褪黑激素改善Corticosterone-Mediated氧化应激在睡眠小鼠结肠炎涉及肠道微生物群

文摘

背景。炎症性肠病(IBD)是一个复杂的相互作用的结果,使开发特定治疗的一个具有挑战性的任务。皮质甾酮被认为是一个风险因素的压力相对肠炎。我们先前的研究发现,褪黑激素对睡眠不足的改善效果(SD)诱导皮质甾酮生产过剩和结肠炎。本研究进一步探讨了机制褪黑激素预防corticosterone-mediated SD-induced结肠炎。方法。72小时SD鼠模型有或没有补充褪黑激素和粪便微生物群移植(FMT)调查皮质甾酮在melatonin-mediated肠道微生物群的核心作用改善SD-induced结肠炎。此外,corticosterone-treated老鼠评估corticosterone-mediated的肠道微生物群作用的影响褪黑素dysbiosis-induced结肠炎。与此同时,一个体外测试研究代谢物褪黑激素的调节机制。结果。SD造成过度皮质甾酮,肠道微生物群的障碍和结肠炎表型。同样,corticosterone-supplemented老鼠也表现出了肠道微生物群失调和结肠炎和FMT SD-mice正常小鼠可以恢复SD-like结肠炎,但没有改变皮质甾酮水平,这表明corticosterone-mediated肠道菌群失衡在SD-induced结肠炎中起着核心作用。此外,我们演示了melatonin-mediated是削弱了GR反馈,抑制氧化应激,恢复肠道菌群及其代谢物体内平衡,灭活STAT3 / AP-1 / NF -κB pathway-induced炎症反应体内和体外。结论。我们显示,过多的肾上腺酮是一个核心的风险因素SD-induced结肠炎和提供了一个更好的理解的影响褪黑素,将个性化的靶向治疗药物,在corticosterone-mediated肠道微生物群的诱导结肠炎。

1。介绍

现代生活方式,包括长时间工作和上下班时间,心理压力,个人的选择,和社会和家庭需求,导致增加睡眠时间较短(1]。急性期睡眠剥夺(SD)可以导致肠道屏障功能障碍,包括肠粘膜损伤,肠道菌群紊乱在啮齿动物2],它可以是一个常见的炎症性肠病(IBD)的危险因素(3,4]。炎症性肠病发病机制与生活在肠道共生微生物的存在(5,6]。研究还表明,IBD-associated遗传缺陷可能导致pathobiont积累和渗透到肠组织,进一步促进生态失调和炎症(6]。肠道健康睡眠的过程中发挥着不可或缺的作用,也被证明能显著影响肠道微生物组和代谢2,7]。然而,是否SD-mediated肠道菌群紊乱引起的肠粘膜损伤,最终导致炎症性肠病的发生还有待调查。

先前的研究表明,SD,这可能是一个压力源,可以激活-肾上腺轴(HPA)在大鼠(8),引发的合成和生产皮质酮(CORT)以动态的方式9]。最近的研究表明,CORT可能引起肠道微生物的不平衡(10,11肠道微生物群的差别),包括对这些丰富和相对丰富的拟杆菌门和厚壁菌门和Proteobacterium的增加。考虑到肠道微生物群构成了肠道屏障,促进肠道微生物群的持续存在,刺激肠道上皮细胞再生,产生粘液,滋养粘膜(12),我们评估的影响SD-induced IBD相关的增加CORT production-mediated肠道菌群失调。

褪黑素(MT)是一种循环激素主要由松果体产生色氨酸。这种激素已经收到了广泛关注,因为它作为一个自我平衡的调节器HPA轴的13),这是与整体CORT分泌的减少和增加敏感度CORT的反馈。此外,作为一个具有很多功能的分子,作为主要的信号调节微生物的新陈代谢,昼夜节律,肠道粘膜免疫细胞,太有潜力用于治疗肠道疾病(14]。然而,是否太形状肠道生物功能通过CORT-mediated肠道微生物群还有待调查。

因此,在当前的研究中,我们(1)使用老鼠粪便微生物群移植(FMT)实验研究肠道菌群disorder-induced SD-mediated结肠炎和调查太政府是否可以改善SD-induced结肠炎通过恢复肠道微生物群内稳态;(2)进一步验证的核心角色过度CORT-mediated肠道菌群失衡SD-induced结肠炎和验证太政府是否会抑制这一过程;和(3)探索的信号通路太改善肠道菌群紊乱和肠道粘膜损伤CORT-mediated使用体内和体外。

2。材料和方法

所有实验根据指南的护理和使用实验动物动物福利委员会发表的农业研究机构,中国农业大学(批准号CAU20170911-2)。

2.1。动物和治疗

防晒指数132雄性ICR小鼠(8周大;重要河流实验动物技术有限公司、北京、中国)被安置在22个笼子在常规条件下(6 /老鼠笼)。适应一周后,小鼠随机分为11个组:睡眠剥夺(SD), SD +太补充(SD + MT),只有太补充(MT), non-sleep-deprived控制(CON)组、粪便微生物群移植(FMT)诈骗集团的老鼠(F-CON),小鼠的FMT SD集团(F-SD),小鼠的FMT SD +太集团(F-SM), FMT老鼠的车辆(F-R),皮质酮(CORT)补充,CORT +补充太CORT + (MT)和non-CORT-treated汽车集团(CON)。具体操作中提供补充材料。

2.2。粪便材料制备和FMT政权

粪便收集的材料来自老鼠的案子,SD和SD + MT组SD实验并放在埃普多夫管包含冻结方案(无菌生理盐水和12.5%甘油)和均质(15]。更多细节,请参见补充材料。

2.3。细胞培养和治疗

老鼠主要结肠肠上皮细胞(美国iec balb - 5047)在96 -孔板培养( 细胞/毫升)和12-well板块( 细胞/毫升)。一些CORT-treated iec (10μM, Solarbio有限公司,北京,中国;与100年CORT-cells)治疗μM NAC(自由基清除剂;美国新泽西州多国评价;CORT + NAC-cells) 2μM MT(美国圣路易斯Sigma-Aldrich;CORT + MT-cells)或20μru - 486(选择性GR拮抗剂;美国新泽西州多国评价;CORT + ru - 486细胞)。太补充30分钟后,一些CORT + MT-cells顺序处理10毫米4 p-pdot(非选择性是对手;美国新泽西州多国评价;CORT + MT + 4 p-pdot-cells)。每个板治疗细胞培养24小时。

96孔板的细胞增殖活动的评估使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)(光密度是决定使用一个微型板块读者(Bio-Rad模型680年,圣路易斯,密苏里州,美国)配备了570 nm波长过滤器)和活性氧(ROS) (Nanjingjianchen,北京)化验。ROS分析工具从Sigma-Aldrich购买和使用根据制造商的指令( )。细胞内ROS生成使用流式细胞分析仪测定与oxidation-sensitive DCFH-DA荧光探针。暂停使用DCFH-DA加载解决方案在最后50米的浓度和孵化为30分钟37°C。然后,样本在1000转离心5分钟(4°C)和细胞resuspended磷酸盐(PBS, pH值7.2 - -7.4)。对于每一个治疗,19105个细胞数,实验进行了一式三份。荧光检测使用荧光标(励磁488 nm和排放525海里)16]。细胞免疫印迹12-well盘子收集的。每个试验使用了重复8井。

2.4。酶联免疫吸附试验(ELISA)

血浆CORT的采集样本进行检测;结肠采集样本进行检测炎症因子(TNF -α、il - 10和IL-17)浓度使用竞争性ELISA测定(USCN生命科学公司,武汉,中国)。所有的测试根据制造商的说明进行。每组八个样本中使用。每个测试样本一式三份。的数据表示为ng / mL血浆CORT水平和TNF - pg /毫克的蛋白质α、il - 10和IL-17结肠组织的水平。

2.5。肠道通透性,异硫氰酸荧光素(FITC) -葡聚糖

6点在实验结束前,所有的老鼠都剥夺食物2 h和口头填喂法0.6毫克/克体重4 kDa FITC-dextran 80毫克/毫升的浓度前1 h安乐死。血清的FITC荧光测量使用荧光分光光度计波长为485 nm(激励)和535海里(排放)17]。标准曲线是由稀释FITC-dextran PBS。血清的浓度FITC-dextran是使用标准曲线计算。

2.6。免疫组织化学染色

我们使用免疫组织化学染色,MUC2 ZO-1, Claudin-1石蜡肠道部分。一夜之间,部分被孵化在4°C单克隆兔子anti-mouse主要抗体(MUC2, 1: 500;ZO-1, 1: 200;Claudin-1, 1: 200;Abcam、剑桥、马、美国)。具体操作中提供补充材料。

2.7。西方墨点法

部分结肠段和IEC样本( )在液氮快速均质和存储在-80°C蛋白免疫印迹分析。更多细节,请参见补充材料。

2.8。结肠RNA和粪便DNA分离和定量rt - pcr分析

结肠RNA分离使用RNeasy迷你包(试剂盒,日耳曼敦,医学博士,美国制造商的指示。RNA的数量和完整性进行评估与Nanodrop spectrophotometrically装置(热费希尔科学)。粪便DNA分离使用微生物群落DNA提取工具包(美国12988 - 10该款)后,制造商的指示。特定DNA序列是放大与Bio-Rad只连接实时PCR设备(美国大力神,CA)。使用的引物如表所示1。

2.9。微生物测序

16 s rRNA基因是放大使用特定细菌引物PCR和复合如前所述[2]。更多细节,请参见补充材料。

2.10。代谢组学分析

我们执行质分析quadrupole-time-of-flight (Q-TOF) 6510质谱仪(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)在电喷雾电离源(18]。更多细节,请参见补充材料。

2.11。统计分析的数据

数据表示为 和使用SPSS 10.0统计分析软件(IL SPSS, Inc .,芝加哥,美国)。组之间的差异进行统计分析使用方差分析其次是双向方差分析,这是用来确定的意义差异组( 和 )。

3所示。结果

3.1。太补充在SD效应增强CORT结肠分泌和肠道菌群失调

澄清是否太改善SD-induced CORT生产过剩和肠道失调,我们建立了一个急性连续72 h SD小鼠模型。结果表明活性氧含量显著增加(47.6%, ;图S1A),GR蛋白质的表达水平(52.6%, ;图印地),一半mRNA (50.9%, ;图就是S1C),以及HSP70(下降38.1%, ;图S1D)和P23 mRNA (25.6%, ;图S1E在SD组的价格相比CON组。然而,太预处理有效地逆转这些SD-induced变化。接下来,分析肠道菌群组成(图S1F-I),结果显示相对丰富的upregulation厚壁菌门(51.9%, ,图S1G)和Proteobacterium (67.3%, ,图S1H)的差别,对这些基因的拟杆菌门(15.7%, ,图S1F)和Prevotellaceae (30.1%, ,图S1I在SD组的价格相比对照组。相比之下,太预处理的SD减弱这些影响肠道菌群失调。因此,太预处理减毒过度CORT和SD小鼠肠道菌群失衡。

3.2。FMT促进重建结肠炎小鼠的表型和微生物群障碍

我们探索FMT是否从SD诱发小鼠结肠炎接收小鼠的表型。目前的结果表明,有一个显著的减少MUC2的表达水平,TJ (ZO-1和Claudin-1)和Card9蛋白质43.2% ( ,数据S2A和D),63.9% ( ,数据开通和E),35.6% ( ,数据S2C和F)和29.8% ( ,图S2I),以及戴得分显著增加,肠道通透性,结肠IL-17水平36.1% ( ,图S2G),42.6% ( ,图S2H)和78.3% ( ,图S2JF-SD组)的价格相比F-CON组。然而,刺激F-SD对结肠炎的变化的影响在结肠扭转F-SM补充。

进一步,我们研究是否F-SD肠道菌群紊乱引起的。厚壁菌门的相对丰度和Proteobacterium显著升高36.3% ( ,图S2L)和57.7% ( ,图S2NF-SD组),分别与F-CON组。相比之下,拟杆菌门和Prevotellaceae内容明显减少了32.5% ( ,图S2K)和46.3% ( ,图S2M)的结肠F-SD组和对照组。然而,F-SM和F-R团体,所有指数恢复F-CON集团的水平,导致F-SM之间没有明显的统计学差异,F-R和F-CON组( )。

总之,肠道菌群失调引起结肠炎SD-mediated,太补充改善结肠炎通过恢复肠道菌群失调。

3.3。效果太补充CORT治疗损害肠道粘膜屏障,结肠的线粒体功能和抗氧化能力

进一步,我们观察了血浆CORT水平显著增加了74.3% ( ,图1(一))CORT组相比CON组。符合CORT的增加,增加临床评分(202.9%, ,数据1(一)和1 (e)),戴得分(69.9%, ,图1 (f)),肠道通透性(67.8%, ,图1 (g)),减少结肠长度(21.2%, ,数据1 (b)和1 (c))和MUC2的水平(27.8%, ,图1 (h)),ZO-1 (39.4%, ,图1(我))和Claudin-1 (47.7%, ,图1 (j)蛋白质在CORT-treated老鼠。此外,CORT导致细胞色素C的表达水平增加(160.3%, ,图1 (k))和Caspase-9 (51.9%, ,图1(左))蛋白质和减少进行Mfn2 VDAC1, Calpain-1蛋白质30.1% ( ,图1(米)),15.7% ( ,图1 (n))和(213%, ,图1 (o)),分别与诈骗集团。与此同时,有一个猫(46.7%,下降 ,图1 (p)氧化酶(15.7%), ,图1(问))、SOD (33.9%, ,图1(右))和T-AOC水平(44.5%, ,图1(年代))和MDA水平的增加(29.7%, ,图1 (t)CORT老鼠)相对于诈骗集团。相比之下,太补充减毒CORT的结肠功能紊乱的影响。戴血浆CORT水平,临床评分,得分,肠道渗透性,和表达水平的细胞色素C, Caspase-9, Calpain-1蛋白质和MDA是下降了23.1 - -63.6% ( - - - - - -0.042),结肠的长度,TJ (ZO-1和Claudin-1)的表达水平,进行Mfn2 VDAC1, MUC2蛋白和抗氧化酶是增加了37.2 - -195.8% ( - - - - - -0.012)CORT + MT组相比CORT组。总的来说,我们的数据表明,太补充救了肠粘膜屏障损伤,线粒体功能,抗氧化能力由CORT治疗引起的。

3.4。太补充CORT治疗效果提高GR合成和运输和触发器在结肠炎症反应

然后我们检查是否CORT增强GR合成和运输和诱导炎症反应在冒号(图2)。免疫印迹结果表明GR一半寿命蛋白质和mRNA的表达显著增加了32.2% ( ,图2(一个))和87.8% ( ,图2 (b)),而HSP70和P23 mRNA水平下降了34.1% ( ,图2 (c))和38.4% ( ,图2 (d))CORT组相对于CON组。然而,显然太补充恢复有变化,导致CON组之间没有显著差异,MT-pretreated CORT集团( )。

接下来,我们评估是否CORT治疗导致炎症反应。结果表明CORT引起结肠炎症分子的含量的增加,如进气阀打开,cox - 2和TNF -α的45.0% ( ,图2 (e)),52.3% ( ,图2 (f))和123.2% ( ,图2 (g))和il - 10的减少60.4% ( ,图2 (h)与诈骗集团相比)。然而,CORT的刺激效应在结肠炎症反应是逆转太补充( )。

类似于对炎症反应的影响,CORT激活STAT3 / AP-1 / NF -κB在结肠途径。p-STAT3的表达水平,AP-1 p-P65和导出κB蛋白CORT-treated老鼠增加了39.2% ( ,图2(我)),52.7% ( ,图2 (j)),66.8% ( ,图2 (k))和101.3% ( ,图2(左)相对于CON组),分别。太补充后,然而,之间没有统计上的显著差异CON组和MT-pretreated CORT集团( )。

总的来说,这些结果表明,太补充逆转CORT-induced结肠GR合成和运输和抑制STAT3 / sp 1 / NF -κB通路activation-mediated炎症反应。

3.5。效果太补充CORT治疗结肠癌的改变肠道微生物群组成

我们进一步调查是否补充CORT和太可能影响肠道微生物群的构成。定量的角度分析表明,ACE曹国伟,香农指数显著增加51.5% ( ,图3(一个)),69.9% ( ,图3 (b))和17.5% ( ,图3 (c)),分别,而辛普森指数显著下降了37.5% ( ,图3 (d))。的β多样性分析表明CORT显著增加小鼠的肠道菌群色散相对的诈骗集团(数字3 (e)和3 (f))。此外,有一个增加OTU数字(26.9%, ,图3 (g))和的比值厚壁菌门:拟杆菌门(F: B, 31.2%, ,图3 (h))CORT组相比CON组。也有统计上显著的增加壁厚菌门的相对丰度(35.2%)和变形菌门(41.2%)和减少大量的拟杆菌(43.9%)CORT的老鼠相对于控制老鼠(数字3(我)和3 (j))。CORT老鼠太,然而,补充后的趋势指标恢复到诈骗集团(数据的水平3 (k)),之间没有统计上的显著差异CON组和MT-supplemented集团( )。这些结果表明CORT调节的多样性、丰富性,OTU结肠微生物群的数量以及F: B比率,这种微生物成分被太补充显著改变。

小鼠结肠微生物群的进化分枝图代表结构进一步显示主要的细菌和最大的类群的差异(图3治疗组4(一))。结果表明,主要的细菌CORT老鼠的冒号芽孢杆菌,普氏菌,Alloprevotella,假单胞菌科,Escherichia-Shigella,Muribaculaceae冒号的,而主要的细菌CORT +太老鼠Akkermansia,细菌性的,乳酸菌,这是有益的细菌。此外,属分析表明CORT水平显著下降的相对丰度乳酸菌,拟杆菌和Akkermansiaceae和增加的相对丰度煤炭地下气化技术prevotellaceae -技术- 001,Alistipes,Escherichia-Shigella,Rikenellaceae和Proteobacteriaceae,而补充太恢复这些细菌的丰度的CON组(图4 (b))。图4 (c)显示的相对丰度假单胞菌科,Moraxellaceae,芽胞杆菌科,Aeromonadaceae,Aerococcaceae,Peptococcaceae,Muribaculaceae冒号的CORT组明显增加了23.7% ( ),42.8% ( ),29.4% ( ),63.1% ( ),54.3% ( ),54.1% ( ),和48.1% ( ),分别相对于诈骗集团的水平拟杆菌和乳酸菌明显减少了53.1% ( )和45.8% ( ),分别相对于诈骗集团。然而,这些变化被太补充逆转,也没有显著差异的案子,CORT、CORT + MT组( )。这些结果表明太补充抑制CORT-induced肠道菌群的组成的变化。

此外,皮尔森相关分析的相对丰度之间呈负相关Akkermansia,乳酸菌,拟杆菌和血浆CORT水平( 和 ,图4 (d); 和 ,图4 (e);和 和 ,图4 ),以及的相对丰度之间的正相关关系普氏菌,Allobaculum,Muribaculaceae,Proteobacteriaceae和Rikenellaceae和血浆CORT水平( 和 ,图3 (g); 和 ,图4 (h); 和 ,图4(我); 和 ,图4 (j);和 和 ,图4 (k))。一般来说,太显著增加补充益生菌,CORT水平呈负相关,抑制致病菌,CORT水平呈正相关。

3.6。效果太补充CORT治疗改变肠道微生物群的构成在结肠代谢物

我们进一步分析了肠道微生物群的构成代谢物如何回应CORT治疗和太补充。CORT治疗我们的研究结果表明,导致显著增加结肠微生物群代谢物分散,这提出了一个减少微生物群代谢物同质性(数据5(一个)和5 (b))。维恩图解表明,与CON组相比,412年的水平代谢物改变CORT组,而太补充恢复这些代谢物(图298年的水平5 (c))。此外,我们筛选了60代谢物变化最大的三个治疗组(图5 (d))。其中,22个代谢物的含量显著降低,38的代谢物增加CORT组相对于诈骗集团。具体来说,丁酸含量有明显降低(68.9%, ,图5 (e))、左旋色氨酸(58.4%, ,图5 (f))和果糖(48.3%, ,图5 (g))以及显著增加的内容1-naphthol (94.5%, ,图5 (h)),次黄嘌呤(89.3%, ,图5(我))和腺嘌呤(100.2%, ,图5 (j))CORT组相比CON组。然而,太补充恢复这些水平的诈骗集团( )。总的来说,这些结果表明,太补充逆转CORT-induced结肠微生物代谢物的变化。

3.7。效果太补充CORT治疗改变肠道微生物群之间的相关性和结肠微生物群代谢物

我们进一步分析了肠道微生物群之间的相关性及其代谢物的案子,CORT、CORT + MT组。如图6(一),最显著的改变与肠道菌群及其代谢物相关涉及12个代谢物和83年肠道微生物群。丁酸盐的水平、左旋色氨酸和果糖被发现是直接与水平成正比Butyricicoccus,Akkermansia,乳酸菌但成反比的水平Alistipes,消化链球菌属,Rikenellaceae。腺嘌呤的含量、次黄嘌呤和1-naphthol直接成比例的水平Alistipes,消化链球菌属,Rikenellaceae和的水平成反比Butyricicoccus,Akkermansia,乳酸菌。此外,KEGG CORT治疗分析表明主要提高了类固醇激素生物合成,鞘脂类代谢,和双组分系统信号通路和抑制缝隙连接,细菌侵入上皮细胞,蛋白质的消化和吸收,碳水化合物的消化,吸收和胃酸分泌通路(图6 (b))。然而,这些变化被太补充逆转。可以推测的是CORT治疗导致代谢物成分的变化,特别是减少丁酸盐的水平和左旋色氨酸,反过来影响这些途径和功能,最终导致肠道屏障功能受损。

3.8。FMT促进小鼠肠道炎症反应的重建

如图S3A和3B没有显著差异的血浆CORT和结肠F-CON ROS水平,F-SD, F-SM, F-R组。此外,p-STAT3的表达水平,p-AP-1》κB, p-P65蛋白质增加了64.3% ( ,图S3C),63.9% ( ,图S3D),61.9% ( ,图S3E)和72.0% ( ,图S3FF-SD组),与之相比,F-CON组。然而,刺激F-SD对结肠炎的变化的影响在结肠扭转F-SM补充。

总的来说,这些结果表明,FMT的SD鼠提升重建肠道微生态学激活炎症反应,而太补充抑制这一过程。

3.9。效果太补充CORT治疗引发氧化应激增强GR在iec合成和运输

我们建立了一个CORT-treated iec有或没有太管理局(数据模型7和8)调查机制,太补充逆转CORT-induced肠道内稳态失衡。CORT治疗诱导活性氧的水平增加(52.7%, ;图7 (b)),GR蛋白质(168.1%, ;图7 (c))和一半mRNA (178.8%, ;图7 (e))和增殖能力下降(50.3%, ;图7(一))和HSP70的水平(53.4%, ;图7 (d))和P23 mRNA (43.2%, ;图7 (f))与控制委员会。然而,这些变化极大地抑制了MT补充。的改善效果太被预处理ru - 486复制,GR拮抗剂。自由基清除剂预处理与南汽,同样模仿太的影响,增加增殖能力(100.6%, )和减少活性氧的水平(34.5%, )在CORT + NAC-treated iec CORT组相对于;然而,没有观察到变化在GR蛋白质和HSP70的表达水平,以及P23 mRNA ( )NAC治疗后。相反,4 p-pdot管理显著抑制MT的有利影响,导致活性氧的增加(54.0%, ),GR蛋白质(67.8%, ),和一半mRNA (61.2%, )水平和增殖能力下降(74.5%, )和HSP70 (38.4%, )和P23 (79.0%, )信使rna水平与车辆iec相比。我们的研究结果显示,MT-mediated是受体CORT-induced改善氧化应激通过抑制肠道内GR合成和运输。

3.10。效果太补充CORT治疗诱发STAT3的激活/ AP-1 / NF -κB通过抑制氧化应激通路

此外,我们观察到p-STAT3的表达水平增加97.7%, ;图8(一个)),AP-1 (93.0%, ;图8 (b)),p-P65 (96.1%, ;图8 (c)导出),电κB (109.1%, ;图8 (d)),伊诺(113.9%, ;图8 (g))和cox - 2 (69.2%, ;图8 (h))和表达水平的降低是(61.4%, ;图8 (f))CORT-treated iec与车辆组相比,虽然CORT治疗没有效果的表达MT1蛋白质(图8 (e))。然而,太预处理可以抑制这一过程。治疗后与ru - 486 (GR拮抗剂),太有类似的效果,我们观察到的表达减少p-STAT3 (62.7%, ),AP-1 (43.7%, ),p-P65 (38.4%, ),》κB (51.1%, ),伊诺(55.0%, ),和cox - 2 (42.8%, )在CORT + ru - 486治疗iec与CORT-treated组相比,虽然俄罗斯对MT1 - 486没有影响,是表达。此外,NAC治疗,抑制氧化应激,也恢复了CORT引起的变化。预处理4 p-pdot逆转太的治疗效果,未能改善CORT引起的变化。p-STAT3的表达(47.0%), ),AP-1 (50.9%, ),p-P65 (43.3%, ),》κB (56.3%, ),伊诺(55.3%, )和cox - 2 (41.7%, )增加在CORT + MT + 4 p-pdot-treated iec CORT +相对于MT-treated iec,表明MT-mediated是改善CORT-induced炎症反应,导致STAT3 AP-1 / NF -κB途径激活。

4所示。讨论

我们之前的研究已经证明,SD,生理的压力源,诱导过度CORT、肠道微生物群的干扰,结肠炎表型(2]。此外,目前的研究表明小鼠,接受粪便微生物群从SD小鼠结肠炎表型也遭受重创,肠道菌群紊乱,但没有观察到血浆CORT的变化。然而,补充褪黑激素逆转所有诱变SD-mice和移植粪便微生物群从SD +太小鼠显著恢复SD-induced结肠炎和肠道菌群失衡。这些结果强调了生产过剩的核心作用在SD-induced CORT肠道微生物群失调和显示MT-mediated肠道微生物群在SD-induced结肠炎小鼠体内平衡产生了改进效果。

验证关键作用引起的过度CORT SD肠道微生物群的障碍,我们建立了一个CORT-treated老鼠。结果表明,CORT诱导治疗结肠炎表型。同时,微生物成分分析在目前的研究显示有一个增加的多样性和丰富性,分散,OTU数字,B和F:比CORT-treated老鼠。最近的研究也表明,gc可能导致肠道微生物障碍(11)和增加F: B比率,这被认为是主要的一项关键指标肠道微生物群的变化。人们普遍认为,GCs增加病原菌扩散的风险(19]。我们的研究还显示更高的大量的有害细菌(普氏菌和Allobaculum)和有益的细菌丰度较低(Akkermansia,拟杆菌,消化链球菌属和乳酸菌)在小鼠暴露于CORT的冒号。拟杆菌和乳酸菌分别负责异化丁酸和左旋色氨酸(20.]。与微生物结果一致,我们的代谢组学分析进一步表明,丁酸盐的相对丰度和色氨酸CORT老鼠明显减少。肠道微生物群及其代谢物的主要介质肠屏障功能和肠道通透性,能够干扰,提高肠道屏障完整性通过调节免疫反应,氧化应激,炎症,迷走神经信号,和养分有效性21]。进一步,p-STAT3的表达水平,增加AP-1, p-P65和导出κB蛋白和促炎因子(cox - 2,伊诺和TNF -αCORT老鼠。)研究表明丁酸促进促炎细胞因子的生产(如il - 6,引发,il - 1β和肿瘤坏死因子-α)提高NF -κB在上皮细胞激活22]。此外,在小鼠和小猪,色氨酸补充剂降低DSS-induced结肠炎的症状,组织学和肠道通透性,改善和减少局部炎症介质的水平,如干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α(23]。因此,我们的研究结果显示,SD-mediated CORT生产过剩引起肠道菌群失调,进一步引发了炎症反应,最终导致结肠炎的发生。

我们进一步研究细胞和分子机制之间的相声CORT生产过剩和肠道微生物群。有HSP70表达水平和减少P23 mRNA和GR的增加蛋白质和一半mRNA在CORT-treated老鼠。HSP90-GR-CORT复杂,稳定cochaperones P23和HSP70,改善CORT老鼠(24];它移动到细胞核,与糖皮质激素响应元件调节下游信号通路(25]。这意味着GR合成和运输是增强,HPA轴的负反馈调节是削弱了CORT老鼠。CORT治疗符合HPA轴失调,还摧毁了结肠肠线粒体功能和抗氧化能力。高剂量的gc可以间接诱导氧化应激通过抗氧化分子的损耗或抑制抗氧化酶(26]。一种可能性取决于我们的研究线粒体功能失调的诱导活性氧的生产过剩,创建一个缺氧利基由于耗氧量,并能通过摄动影响肠道微生物群的正常肠道环境,允许细菌抗原穿透上皮和刺激免疫反应(27]。因此,我们得出的结论是,抗氧化剂的消耗,生产ROS、CORT曝光后,脂质过氧化反应发挥重要作用在肠道微生物群imbalance-mediated炎症反应引起结肠炎。

有趣的是,我们的研究结果表明,太补充规范化CORT-treated小鼠血浆CORT水平。CORT水平,符合减少太增强结肠线粒体功能和抗氧化能力,扭转了肠道菌群代谢失调和肠粘膜屏障损伤。我们进一步探讨MT缓解肠道粘膜损伤的具体机制通过体外实验。显著增加活性氧含量和GR表达水平一半寿命蛋白质和mRNA和HSP70和P23 mRNA表达减少观察结肠CORT-treated iec。然而,太补充逆转CORT的变化引起的。同样,ru - 486,皮质激素受体拮抗剂复制太的影响,ROS和一半的差别导致对这些基因的mRNA表达和upregulation HSP70和P23 mRNA表达,表明GCs对GR转录regulation-mediated氧化应激有直接影响。之前的研究也表明,增加GR水平与HPA轴与氧化应激障碍有着密切的交互(28]。进一步探索参与炎症反应的机制诱导氧化应激在CORT-treated iec,我们集中在NF -κB途径,这是氧化应激的重要中介。我们还发现NAC对p-STAT3的表达水平有负面影响,AP-1 p-P65,并导出κB蛋白,但没有观察到GR的变化的合成和运输,这表明氧化应激改变细胞内的活动效应器STAT3 / AP-1 / NF -κB (29日]。重要的是,我们观察到4 p-pdot拮抗剂是,中和MT的改善效果,促进了GR表达水平的蛋白质和ROS和激活STAT3 / AP-1 / NF -κB通路。以前的研究也表明,超表达是,但不是MT1,对氧化应激有显著改善作用,内质网应激、线粒体功能障碍(30.]。这些结果表明,太,是介导的受体,抑制CORT-induced GR STAT3的合成和运输和激活/ AP-1 / NF -κB途径,进一步抑制氧化应激,调节肠道菌群的失衡及其代谢物,最终,导致肠粘膜屏障功能障碍引起的SD。

本研究建议CORT、有害物质,在SD-mediated肠道微生物群中起着关键作用dysbiosis-induced结肠炎。然而,腹腔内注射的是一种有效的方式来减轻CORT-induced代谢副作用通过SD是受体的老鼠。重要的是,我们的数据提供了新的证据的有利影响太过度的生理调节剂CORT-mediated肠道疾病和也支持最近扩大的益生菌的定义包括MT-based策略。

5。结论

总之,melatonin-mediated是削弱了GR反馈,抑制氧化应激,恢复肠道菌群及其代谢物体内平衡,灭活STAT3 / AP-1 / NF -κB pathway-induced炎症反应,进一步提高SD-induced结肠炎。

数据可用性

本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。

的利益冲突

作者宣称他们没有潜在的利益冲突,包括任何金融、个人、或其他关系,与他人或组织。

作者的贡献

Y.C.和T.G.导致了研究设计。Y.C.获得资金。T.G.进行实验。T.G.,Z.W., J.C., and Y.D. analyzed the data. T.G. and Y.C. wrote the manuscript. All authors reviewed the final manuscript.

确认

这个工作是由中国国家自然科学基金(31873000,31672501)和北京自然科学基金(6182018)。

补充材料

补充1。图S1:褪黑素对HPA轴的影响活动和睡眠小鼠肠道菌群组成。ROS (A)水平,GR (B)蛋白质,一半(C) mRNA, HSP70 (D) mRNA,和P23 (E) mRNA的表达。相对丰富的拟杆菌门(F),壁厚菌门(G), Proteobacterium (H)和Prevotellaceae (I)的结肠F-CON, F-SD, F-SM, F-R组。给出的值 。使用方差分析和差异评估表示如下:不同的小写字母: ;不同的大写字母: ;和相同的字母: 。

补充2。图S2: FMT重建肠道微生态学类似案子,SD和SD +太老鼠。ZO-1 MUC2免疫组织化学染色(A) (B),和Claudin-1 (C)在结肠部分(规模:50μ米)。IOD MUC2的(D), ZO-1 (E)和Claudin-1 (F)的蛋白质。戴分数(G);相对荧光素酶活性对结肠渗透率(H);相对蛋白质含量Card9(我);IL-17浓度(J);相对丰富的拟杆菌(K),厚壁菌门(L), Prevotellaceae (M),和Proteobacterium (N)的结肠F-CON, F-SD F-SM和F-R组( )。给出的值 。使用方差分析和差异评估表示如下:不同的小写字母: ;不同的大写字母: ;和相同的字母: 。

补充3。图S3: FMT重建氧化应激和炎症反应类似的案子,SD, SD +太老鼠。CORT (A)浓度测定血清ELISA ( )。ROS (B)水平和表达水平的p-STAT3 (C), p-AP-1 (D),导出κB (E), p-P65 F-CON (F)的蛋白质,F-SD, F-SM,和F-R团体被蛋白免疫印迹检测,蛋白质含量和相对GAPDH规范化。给出的值 。使用方差分析和差异评估表示如下:不同的小写字母: ;不同的大写字母: ;和相同的字母: 。

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