文摘
越来越多的证据证实prolyl异构酶的关键作用PIN1在衰老和衰老相关疾病。然而,PIN1机制在老年性听力损失(ARHL)仍不清楚。病理上,ARHL主要是由于头发细胞的损失和功能障碍(高碳钢)和耳蜗螺旋神经节细胞(国网公司)。因此,在这项研究中,我们旨在调查的作用PIN1在保护毛细胞和听觉HEI-OC1细胞衰老。酶联免疫吸附试验、免疫组织化学和免疫荧光被用来检测PIN1 ARHL患者的血清蛋白水平和C57BL / 6小鼠在不同的组,在国网公司和高碳钢的年轻岁C57BL / 6小鼠。此外,模型HEI-OC1细胞衰老引起的H2O2是使用。成人C57BL / 6小鼠用胡桃酮治疗,或胡桃酮和南汽,4周。有趣的是,我们发现PIN1 ARHL患者的血清蛋白表达下降,衰老HEI-OC1细胞,在老年小鼠的耳蜗。此外,在H2O2和胡桃酮治疗,产生大量的活性氧,磷酸化p53诱导。重要的是,PIN1表达与p53抑制剂显著增加了治疗pifithrin -α。超表达PIN1逆转p-p53水平的增加和营救HEI-OC1细胞衰老。此外,PIN1 PI3K / Akt介导的细胞衰老的/ mTOR信号通路。从C57BL / 6小鼠体内数据显示胡桃酮治疗导致听力丧失。总的来说,这些发现表明,PIN1可能作为调制器毛细胞和HEI-OC1细胞衰老的关键。
1。介绍
老年性听力损失(ARHL)或老年性耳聋是一种流行疾病衰老的人1,2]。听力损失发生在大多数人随着年龄的增长。大约有三分之一的人超过65岁受到听力损失的影响根据世界卫生组织。随着全球人口老龄化的,超过5亿人受到ARHL [3]。这个条件显著影响老年人的日常沟通,并已被证明是与诱发认知障碍和痴呆。ARHL特点是年龄相关性听力下降功能。病理上,这种情况主要是由于头发细胞的损失和耳蜗螺旋神经节细胞(国网公司)(4]。然而,ARHL的确切机制在很大程度上仍未知。
Peptidyl-prolyl独联体/反式异构酶(PIN1)是一种新型postphosphorylation信号调节器。PIN1调节通过控制蛋白质的结构磷蛋白质通过中介的异构化具体磷酸化Ser / Thr-Pro图案。分子计时器,PIN1不仅控制细胞周期进程和细胞分裂,也调节细胞衰老5- - - - - -8]。亏损PIN1培养细胞诱导衰老(8]。PIN1淘汰赛小鼠显示出衰老表型(9]。PIN1表达拒绝在心肌老化(10]。这些结果表明,PIN1是一个重要的抗衰老的分子。然而,这个关键调控分子的作用在毛细胞以前没有检查。
许多以前的研究已经表明mTOR / PI3K / Akt通路调节自噬和凋亡的一个重要途径在内耳耳蜗(11- - - - - -14]。刘等人。11]证明了抗氧化酶PRDX1引发自噬在螺旋神经节神经元通过PTEN-Akt信号通路的激活。雷帕霉素缓解cisplatin-induced耳毒性通过促进自噬(11,15]。在Fus1 KO小鼠,研究人员发现失调的一种蛋白激酶和激活cochleae mTOR的(16]。虽然mTOR / PI3K / Akt通路与感觉毛细胞生存,PI3K / Akt / mTOR的机制调节头发细胞衰老不是完全定义。
HEI-OC1 hair-cell-like细胞系,细胞保持头发细胞特征,被广泛应用于许多先前的研究调查的头发细胞的保护机制(17- - - - - -21]。因此,在本研究中,我们使用老化C57BL / 6小鼠和H2O2对待HEI-OC1细胞决定的作用和机制PIN1头发细胞和HEI-OC1细胞的衰老。
2。材料和方法
2.1。参与者
选择的参与者来自河北医科大学第二医院。参与者年龄在30到80岁没有听力损失包含在对照组(30 - 60岁的27人;25人65岁- 80岁)。在这项研究中,20名病人临床决心有老年性SNHL包括学习小组。排除标准是严重的疾病,比如癌症、老年痴呆、精神障碍。
2.2。纯音听力测定
程序在一个隔音间进行。声音是通过耳机(TDH-50P)。6频率(250赫兹到8000赫兹)进行常规纯音听力检查(OB922听力计,马德森,丹麦)。每个频率计算的平均阈值为每个主题分别在两个耳朵。意味着个人主体阈值的250、500和1000赫兹平均获得的平均纯音听力水平低频率(PTA)和2000年的,4000和8000赫兹的平均纯音听力水平高频率(PTA)。霍奇金淋巴瘤被定义为 。
2.3。动物
C57BL / 6小鼠购买实验动物中心,查尔斯河(中国北京)。老鼠被分为两组:年轻组(2个月)和旧的组(12个月)。两个月大的老鼠被随机分为对照组、胡桃酮组,胡桃酮+南汽集团和DMSO组。每组有6老鼠。根据批准的协议的所有实验动物研究中心,河北医科大学。
2.4。酶联免疫吸附试验(ELISA)
离心后,血清样本立即冻结在-80°C进行进一步分析。人类PIN1 ELISA试剂盒(猫# zc - 32747),人类ROS ELISA试剂盒(猫# zc - 33336),鼠标PIN1 ELISA试剂盒(猫# zc - 54798),和鼠标ROS ELISA试剂盒(猫#佐- 38260)来自上海ZCIBIO。然后,浓度测量根据制造商的指示。450海里的吸光度测量使用Synergy2自动酶联免疫吸附试验(美国热费希尔科学,Inc .)。
2.5。细胞培养和细胞转染
HEI-OC1细胞(众议院耳朵Institute-Organ螺旋器1细胞株)种植在许可的条件下(33°C, 10%有限公司2)high-glucose杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;Gibco美国)含10%胎牛血清(的边后卫;没有抗生素Gibco BRL)。
HEI-OC1细胞培养在6-well盘子和转染细胞融合程度是70 - 90%。3000年Lipofectamine试剂与血清DMEM稀释。大师的混合DNA制备用无血清DMEM培养基稀释的DNA,然后添加P3000试剂,混合。3000稀释DNA和Lipofectamine试剂混合(1:1)和孵化在室温下15分钟。DNA-lipid复合物被添加到上层的细胞培养2天,33°C。
2.6。听觉脑干反应
所有小鼠麻醉与腹腔内注射(ketamine-xylazine的混合物:100毫克/公斤氯胺酮和10毫克/公斤甲苯噻嗪)。然后,铂电极针插入顶点(参比电极),在右耳后面(有源电极),在后面(地线)的老鼠。听觉脑干反应(ABR)以应对语气果核8、12、16、20、24、28岁和32 kHz。上录音进行了塔克戴维斯技术(TDT)系统III工作站运行在BioSigRP Soundbooth (IAC声学)。听力阈值被定义为最低强度来生成一个可再生的ABR波形。
2.7。免疫组织化学
C57BL / 6小鼠斩首后ABR测试。颞骨解剖,cochleae被获得在4°C和4%多聚甲醛固定过夜和脱钙4%乙二胺四乙酸钠3天在4°C。
cochleae被脱水处理,嵌入石蜡。石蜡包埋标本切的厚度4μm。我们选择形态完整的切片进行免疫组织化学染色。所选4μ部分是deparaffinized和水化。抗原的复苏是由一台微波炉。接下来,部分是孵化主要抗体PIN1(美国Proteintech 10495 - 1 - ap)一夜之间在4°C。后第二天,连续的孵化与生物素化的二次抗体和辣根过氧化物酶共轭链霉亲和素为30分钟37°C,部分沾3,3-diaminobenzidine (DAB)。幻灯片终于脱水、清除和安装用盖玻片。消极的控制由用磷酸盐代替主要的抗体。
2.8。免疫荧光
与钠4% EDTA脱钙作用后的解决方案3天在4°C, cochleae microdissected到三把(顶点、中间和基地)。HEI-OC1细胞用4%多聚甲醛固定。的组织和细胞标本第一permeabilized Triton x - 100解决方案然后堵塞10%正常山羊血清在室温下30分钟。与初级孵化后anti-PIN1(美国10495 - 1 - ap, Proteintech)抗体在一夜之间在4°C,样本然后洗了三次与二次荧光抗体与PBS和孵化1 h在37°C在黑暗中检测的主要抗体,其次是孵化,Alexa萤石488 - phalloidin 1 h在黑暗中在室温下。
2.9。试剂处理
HEI-OC1细胞被播种在six-well板块为每个实验24 h。在H2O2刺激,细胞使用PI3K抑制剂LY294002 (25μM, hy - 10108 / cs - 0150),美国),Akt激活SC79 (4μ美国APExBIO g / mL, B5663)和活性氧清除剂NAC(2毫米,G1902071,阿拉丁,中国)为1 h;p53抑制剂pifithrin -α(10μ美国APExBIO M, A4206)是用于24小时。PIN1抑制剂胡桃酮(1、5、10μ美国Sigma-Aldrich M, STBH9858)是用于45分钟。
2.10。Senescence-Associatedβ牛乳糖污点
细胞senescence-associatedβ牛乳糖(SA -β使用一个衰老加)进行染色β牛乳糖染色工具包(Beyotime生物技术研究所、上海、中国)后,制造商的指示。染色之前,细胞被轻轻洗与PBS和固定修复解决方案。与PBS洗涤三次后,1毫升的染色的解决方案是添加到每个好,用封口膜密封,在37°C没有孵化有限公司2过夜。
2.11。蛋白质提取和免疫印迹
收集细胞和细胞溶解在冰里帕缓冲区和PMSF 30分钟。检测磷酸化蛋白质需要的磷酸化酶抑制剂(04906845001,瑞士罗氏公司)。上层清液离心机在12000 rpm 20分钟在4°C。BCA蛋白质测定(中国Solarbio PC0020)是用于确定蛋白浓度。蛋白质从细胞中提取分离,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转移到聚偏二氟乙烯膜。膜被封锁的5%脱脂奶为2 h 37°C,然后孵化一夜之间在4°C anti-PIN1(稀释,1:1000;美国Proteintech 10495 - 1 - ap), p53(稀释,1:1000;美国Proteintech 21891 - 1 - ap), p-p53(稀释,1:1000;9284年,细胞信号技术,美国),p21(1: 1000稀释,1:1000;美国Proteintech 27296 - 1 - ap),第16页(1:1000年,10883 - 1 - ap, Proteintech,美国),一种蛋白激酶(1:1000年,ab8805 Abcam,美国),p-Akt(1: 1000年,ab81283 Abcam,美国),mTOR(1: 1000、2983、细胞信号技术,美国),p-mTOR(1: 1000、5536、细胞信号技术,美国),和GAPDH(美国2000年1:Proteintech)抗体。 ImageJ software was used to quantify the band intensity. The intensity value of each target band was normalized to that of GAPDH.
2.12。统计分析
所有的独立实验至少重复三次。给出的数据 ,用SPSS进行了分析。学生的 - - - - - -测试和单向方差分析被用于统计分析。值和 被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。PIN1和ROS浓度在人类和C57BL / 6小鼠血清
PIN1和ROS的血清浓度测定在所有参与者和C57BL / 6小鼠。elisa透露,ROS的表达水平增加病人ARHL组和旧的C57BL / 6小鼠(数字1(一)和1 (c))。PIN1表达水平下降的病人和老C57BL / 6小鼠ARHL(数字1 (b)和1 (d))。
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(c)
(d)
3.2。听觉脑干反应阈值升高和细胞衰老的Cochleae享年C57BL / 6小鼠
我们检查了年轻和年老老鼠的听觉功能测量上。如图2(一个),不仅是ABR阈值的高频的老老鼠明显高于年轻老鼠还在中、低老老鼠的频率明显高于年轻的老鼠,这说明老老鼠的听觉功能的下降。此外,结果表明,senescence-associatedβ牛乳糖(SA -β加-)阳性细胞在老鼠多岁比年轻小鼠螺旋神经节细胞(国网公司)(图2 (b)(图)和毛细胞(高碳钢)2 (c))。
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3.3。PIN1的表达下调的Cochleae享年C57BL / 6小鼠
我们检查了PIN1表达式在耳蜗年轻和年老的老鼠。如果包含IHC分析表明,PIN1蛋白表达在细胞质和细胞核的高碳钢(数字3(一个)和3 (b))和国网公司(图3 (c))。PIN1表达显著减少在旧的老鼠相比,年轻的老鼠(数字3(一个)- - - - - -3 (e))。线性分析表明,PIN1的表达在耳蜗听觉阈值(数据呈负相关3 (f)- - - - - -3 (h))。总的来说,结果表明,PIN1可能参与ARHL。
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3.4。Downregulation PIN1 HEI-OC1细胞诱导表达的H2O2
不同浓度的H2O2对细胞生存能力被MTS方法检测到。2 h后刺激的h2O2,相对观察细胞存活率和 计算(补充图吗1)。因此,HEI-OC1细胞暴露在H2O2(2 h 1毫米)诱导细胞衰老。此后,senescence-associated SA -β加染色法应用于检测衰老HEI-OC1细胞。如图4(一),细胞呈阳性的比例SA -β加在HEI-OC1增加细胞治疗H2O2。此外,H2O2p-p53的表达显著升高,p21和p16的价格相比对照组(图4 (b))。然而,PIN1蛋白表达,检测到免疫印迹(图4 (c))或免疫荧光(图4 (d)),显著减少HEI-OC1细胞治疗H2O2。
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3.5。PIN1调节HEI-OC1细胞衰老
为了更好地理解的作用PIN1 HEI-OC1细胞衰老的细胞,我们转染HA-PIN1超表达质粒与胡桃酮HEI-OC1细胞或治疗HEI-OC1细胞,PIN1抑制剂(22]。转染效果如图5(一个)和5 (c)。如图5 (e)和5 (g),PIN1过度导致的表达显著减少p-p53, p21和p16。SA -的百分比β-gal-positive细胞也减少PIN1进行靶向治疗组(数字5(我)和5 (j))。相比之下,胡桃酮抑制PIN1浓度的方式(数字5 (b)和5 (g))和加速衰老HEI-OC1细胞浓度的方式(数字5 (f),5 (h),5(我),5 (j))。然而,这些变化并没有发现不同剂量的溶剂对照组(补充数据2(一)和2(B))。
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3.6。PIN1介导HEI-OC1细胞衰老影响PI3K / Akt / mTOR信号通路
免疫印迹结果表明PIN1过度救了H2O2全身upregulation HEI-OC1 p-Akt和p-mTOR表达的细胞(图6(一))。然而,PIN1抑制诱导upregulation p-Akt和p-mTOR表达式(数字7(一)和7 (b)),p-Akt的表达和p-mTOR并没有改变在不同剂量的溶剂对照组(补充数据2(C)和2(D))。然后,为了进一步研究PI3K / Akt的角色/ mTOR HEI-OC1信号通路在细胞衰老,我们与SC79 HEI-OC1预处理细胞(一种蛋白激酶活化剂)或LY294002 (Akt抑制剂)在H2O2刺激。结果表明,无论是SC79还是LY294002改变了PIN1蛋白质含量(数字6 (b)和6 (d))。SC79调节p-p53的表达、p16和p21(图6 (c))和SA -的数量增加β-gal-positive细胞(图6 (f))。然而,LY294002相比SC79(数据有一个相反的效果6 (e)和6 (f))。这些结果表明,防护作用PIN1可以通过抑制PI3K / Akt介导/ mTOR通路在细胞衰老HEI-OC1。
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3.7。H2O2影响PIN1通过p53的表达,进而影响衰老
进一步调查ARHL PIN1的监管机制,我们使用了p53抑制剂pifithrin -α(击球α)来评估是否H2O2影响PIN1通过p53的表达。当HEI-OC1细胞与击球——孵化αp-p53蛋白质水平降低,但PIN1蛋白质水平显著增加(数据7 (c)和7 (d))。此外,我们研究了senescence-associated蛋白质的表达。结果表明,预处理的细胞与击球α引起显著减少p21的表达和p16(数字7 (c)和7 (e)),SA -的百分比β-gal-positive细胞也减少(数字7 (f)和7 (g))。结果表明,H2O2抑制PIN1的表达上调p53表达,进而影响衰老。
3.8。H2O2影响通过ROS p53的表达和活动,然后影响衰老
在衰老的模型和胡桃酮治疗组,高水平的ROS产生(数字8(一个)和8 (b))。检测是否ROS p53表达和活性的影响,我们使用了活性氧抑制剂N-acetyl-L-cysteine (NAC)。结果表明,活性氧的生产几乎恢复到对照组水平NAC治疗后(数字8(一个)和8 (b))。南汽导致恢复p-p53水平(数字8 (c)- - - - - -8 (f))。此外,细胞使用NAC时,PIN1的表达水平增加(数据8 (c)和8 (e)),p21和p16的表达水平降低(数字8 (c)- - - - - -8 (f))。SA -的百分比β-gal-positive细胞也减少了NAC治疗(数据8 (g)和8(h))。
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3.9。胡桃酮治疗C57BL / 6小鼠听力损失的结果
进一步研究减少PIN1表达式能否诱导头发细胞衰老,我们用胡桃酮治疗的小鼠,或胡桃酮和南汽在同一时间。腹腔内注射的胡桃酮(1毫克/公斤,4周每周3次)和/或NAC (1.5 g / kg / d,口服,4周)。如数据所示9(一个)和9 (b)juglone-treated组,ROS水平表达增加与对照组相比,血清和胡桃酮+南汽集团。胡桃酮+ NAC治疗组,PIN1水平表达增加血清与胡桃酮组。此外,juglone-treated组中,ABR阈值频率增加,尤其是在高频率。与juglone-treated组相比,胡桃酮+南汽集团明显减少ABR阈值在高频率(图9 (c))。基底的毛细胞,有更多的SA -βjuglone-treated -gal-positive细胞群体比其他群体(图9 (d))。
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4所示。讨论
感音神经性听力损失是由许多因素引起损害毛细胞和螺旋神经节神经元功能(23- - - - - -28),包括毒性药物、遗传因素、老化,噪声暴露和耳蜗慢性感染(29日- - - - - -33]。越来越多的证据表明,PIN1扮演着关键的角色在aging-associated疾病(34- - - - - -39]。PIN1-deficient老鼠表现出过早衰老的迹象,如快速的端粒缩短和运动协调和行为缺陷和神经元损失(7]。据报道,过度PIN1救助细胞衰老的动脉粥样硬化VSMCs,会使p53、p21的表达40]。鞭打et al。10)报道,击倒PIN1导致细胞衰老,但过度PIN1抑制心脏祖细胞的衰老。然而,PIN1的角色在ARHL以前没有报道。对于这个研究,PIN1蛋白表达明显降低患者的血清ARHL,国网公司,高碳钢的老老鼠和衰老HEI-OC1细胞。PIN1的表达在耳蜗听觉阈值呈负相关。体外,过度PIN1抑制HEI-OC1细胞的衰老。在HEI-OC1细胞抑制PIN1加速衰老。体内,我们发现胡桃酮治疗导致C57BL / 6小鼠听力损失,尤其是在高频率。所有这些结果支持我们的假设,PIN1调节HEI-OC1和头发细胞衰老。
由于报纸等人报道,PI3K / Akt信号通路的激活诱导细胞衰老,和mTOR相关中介(41]。在这个信号通路,mTOR的下游目标PI3K / Akt信号通路,和Akt是一个积极监管机构mTOR的42]。mTOR抑制剂的研究表明,局部应用雷帕霉素可以减少p16蛋白表达和细胞衰老皮肤组织(43]。胡锦涛et al。(44]表明,Akt / mTOR活动增加在斑马鱼视网膜老化,并增加一种蛋白激酶/ mTOR活动是一个主要玩家在斑马鱼老年性视网膜神经病变。它也表明,庆大霉素导致一种蛋白激酶的激活在螺旋器和螺旋神经节细胞(45]。mTOR抑制剂雷帕霉素对庆大霉素保护感觉毛细胞。此外,雷帕霉素减弱噪音性毛细胞损失通过减少氧化应激(46]。然而,其它研究表明,PI3K / Akt信号是内耳的保护机制。据报道,PI3K / Akt是内耳的内源性保护机制。PI3K / Akt激活的保护小鼠免受耳蜗损伤和庆大霉素和噪音引起的听力损伤47,48]。抑制mTOR导致听觉毛细胞损伤和螺旋神经节神经元减少副产物(49]。抑制PI3K / Akt通路可以直接诱导衰老和增加p21的表达(50,51]。在本文中,我们表明,p-Akt的表达和p-mTOR HEI-OC1细胞治疗H2O2和胡桃酮显著增加。抑制mTOR / PI3K / Akt通路显著缓解H2O2全身在HEI-OC1细胞衰老。这些结果表明,一种蛋白激酶的激活而在HEI-OC1细胞衰老。
在多种癌症类型,许多研究表明,PIN1的表达水平和水平的一种蛋白激酶磷酸化强烈相关。然而,在老鼠实验表明,牙周组织,PIN1 siRNA增强mTOR和Akt激活,减毒的PIN1超表达(52]。在目前的研究中,PIN1过度引起的减少p-Akt的表达。的抑制作用PIN1 upregulation p-Akt和p-mTOR表达引起的。此外,一种蛋白激酶的激活加剧H2O2全身在HEI-OC1细胞衰老。这些结果表明,PIN1保护HEI-OC1细胞衰老通过抑制PI3K / Akt / mTOR信号通路。
p53在细胞衰老的过程中扮演着关键角色。p53发起各种应激反应,包括细胞周期阻滞和老化53]。p53的表达促进老化。我们的数据表明,p-p53的表达明显高于在H2O2全身HEI-OC1细胞比控制细胞。宋et al。54)报道,内质网(ER)压力减少PIN1通过激活p53表达,和超表达p53表达显著地降低PIN1 HCT116细胞。然而,PIN1表达式的监管者在老化还没有完全理解,尤其是在ARHL。在我们的研究中,当细胞治疗与p53抑制剂pifithrin -αPIN1表达显著增加,所以我们假设H2O2可能调节PIN1通过p53表达。p-p53表达显著减少PIN1超表达。这些发现表明,PIN1和p53互相调节。然而,确切的机制还有待确定。
ROS的逐步积累在老化过程中是一个关键的中介。在目前的研究中,H2O2和胡桃酮治疗导致活性氧的增加活动,表明H2O2通过ROS的产生诱导衰老,抑制PIN1引起活性氧产量也增加。活性氧清除剂NAC能减少ROS生产、反向体内生物标志物的变化,保护细胞免受ROS-induced细胞衰老,间接抑制mTOR [55- - - - - -57]。在这项研究中,我们还发现,南汽减少ROS生产和扭转体内生物标志物的变化。在PDAC细胞,沉默PIN1显著增加细胞内ROS (58]。在这项研究中,我们推测,显著降低PIN1表达式可能会增加活性氧的生产。
总的来说,在H2O2治疗(或PIN1抑制),产生大量的活性氧,活性氧的生成调节p-p53表达式。然后,p-p53消极监管PIN1表达式,p-p53 PIN1逆转的过度增加。更重要的是,PIN1介导细胞衰老影响PI3K / Akt / mTOR信号通路(图10)。
最重要的是,我们的研究结果,首次证明了PIN1表达式ARHL患者血清中表达下调,cochleae的C57BL / 6小鼠岁和衰老HEI-OC1细胞。体内的数据表明,PIN1抑制导致听力丧失。然而,只有动物和细胞实验和临床数据和结论缺乏。在未来需要解决这些限制。
数据可用性
数据可以在手稿和补充信息文件。
的利益冲突
所有作者宣称他们没有经济利益冲突。
补充材料
补充1。补充图1:不同浓度的H2O2对细胞生存能力被MTS方法检测到。刺激后H2O22 h,我们观察到相对细胞存活率和计算 。
补充2。补充图2:(A, B)为p53的表达,免疫印迹p-p53, p21和p16在HEI-OC1细胞治疗后DMSO (0.1, 0.5, 1μL);(C, D)免疫印迹p-Akt的表达,一种蛋白激酶,p-mTOR, mTOR HEI-OC1细胞治疗后在DMSO溶液(0.1,0.5,1μL)。