。然而,在这些阶段将最终失败索拉非尼治疗肝癌患者由于耐药性。目前,索拉非尼抗性分子机制并不完全清楚。我们过去的研究已经表明,DJ-1调节肝细胞癌,而DJ-1击倒抑制肝癌xenograft-induced肿瘤的生长和再生,这意味着DJ-1可能是肝癌治疗的潜在目标。然而,是否DJ-1扮演监管角色之间的肿瘤细胞和血管内皮细胞和DJ-1是否有助于索拉非尼阻力在肝癌细胞在很大程度上是不清楚。为了解决这些问题,我们进行了一系列的实验在最近的研究中,我们发现(1)DJ-1,从肝癌细胞分泌的一分子,促进血管生成和血管内皮细胞的迁移(即。ECDHCC-1),由纤维母细胞生长因子诱导磷酸化receptor-1 (FGFR-1) mTOR的磷酸化,磷酸化ERK的磷酸化STAT3的;FGFR1的差别(2)对这些抑制管的形成和迁移ECDHCC-1 DJ-1细胞刺激;(3)FGFR1击倒减毒FGFR1的磷酸化和受损的一种蛋白激酶的活性,兵,和STAT3信号引起DJ-1 ECDHCC-1细胞;(4)击倒FGFR1导致proapoptotic分子的表达升高但已故sorafenib-resistant肝癌细胞的凋亡分子水平;FGFR1的差别,(5)对这些sorafenib-resistant肝癌细胞的抑制肿瘤生长和血管生成在活的有机体内。总之,我们的研究结果暗示DJ-1扮演着重要的角色在肝癌的发展,肿瘤微环境和DJ-1 / FGFR1信号通路可能是克服耐索拉非尼治疗肝癌患者的治疗目标在后期阶段。
1。介绍
肝细胞癌(HCC)是主要的类型的肝癌。目前,部分肝切除术,肝移植提供最好的肝细胞癌患者肿瘤预后是<直径5厘米,局限于肝脏叶之一,没有入侵肝脏血管和肝脏功能是保存完好的1]。不幸的是,高术后肿瘤复发率显著降低长期生存。由于浸润性生长和晚期症状表现,大多数患者被诊断出晚期和不合格的外科手术2]。可用口服酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼,是一线药物对先进HCC自2008年以来,大大提高了整体不可切除的肝细胞癌患者的生存。然而,有前途的治疗已经证明临床疗效有限,通常只有延长病人的生存约3个月。有肝细胞癌患者的最初反应良好索拉非尼,但最终会失败由于癌症恶化,表明有一个获得抗病性索拉非尼在肝细胞癌(3]。到目前为止,负责这获得性耐药肝癌机制索拉非尼尚不清楚,我们提出一个可能的方式,是实现。
作为一种新颖的致癌基因,蛋白质deglycase DJ-1 20 kDa蛋白质是超过22人体组织中大量表达,包括肝脏和血管内皮(4]。DJ-1与多种生物功能有关,如转录调节,女伴活动规定,蛋白酶功能监管,和线粒体的监管5]。与此同时,据报道,DJ-1是肿瘤发生的监管机构之一,入侵,在各种癌症和转移,包括肝细胞癌(6]。我们过去的研究发现DJ-1调节肝细胞癌。DJ-1导致差别此外,对这些基因的扩散,降低HepG2细胞的粘附和入侵在体外,抑制HepG2-induced肿瘤的生长在活的有机体内的至关重要的作用,这意味着DJ-1瘤形成的肝细胞癌(7,8]。同时,DJ-1可以促进血管生成在骨生成和已被确认为成骨细胞和内皮细胞之间的沟通因素9]。正如众所周知,antiapoptosis的肿瘤细胞和血管内皮细胞的血管生成都参与索拉非尼阻力,抑制血管生成在肿瘤有望克服耐药肝癌。DJ-1是否起着至关重要的作用在HCC血管内皮细胞和血管生成作为相声监管角色在肝细胞癌肿瘤细胞和血管内皮细胞之间索拉非尼阻力很大程度上是不清楚。
纤维母细胞生长因子受体1 (FGFR1)酪氨酸激酶受体,是主要的类型的FGFR和促进内皮细胞血管生成中起着关键作用。FGF诱导FGFR1的磷酸化,激活下游信号分子,如Src激酶、粘着斑激酶(FAK)和细胞外signal-regulated激酶1/2 (ERK1/2),已与内皮细胞分化[10]。与此同时,索拉非尼抑制肿瘤血管生成和扩散通过抑制multikinases如丝氨酸/苏氨酸激酶家族(如Raf-1, PI3K / Akt, ERK1/2,和STAT3)和受体酪氨酸激酶家族(例如,FGFR、VEGFR和PDGFR) (3]。此外,索拉非尼的获得性耐药肝癌有关FGF / FGFR1的激活信号通路(11]。重要的是,据报道,DJ-1可以诱导FGFR1的磷酸化,激活FAK和ERK1/2信号通路,导致血管内皮细胞的迁移和毛细管形成的刺激(9]。因此,它是合理的怀疑DJ-1 / FGFR1信号通路可能导致HCC索拉非尼的阻力,和抑制DJ-1 / FGFR1通路将受益的一个子集索拉非尼耐药患者DJ-1的高表达。
这里,DJ-1目标是相声肝癌细胞和血管内皮细胞之间的监管机构,和DJ-1 proangiogenic效应/ FGFR1 ECDHCC细胞信号进行了研究。我们还探讨了底层机制阻力索拉非尼的反转效应在肝癌细胞表达下调FGFR1。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和建立在肝癌细胞株索拉非尼抵抗
人类肝癌细胞系(HepG2和HUH-7),内皮细胞来源于肝细胞癌(ECDHCC-1) THLE-2, L02细胞来源于健康的肝细胞都来自美国类型文化收集(写明ATCC;美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞培养在37°C公司为5%2在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) high-glucose胎儿血清中含有10%(美国Gibco-Life技术,卡尔斯巴德,CA)和1%的青霉素和链霉素。建立sorafenib-resistant肝癌细胞系,half-maximal抑制浓度(IC50肝癌细胞的索拉非尼最初由孵化细胞与不同浓度的索拉非尼在96 -孔板,和细胞生存能力测量3天后,如下所述。细胞培养在6-well板块 细胞/好,孵化与索拉非尼浓度略低于各自的IC50。索拉非尼的浓度在慢慢增加了0.25μ每周M。6到7个月后,sorafenib-resistant细胞系得到,不断维护在索拉非尼的存在。阻力指数(RI)和IC的比例计算50索拉非尼耐药细胞株IC50相应的控制细胞系。
2.2。ELISA试验的DJ-1
DJ-1水平的培养基进行酶联免疫吸附试验使用商用人类蛋白质DJ-1 (PARK7)酶联免疫试剂盒(# CSB-E12024h, CUSABIO、武汉、中国)根据生产的协议。
2.3。表达和纯化His-Tagged DJ-1蛋白质
进行表达和纯化的重组DJ-1使用pET28a向量根据供应商的协议(EMD微孔,达姆施塔特,德国)。DJ-1被克隆到pET28a向量和测序。DJ-1构造转化为大肠杆菌BL21 (DE3)表达His-tagged DJ-1(他的DJ-1),和重组蛋白纯化nickel-NTA琼脂糖列。最后,的浓度和纯度His-tagged DJ-1蛋白质测定使用布拉德福德化验(Bio-Rad)和生产验证了通过免疫印迹分析anti-His标记和anti-DJ-1特定的抗体,分别。
2.4。建设FGFR1 shRNA表达质粒
pLKO。1lentiviral plasmid was selected to construct the shFGFR vector. Empty vector was used as a control group. To generate lentiviruses, HEK 293T cells were cotransfected with pLKO-shFGFR1 plasmid, psPAX2 packaging plasmid, and pMD2.G envelop plasmid using Lipofectamine 3000 (Invitrogen). Transduction of pLKO-shFGFR1 lentivirus and stable FGFR1 knock down was conducted according to the manufacturer’s protocols. Short hairpin RNAs (shRNA) targeting FGFR1 (shFGFR1) were detailed as follows: FGFR1-Sh1: 5 - - - - - -CCA CAG AAT TGG gg CTA CAA-3 ,FGFR1-Sh2: 5 - - - - - -手枪GGC ACC注册会计师GGC ATT ATT-3 ,FGFR1-Sh3: 5 - - - - - -TGC CAC CTG呕吐猫猫AAT-3 。
2.5。细胞增殖测定CCK8
细胞增殖均通过一个比色测定,利用细胞计数kit-8(美国GLPBIO CCK-8)试剂后,制造商的协议。简单地说,ECDHCC细胞被播种到96孔板的密度 细胞/在一个中等大小的10%的边后卫和允许坚持24 h。接下来,细胞培养介质中1%的边后卫在显示介质的存在与否或试剂(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)进一步24 h和/或48 h。后来,10μL CCK-8试剂的添加和维护3 h。标仪(Multiskan MK3,热,沃尔瑟姆,MA)是用来测量的光学密度450 nm和630 nm。
2.6。管形成分析
基底膜基质(美国苗必达# K905-50, Biovision)溶解在4°C一夜之间,和48-well板块准备了100年μL基底膜基质在每个涂层和孵化后一夜之间在37°C。ECDHCC细胞( 细胞/镀好)和孵化6 h在37°C。ECDHCC细胞管形成评估显微照相机,分支管和管总长度计算使用图像J的血管生成插件软件(贝塞斯达国立卫生研究院,医学博士,美国)。
2.7。伤口愈合化验
迁移活动用伤口愈合分析测量。ECDHCC细胞被播种到6-well盘子。融合细胞密度达到80%后,伤口是由抓细胞单层200μL吸管小费。伤口愈合是监控,迁移距离成像在不同的时间点。实验重复一式三份。
2.8。流式细胞术对细胞凋亡
分析了细胞凋亡annexin-V /π。总之,细胞培养在6-well板的密度 细胞/好,孵化24小时指示试剂。细胞被离心使胰蛋白酶化和收获,与冷PBS洗,resuspended在200年μL绑定缓冲。然后,细胞被沾annexin-V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC, 0.5μ和π(50 g / mL)μ在黑暗中g / mL) 15分钟和分析使用流式细胞分析仪(美国新泽西州FACScan,正欲)。
2.9。Co-Immunoprecipitation (Co-IP)
细胞被洗两次冰冷的PBS、收获和细胞溶解里帕裂解缓冲(# P0013D, Beyotime、武汉、中国)的免疫沉淀反应实验。对于每一个样本,1.5毫克的蛋白质是孵化+ G琼脂糖快流(# P2028, Beyotime、武汉、中国)和anti-DJ-1兔子帕布(禅# 382793,1:1000年,武汉,中国)。在4°C一夜孵化后,珠子都洗,最后颗粒悬浮在里帕缓冲区。结合蛋白被加热和离心的筛选了珠子,然后分析了免疫印迹分析。
2.10。定量实时聚合酶链反应(存在)
用试剂盒总RNA提取试剂(豆类、日本)。使用1逆转录反应进行μg的总RNA,反转录成cDNA使用益生元(dT)引物。实时PCR进行了使用SYBR预混料Taq交货(豆类、日本)根据制造商的协议与ABI - 7500(美国ABI)。简单地说,2μ添加到每个20 L cDNA模板μ与sequence-specific L反应引物:FGFR1 F: 5 - - - - - -CGG广汽ATT CAC ATC GA-3 ,R: 5 - - - - - -在20 CCC AGA GTG TC-3 ATC亚美大陆煤层气有限公司 ;β肌动蛋白F: 5 - - - - - -TGA CGT GGA猫20 CAA AG-3 ,R: 5 - - - - - -玻纤棉酚GGT GGA CAG注册会计师GG-3 。β肌动蛋白是作为内生控制规范化表达数据。循环条件由最初的10分钟聚合酶激活在95°C,紧随其后的是40周期在95°C 15年代,60年代60°C, 72°C,持续15分钟。FGFR1转录水平量化使用2−ΔΔCT方法(12]。
2.11。免疫印迹分析
总蛋白从细胞中提取使用缓冲区里帕(中国C1053 PPLYGEN)补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒(瑞士罗氏公司)。西方墨点法进行了sds - page凝胶和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。与5%脱脂牛奶阻塞后,膜分别探讨了主要抗体。下面列出了我们的主要抗体:p-FGFR1-Tyr653/654鼠标马伯(CST # 3476, 1: 500年,美国),FGFR1鼠标马伯(# 60325 - 1 - ig, 1: 1000年,Proteintech,美国),p-Akt-S473兔子帕布(ABclonal # AP0140, 1: 1000年,中国),Akt兔子帕布(ABclonal # 11016, 1: 1000年,中国),p-mTOR-S2448兔子帕布(ABclonal # AP0094, 1: 1000年,中国),mTOR兔子帕布(# 20657 - 1 - ap, 1: 1000年,Proteintech,美国),p-ERK1/2 (ERK1-T202 / Y204 + ERK2-T185 / Y187)兔帕布(ABclonal # AP0472, 1: 1000年,中国),ERK1/2兔子帕布(# 16443 - 1 - ap, 1: 1000年,Proteintech,美国),p-STAT3——Tyr705兔子帕布(禅# 381552,1:1000年,中国),STAT3兔子帕布(ABclonal # A11216, 1: 1000年,中国),裂解半胱天冬酶3只兔子帕布(ABclonal # A2156, 1: 1000年,中国),裂解半胱天冬酶9兔子帕布(ABclonal # A2636, 1: 1000年,中国),伯灵顿兔帕布(# 50599 - 2搞笑,1:1000年,Proteintech,美国),bcl - 2只兔子帕布(# 12789 - 1 - ap, 1: 1000年,Proteintech,美国),和GAPDH兔子马伯(CST # 2118年代,1:1000年,美国)。在4°C孵化后一夜之间,膜清洗和孵化了适当的二次抗体(ABclonal 1: 3000年,中国)。感兴趣的蛋白质被SuperSignalTM发现西方Pico +化学发光底物(美国热)使用凝胶成像系统(通用电气生物科学,白金汉郡,英格兰)。
2.12。动物研究
裸体雄性老鼠(5-week-old)从北京购买重要河流实验动物科技有限公司有限公司。我们的动物实验进行批准的协议下IACUC华中科技大学。基本程序是前面描述的(13]。总之,我们选择HUH-7 / R细胞系作为我们的模型和设计的体内实验3组:(1)HUH-7 / R +控制;(2)HUH-7 / R +索拉非尼+ DJ-1;和(3)HUH-7 / R +索拉非尼+ DJ-1 + shFGFR1。细胞( 细胞/注射)皮下注入裸鼠。我们每周两至三次测量肿瘤生长在二维空间中使用数字卡尺和肿瘤体积计算使用1/2 ( )。的实验中,异种移植肿瘤被收获,和肿瘤重量,肿瘤发病率和图像记录。
2.13。鸡绒毛膜尿囊的膜(CAM)模型
基本步骤进行(如前所述)(14]。简而言之,我们使用的受精鸡蛋孵化在37°C,凸轮膜是得分~第十天的胚胎发育删除凸轮上皮的表层。 肝癌细胞(即。,HUH7 and HUH7/R) were mixed with ECDHCC-1细胞的比率1:1、治疗和分组如下:(1)混合细胞+控制;(2)混合细胞+ DJ-1;(3)混合细胞+索拉非尼;(4)混合细胞+索拉非尼+ DJ-1;(5)混合细胞+索拉非尼+ DJ-1 + shFGFR1。我们添加了最后操纵细胞到凸轮。鸡胚孵化,然后维持在37°C时实验。
2.14。统计分析
数据了 。使用学生的差异进行 - - - - - -测试两组或多个组单向方差分析与Bonferroni事后测试利用GraphPad 5.0软件(GraphPad棱镜、钙、美国)。在所有情况下, 被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。肝癌ECDHCC-1细胞的培养基可以促进血管生成和迁移
测试如何肝癌细胞与血管内皮细胞,我们首先收集HepG2的培养基,HUH-7,和THLE-2细胞,添加到ECDHCC-1细胞的培养基在不同的比率。CCK8化验表明,ECDHCC-1有更好的细胞生长行为当肝癌或THLE-2细胞培养基在10 - 60%的比例ECDHCC-1细胞培养基(图1(一)),没有观察到凋亡效应在每个培养基在40%和60%比例(图1 (b))。因此,条件培养基使用40%的比率管形成和伤口愈合实验。我们的结果表明,节点的数量和总管长度增加HepG2 HUH-7-treated集团(数据1 (c)- - - - - -1 (e)),迁移ECDHCC-1细胞HepG2的增加和HUH-7组12日24和36 h。也有少量增加趋势观察THLE-2小组24和36 h(数字1 (f)和1 (g))。这些结果表明,肝癌细胞的培养基分泌因素可能促进血管生成和血管内皮细胞的迁移。
(一)
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3.2。DJ-1 ECDHCC-1细胞能显著诱导血管生成和迁移
先前的研究已经报道,DJ-1是一种可溶性蛋白,可能扮演了一个重要的角色在神经元维护和氧化应激以及癌症恶化[15,16]。调查如果DJ-1分泌的因子在肝癌细胞培养基和功能来帮助内皮细胞的血管生成和迁移,DJ-1水平培养基被ELISA评估,结果表明DJ-1 HepG2分泌,HUH-7,和L02细胞平均为5.68,8.77,和2.62 pg / mL 24 h,分别和DJ-1水平平均增加到11.55,16.44,和4.53 pg / mL 48 h,分别(图2(一个))。随后,DJ-1基因克隆和表达为蛋白质分子量约为25 kDa。DJ-1当时净化浓度为0.758 mg / mL的纯度在85%以上,这是验证anti-His标记的免疫印迹和anti-DJ-1特定抗体(数字2 (b)- - - - - -2 (d))。然后,细胞的可行性ECDHCC-1被CCK8化验测定治疗后纯化DJ-1在5、10、15、20μg / mL,分别,没有发现显著差异之间的治疗和治疗组(数据没有显示)。因此,纯化DJ-1 15的浓度μg / mL被用于以下实验。有趣的是,管形成分析结果显示显著诱导血管生成是由节点和管总长度的增加(数据2 (e)- - - - - -2 (g)。与此同时,细胞迁移DJ-1治疗(数据后也显著增强2 (h)和2(我))。这些结果表明DJ-1可能作为proangiogenic因子和迁移主持人在体外。
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3.3。DJ-1参与效果的一种蛋白激酶的激活/ mTOR ERK1/2, STAT3信号通路,可能通过FGFR1介导
DJ-1诱发FGFR1信号,从而导致血管内皮细胞(9]。探索是否ECDHCC-1细胞的DJ-1对血管生成的影响在我们的研究中,由FGFR1 FGFR1的mRNA和蛋白水平检测到存在和免疫印迹,分别。我们的研究结果表明,FGFR1 mRNA水平没有显著差异之间的控制和DJ-1治疗组(图3(一个))。然而,有一个重要的蛋白表达upregulation p-FGFR1和总FGFR1 DJ-1治疗后(图3 (b))。随后,一个co-immunoprecipitation试验,但结果表明,没有DJ-1和FGFR1(图之间的直接交互3 (c))。此外,西方墨点法下游血管生成和迁移信号通路显示DJ-1 Akt激活/ mTOR ERK1/2, STAT3信号通路显著(图3 (d)- - - - - -3 (g))。这些结果暗示的影响DJ-1 ECDHCC-1参与激活的一种蛋白激酶/ mTOR ERK1/2, STAT3信号通路,这可能是介导的,至少部分,通过FGFR1。
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3.4。Downregulation FGFR1抑制DJ-1通过失活的影响的一种蛋白激酶/ mTOR ERK1/2, STAT3信号通路
此外,三个FGFR1 shRNA质粒名叫sh1 sh2,分别和sh3转染到ECDHCC-1细胞。存在和免疫印迹sh2 FGFR1的差别都验证有效的对这些基因的质粒(数字4(一)和4 (b))。下面的实验进行了使用sh2,这被称为shFGFR1。CCK8试验表明,细胞生存能力的差别之后减少对这些FGFR1(图4 (c))。增加的节点数量和总管长度,以及迁移能力观察DJ-1治疗后,都是FGFR1击倒(减毒的人物4 (d)- - - - - -4 (h))。有趣的是,尽管DJ-1诱导upregulation FGFR1、一种蛋白激酶的磷酸化/ mTOR ERK1/2, STAT3 FGFR1击倒(数据后也逆转了5(一个)- - - - - -5 (e))。这些结果表明,ECDHCC-1 DJ-1诱导血管生成和迁移,可能通过FGFR1介导。
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(一)
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3.5。Downregulation FGFR1可能影响的生存Sorafenib-Resistant肝癌细胞通过调节凋亡分子
细胞对索拉非尼(1、2、5、10、20、50、100和150μ米)CCK8试验测定,以及集成电路50被确定为2.5μM THLE-2细胞,4μHepG2的米,3.5μ分别为美元HUH-7(图6(一))。的sorafenib-resistant HUH-7细胞系(HUH-7 / R)构造(图6 (b)),国际扶轮是1.61。此外,耐药特征验证了增加P-gp和MRP1(图的表达式6 (c))。与HUH-7细胞相比,凋亡细胞减少HUH-7 / R组索拉非尼治疗后,以及接受索拉非尼和DJ-1状况。然而,HUH-7 / R细胞凋亡效应是增强后的差别瞬态对这些FGFR1与索拉非尼联合治疗后,DJ-1类似结果HUH-7细胞治疗后观察索拉非尼和DJ-1(数字6 (d)和6 (e))。这些结果的差别表明,对这些FGFR1可以逆转肝癌细胞在某种程度上抵抗索拉非尼。FGFR1的差别后,除了瞬态对这些基因与索拉非尼联合治疗和DJ-1 proapoptotic标记物的表达,即。裂解,裂解半胱天冬酶3日半胱天冬酶9日和伯灵顿,都是增加(数据6 (f)- - - - - -6(左))和凋亡标记的表达(bcl - 2)是减少(数据6 (f)- - - - - -6(左);补充图1)。这些结果暗示FGFR1可能影响生存sorafenib-resistant肝癌细胞通过调节凋亡分子。
(一)
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(左)
3.6。针对FGFR1会抑制肿瘤形成和血管生成的Sorafenib-Resistant肝癌细胞在活的有机体内
进一步确认是否FGFR1在索拉非尼阻力在肝癌细胞起着至关重要的作用,我们首先选择HUH-7 / R细胞系作为我们的模型和治疗HUH-7 / R细胞在不同的条件下,即、车辆控制,索拉非尼,索拉非尼+ DJ-1和索拉非尼+ DJ-1 FGFR1击倒,然后免疫缺陷小鼠皮下注入(即。裸小鼠)。在我们的初步研究,我们发现FGFR1击倒显示sorafenib-resistant细胞的抑制肿瘤生长的趋势在索拉非尼和DJ-1治疗的条件(数据7(一)- - - - - -7 (c))。在支持,我们应用鸡绒毛膜尿囊的膜(CAM)模型,已被广泛用作体内工具来研究肿瘤血管生成和转移(17,18]。在我们的研究中,我们使用HUH-7细胞和HUH-7 / R细胞,把它们分成5组:(一)细胞+控制治疗;(b)细胞+ DJ-1;(c)细胞+索拉非尼;(d)细胞+索拉非尼+ DJ-1;和(e)细胞+索拉非尼+ DJ-1 + shFGFR1。与对照组相比,我们发现(1)DJ-1过度导致总船长度和船舶密度的增加;(2)索拉非尼抑制血管生成HUH-7细胞通过缩短他们的船长度,而不是HUH-7 / R细胞;和(3)FGFR1击倒HUH-7 / R细胞显著抑制血管生成与索拉非尼治疗和DJ-1过度(数字7 (d)和7(e))。
(一)
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(c)
(d)
在这个实验中,我们在凸轮收获细胞从组织派生模型和检查FGFR1的表达式和凋亡分子(补充图2)。一致,我们发现FGFR1击倒可能增加proapoptotic分子的表达和抑制凋亡分子的表达(补充图2)。这些数据,总之,建议FGFR1击倒在肝癌能扭转索拉非尼抵抗在活的有机体内。
4所示。讨论
在目前的研究中,我们分离和纯化DJ-1由肝细胞分泌,发现DJ-1可能诱发磷酸化ECDHCC-1 FGFR1、促进血管生成和迁移的细胞。DJ-1 / FGFR1的下游机制涉及一种蛋白激酶的激活/ mTOR ERK1/2, STAT3信号通路。此外,击倒FGFR1抑制管形成和迁移DJ-1 ECDHCC-1细胞的刺激。它还显示一个重要proapoptotic效应与索拉非尼的不抵抗的肝癌细胞DJ-1在场的情况下,这可能意味着在肝癌细胞中索拉非尼耐药性的逆转。这些发现表明,细胞外DJ-1由肝细胞分泌可能是一个相声肿瘤细胞和血管内皮细胞之间的监管机构。DJ-1 / FGFR1的抑制信号可能是至关重要的逆转肝癌的抗索拉非尼,尤其是肿瘤DJ-1的高水平。
我们有报道称DJ-1表达显著调节肝细胞癌,与术前AFP水平相关,肝硬化,静脉入侵,分化和埃德蒙森等级的肝癌。此外,患肿瘤的生存时间和总生存时间在DJ-1高表达组比低表达组短。因此,DJ-1提出了作为一个独立的预后因素HCC患者的总生存期(7]。此外,我们证实稳定击倒DJ-1增殖,减少HepG2细胞的粘附和入侵在体外和抑制HepG2-induced肿瘤的生长在活的有机体内,这表明DJ-1在肝细胞癌的肿瘤形成的重要作用[8]。
切除或肝移植的治疗治疗通常是适用于患者的早期诊断。对于确诊的晚期肝癌病人,索拉非尼是系统性治疗的一线选择。然而,几乎所有的晚期肝癌病人在索拉非尼治疗最终失败由于索拉非尼电阻(19]。我们之前的研究表明DJ-1成分有效地逆转人类乳腺癌细胞的阿霉素耐药性与阿霉素的敏感性增加2.68倍(20.]。同时,FGFR,受体酪氨酸激酶,已被确定为一个关键血管发展的监管机构,以及激活FGF / FGFR信号被认为是获得性耐药的司机索拉非尼(11]。在目前的研究中,我们假设DJ-1作为相声肝癌细胞和血管内皮细胞之间的监管机构。有趣的是,我们发现DJ-1可以促进血管生成在HCC血管内皮细胞通过激活FGFR1在这项研究中,提出一个重要的角色DJ-1 / FGFR1信号发展的血管生成。
据报道,索拉非尼抑制肿瘤血管生成和扩散通过抑制信号由丝氨酸/苏氨酸激酶,如英国皇家空军/ MEK / ERK1/2级联,以及由受体酪氨酸激酶的信号,如FGFR、VEGFR和PDGFR。这些激酶参与细胞增殖、血管生成和细胞凋亡21]。详细的分析在体外实验报告,之间有很强的相关性的抑制Raf MEK / ERK1/2瀑布和索拉非尼的anticlonogenic效果。抑制VEGFR的账户,至少在某种程度上,索拉非尼的抗血管新生作用[22]。此外,FGFR1的过度表达,主要FGFR在内皮细胞,促进内皮细胞增殖(10]。此外,其他信号通路与肝细胞癌的发生和发展,如PI3K / Akt / mTOR, JAK / STAT和Wnt /β连环蛋白级联(23]。先前的研究结果表明DJ-1 FGFR1的磷酸化,激活FAK和ERK1/2信号通路的刺激导致血管内皮细胞的迁移和毛细血管的形成(9]。此外,我们以前确定的击倒DJ-1抑制人类HepG2细胞生长和xenograft-induced肿瘤生成可能通过一种蛋白激酶信号通路(8),在目前的研究中,我们发现DJ-1诱导激活下游Akt / mTOR ERK1/2,和STAT3 ECDHCC-1细胞通过至少部分FGFR1、暗示的重要作用DJ-1 / FGFR1在起始信号通路,进展,增殖,血管生成在HCC血管内皮。因此,DJ-1对抗索拉非尼的疗效和治疗可能导致耐药性。我们的结果与先前的研究中显示,过度的DJ-1可以增加肿瘤细胞的耐药性包括胰腺癌(24],nonsmall细胞性肺癌(NSCLC) [25),和白血病(26]。
索拉非尼的细胞毒性效应在抗肿瘤治疗中扮演着关键角色。一般来说,细胞凋亡是细胞毒性的主要形式,它是肿瘤回归和持续的临床缓解所需27- - - - - -29日]。索拉非尼会使凋亡分子(如bcl - 2)和增加proapoptotic分子的表达,如伯灵顿和p53-upregulated-modulator-of-apoptosis (PUMA) [29日]。相反,DJ-1的致癌效应主要归因于其凋亡能力。在目前的研究中,一个sorafenib-resistant肝癌细胞株HUH-7 / R成立。治疗DJ-1抑制索拉非尼的凋亡效应HUH-7和HUH-7 / R细胞。此外,击倒FGFR1可能导致proapoptotic影响HUH-7 / R细胞系索拉非尼治疗和DJ-1之后,与重要的upregulation裂解半胱天冬酶和伯灵顿,3/9的差别很明显对这些基因bcl - 2。重要的是,我们的飞行员异种移植实验表明趋势FGFR1击倒可以影响肿瘤生长sorafenib-resistant肝癌细胞的存在DJ-1治疗。此外,凸轮模型中我们的研究显示,DJ-1过度sorafenib-resistant HCC细胞促进血管生成,但这种表型FGFR1击倒(图可能发生逆转7)。总之,我们的结果表明,DJ-1 / FGFR-1信号通路导致索拉非尼阻力在肝癌,DJ-1 / FGFR1的差别,对这些信号可能是一个有前途的战略来提高索拉非尼的疗效,尤其在患者DJ-1的高表达。
然而,我们目前的研究有一定的局限性。例如,尽管我们的飞行员异种移植研究的趋势显示抑制通过FGFR1击倒sorafenib-resistant肝癌细胞的致瘤性,一大群老鼠异种移植研究可能需要验证这个表型。同时,我们建议DJ-1可能是其中的一个因素从培养基的肝癌细胞分泌,这可能会影响内皮细胞的生物学特性。未来的工作包括大规模筛选是揭示小说不可或缺的分子,可能是负责索拉非尼的阻力。此外,转基因模型需要专门DJ-1,使用DJ-1条件基因敲除小鼠模型(30.通过保鲜储藏格]或建立DJ-1-deleted sorafenib-resistant肝癌细胞,提供直接证据DJ-1至关重要在HCC和DJ-1 / FGFR1索拉非尼电阻信号是一个有效的目标。此外,索拉非尼的详细机制抵抗通过DJ-1 / FGFR1信号应当发现未来的方向。
5。结论
总之,目前的研究暗示,肝癌细胞可能与血管内皮细胞通过DJ-1交互。此外,可以影响血管生成和肿瘤生长的差别FGFG1对这些sorafenib-resistant DJ-1的肝癌细胞的条件。总之,我们的数据提供了证据表明DJ-1和FGFR-1信号可能是一个潜在的目标治疗患者索拉非尼的阻力。
数据可用性
最初的贡献在研究中都包含在本文展示材料。进一步询问可以针对相应的作者。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
作者的贡献
郭主任参与执行实验和写的手稿。鑫陈和杨国华设计研究,有助于解释数据,修订后的手稿。京张魏太阳,Dongbo刘和回族小王进行了实验和辅助分析。Shunfang刘指导研究。所有作者都阅读和批准最终的手稿。鑫陈和杨国华贡献同样这项工作。
确认
本研究得到了国家自然科学基金(81602626,81602626,81602592),中央大学的基础研究基金(2016 yxms111),和陈开创基金会的发展湖北省科技(cxpjjh12000001 - 2020308)。
补充材料
图1 FGFR1击倒增加proapoptotic标记的表达但损害凋亡标记物的表达体外。免疫印迹分析p-FGFR1 / FGFR1、裂解半胱天冬酶3,裂解半胱天冬酶9,伯灵顿,bcl - 2进行HUH-7 / R细胞治疗后DJ-1 FGFR1在索拉非尼的存在。Downregulation proapoptotic FGFR1导致高水平的分子,包括半胱天冬酶3、裂解半胱天冬酶9日和伯灵顿,但抑制凋亡分子水平,如bcl - 2。补充图2:推倒FGFR1 proapoptotic标记的表达增加,但影响凸轮模型中的凋亡标记的表达。在凸轮模型,组织收获结束时从每组实验,然后检查的表达p-FGFR1 / FGFR1、裂解半胱天冬酶3,裂解半胱天冬酶9,伯灵顿,bcl - 2通过免疫印迹分析。一致,FGFR1击倒可以诱导proapoptotic分子的表达(半胱天冬酶3,裂解半胱天冬酶9日和伯灵顿),减少凋亡分子水平(bcl - 2)。(补充材料)