文摘
背景。肾上腺病变和可能潜在的分子机制目前还不清楚在动脉粥样硬化(AS)的情况下结合长期的压力(CS)。方法。新西兰白兔被用来构造一个CS和作为动物模型。蛋白质组学和生物信息学是用来确认中心在CS和肾上腺相关蛋白质。使用免疫组织化学方法观察中心蛋白,免疫荧光检测,免疫印迹。实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)被用来分析基因的表达。此外,建立了神经网络模型。定量关系被三次样条插值推断。线粒体柠檬酸合成酶的酶活性和OGDH被酶检测试验设备。柠檬酸合成酶的函数和OGDH击倒肾上腺细胞株进行实验。此外,目标genes-TF-miRNA监管网络建设。 Coimmunoprecipitation (IP) assay and molecular docking study were used to detect the interaction between citrate synthase and OGDH.结果。两个最重要的枢纽蛋白(柠檬酸合成酶和OGDH)与CS和肾上腺中被确定使用大量的生物信息学方法。中心蛋白质主要是富含线粒体质子运输ATP合酶复杂,ATP酶激活,AMPK信号通路。与对照组相比,肾上腺更大更无序,不规则,a + c群和坏死。柠檬酸合成酶的表达和OGDH a + c组高于对照组,蛋白质和mRNA水平( )。有着很强的相关性之间的横向肾上腺、柠檬酸合成酶和OGDH ( )通过枪兵的ρ分析,接受者操作特性曲线、神经网络模型和三次样条插值。柠檬酸合成酶的酶活性和OGDH增加动脉粥样硬化的情况下和慢性压力。通过CCK8化验,肾上腺细胞生存能力大幅下调后的柠檬酸合成酶和OGDH击倒的实验。目标genes-TF-miRNA监管网络预测微之间的密切关系,柠檬酸合成酶和OGDH。后Coimmunoprecipitation (IP)测定,结果显示,柠檬酸合成酶和OGDH coexpressed肾上腺。对接分数的分子对接研究表明,最佳的柠檬酸合成酶之间复杂的构象和OGDH是-6.15千卡每摩尔。结论。结合CS扮演了一个重要的角色在肾上腺(HPA)轴,促进肾上腺肿大,增加糖皮质激素(GC)的释放,并可能提高ATP合成和能量代谢体内通过柠檬酸合成酶和OGDH基因的目标,为未来提供一个潜在的研究方向相关的探索到这种机制。
1。介绍
动脉粥样硬化(AS)是一种慢性进行性疾病,其特征是脂类的积累和沉淀和纤维组件和炎症反应导致病变的发展;是最常见的和重要的成员组血管疾病统称为动脉硬化(1]。冠心病的主要原因,脑梗塞,和周围性血管疾病,近年来其发病率已增加,严重威胁人类生命和健康(2,3]。特点是影响动脉的病变,从内膜,其次是结合各种病变,包括当地的脂质和复杂碳水化合物积累,纤维增生,和钙质沉着,形成斑块,导致动脉媒体的逐渐退化,其次是次要的迹象包括intraplaque出血,斑块破裂,和当地血栓”或“其次是继发性病变和其他迹象包括intraplaque出血,斑块破裂和局部血栓形成(4]。的病因尚未完全确定,但研究表明这种疾病可能是由于多种因素作用于不同的通路。主要危险因素包括年龄、性别、血脂异常、高血压、吸烟、糖尿病和葡萄糖耐量,慢性压力,肥胖,和一个家庭的历史。
慢性压力(CS)是一种非特异性的系统性反应发生在身体被心理刺激,环境或生理压力在很长一段时间5]。生理反应CS一直被认为是有效的监管机构的发展。研究表明,慢性心理压力会增加患动脉粥样硬化疾病的风险,包括中风和冠心病6]。CS能激活体内各种应力途径(7),包括肾上腺(HPA)轴和交感神经系统(SNS)。这可能对心血管产生负面影响,内分泌和免疫系统,导致与压力相关的疾病的发生和发展,威胁人类健康8,9]。然而,病理变化,发生在肾上腺和可能的分子机制目前不清楚的情况下结合CS。
生物信息学是科学的存储、检索和分析生物信息使用计算机作为工具在生命科学的研究。生物医学研究技术的不断发展,特别是测序技术和生物信息学算法,越来越多的基因组学信息成倍增长积累(10,11]。
柠檬酸合成酶(12)和氧化戊二酸脱氢酶(OGDH) [13]催化乙酰辅酶a的冷凝糖酵解或其他与草酰乙酸合成柠檬酸异化的反应。他们的病原反应酶线粒体三羧酸(TCA)周期和参与许多重要的生化过程。目前,肾上腺病变之间的关系,这两个分子的条件下,结合CS还不清楚。
本研究进行了研究肾上腺的变化下结合CS和揭示这些变化的核心基因通过富集分析,路径分析,构建神经网络模型,并通过动物实验验证。
2。材料和方法
2.1。动物和组
共有50个新西兰白兔(3个月大的时候, )从实验动物科学研究所,中国医学科学院(摄像头)&北京协和医学院(曾经)。兔子被随机分为4组:正常组( ),CS组( ),作为集团( ),和a + c群( )。这些动物可以自由地获得自己的笼子里的食物和水(温度 ,相对湿度 )。动物伦理协议CAMS&PUMC动物保健和使用委员会颁发的。
2.2。CS模型的建设
建设CS模型主要包括对动物不稳定社会和物理压力两个月。交换舞伴的兔子是诱发社会压力的主要方法。方法用于生成物理应力由白噪声(80分贝),夜间照明,倾斜的笼子里,脚的冲击(1 mA)和频闪照明,以前的出版物中描述(14,15]。此外,建设CS模型的详细信息和计算机科学的评估动物模型的补充1。
2.3。建筑的模型
在手术之前,兔子一样,+ CS组与3%戊巴比妥钠麻醉的解决方案(3毫克/公斤的动物体重;由CAMS&PUMC、北京、中国)通过边际耳静脉。纵向切口进行正确的腹股沟和股动脉是孤立的。一个 气球充气先进到腹部动脉导管,与10自动取款机,然后轻轻地剥蚀三次。程序在无菌条件下进行。在被放置在笼子里,动物们被允许恢复的观察。在手术后的第一个五天,青霉素钠是由肌内注射的剂量每天40000 U。提供的动物是一个正常的食物饮食为4周,紧随其后的是高脂肪饮食(6%豆油和1%胆固醇)8周(15,16]。
2.4。获得组织
建立动物模型的实验后,动物麻醉有3%戊巴比妥的解决方案(300毫克/公斤体重),和空气栓塞。兔子的死亡被认定为心脏和呼吸被捕。
整个腹主动脉被然后均匀切成四段。两个部分(髂动脉附近)是嵌入在10月Tissue-Tek化合物(樱花,日本东京)冰冻切片,和其他人snap-frozen在液态氮分子实验。
双边肾上腺被移除。新鲜的一半部分左肾上腺可以用来衡量线粒体柠檬酸合成酶的酶活性和OGDH。和新鲜的左肾上腺的另一部分将被嵌入到10月Tissue-Tek化合物(樱花,日本东京)冰冻切片,hematoxylin-eosin(他)染色、免疫组织化学和免疫荧光检测。右肾上腺snap-frozen在液态氮分子实验,包括RT-qPCR、免疫印迹,coimmunoprecipitation (IP)测定。
通用数据的动物体重、食物摄入量,生物化学、炎症和血液形态提出了补充2。
2.5。等压标签或相对和绝对定量蛋白质组学(iTRAQ)
2.5.1。原则
iTRAQ蛋白质组定量技术可以使用多个(2 - 10)稳定同位素标记明确标签肽的氨基酸组串联质谱分析。它可以比较不同样品中蛋白质的相对含量同时可以用来研究蛋白质表达水平的差异在不同病理条件下样品。
三个肾上腺样本随机选择的四个组。接下来,进行蛋白质提取使用旋涡混合器(海门麒麟贝尔仪器制造有限公司,ql - 901、海门、中国)和超声波细胞粉碎机(南京Xianou仪器制造有限公司,XO,南京,中国)。蛋白质是减少和密封。之后,使用胰蛋白酶蛋白质切成肽,与一个iTRAQ®工具(AB Sciex, PN: 4381664、钙、美国)。每组被贴上不同的肽混合物8-plex iTRAQ试剂(AB Sciex, PN: 4381663、钙、美国)。每个样本的标记肽是混合数量相等。液相色谱串联质谱(质/ MS)与Durashell-C18进行检测和分析, ,100 (Agela,项目没有:DC952505-0,北京,中国)。蛋白质分析是由Na-upgrade反相色谱法问Exactive高频高效液相色谱仪。执行分析iTRAQ女士使用热问Exactive型铅锌矿质谱仪,和生成的原始质谱文件处理的支持商业软件蛋白质组从热发现者2.1。
2.6。总体分析,识别结果和差异表达蛋白质(DEP)筛查
聚类分析是进行蛋白质,呈现的形式的热图。中值归一化后,量化值进一步规范化使用Perseuse(生物化学研究所,2019)。重复的样本数量超过三个,配对 - - - - - -测试是直接使用差异分析,和一个值≤0.05 DEPs识别常见的中心。
2.7。(PPI)蛋白质相互作用网络和枢纽的蛋白质
DEPs被导入到检索的搜索工具相互作用基因(字符串;http://string-db.org)(10.5版)(17),PPI网络时生成一套中等的信心> 0.4。维恩图被用来识别常见DEPs在不同组。PPI网络可视化使用Cytoscape(3.6.1版)(18]。分子复杂的检测(MCODE) [19)(1.5.1版本)被用来发现PPI网络紧密耦合的地区,这可以用来识别PPI网络中最重要的模块。MCODE标准如下: , , , ,和 。当 ,中心被确定的蛋白质。世纪挑战帐户集团和EPC算法也被用来屏幕中心蛋白质。
2.8。验证使用Metascape
DEPs两个列表(DEPs CS和正常组和DEPs一样+ CS和组之间)都进入Metascape进一步分析(20.]。这些列表之间的重叠被圆环图显示(21]。特别是,饼图是用来可视化方面是否由多个列表和共享的理解彼此相关的条款。进一步探索条件之间的关系,丰富的选择和作为网络,这些术语了 。两个本体类别(DisGeNET [22]和PaGenBase [23)被用来识别基因列表。浓缩是一个标准值< 0.01,一个 ,和一个最小数3。
2.9。加权基因Coexpression网络分析(WGCNA)
WGCNA可以用来探索coexpressed基因模块和分析之间的联系网络。此外,它可以用来找到模块之间的关系和特征,并进一步屏幕中心网络中的节点。详细过程如下。首先,检查数据的完整性。第二,选择一个值建立一个相邻矩阵根据连接的程度,所以,我们的基因分布符合无标度网络。第三,一个拓扑矩阵用于集群度的差异基因,基因簇树被切成不同的模块采用动态剪切法。第四,相关分析模块和样本之间的特征。第五,拓扑重叠的热图是用随机选择的基因。第六,中心由WGCNA基因验证。
2.10。富集分析
富集分析可以用来找到一个类中基因或蛋白质的基因或蛋白质,所以更容易找到有价值的功能类别或通路中确认的蛋白质组学的列表。基于超几何分布的统计显著性检验、功能富集分析使用群体分析计算响应差异识别或蛋白质在一个基因本体论(去)功能类别或京都基因和基因组的百科全书(KEGG)通路如果有很大程度的浓缩的基础上值和错误发现率(罗斯福)校正。越小值或罗斯福价值,浓缩值越高,越高程度的浓缩。
2.11。中心与肾上腺皮质疾病相关的蛋白质的识别。
比较Toxicogenomics数据库(CTD;http://ctdbase.org/)提供了关于基因或蛋白质之间的相互作用和疾病信息。肾上腺皮质疾病之间的关系,使用连续油管中心蛋白进行了分析。
2.12。他染色
2.12.1。原则
苏木精染色是碱性,主要使染色质在细胞核和细胞质中的核糖体紫蓝色。伊红是一种酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质红色的组件。他在组织学染色法是最基本的技术,胚胎学和病理学。
他染色染色细胞核bluish-purple和细胞质红色。他染色是用于执行肾上腺的一般检查。具体步骤如下。首先,组织部分在室温下干了20分钟。第二,苏木精染色了3分钟。第三,0.5%盐酸酒精添加几秒钟来区分样本。第四,曙红了30分钟,与梯度酒精脱水,然后使用二甲苯任何无污点的样本呈现透明。立体显微镜下的观察标本(Axio变焦V16、蔡司、德国)。
2.13。免疫组织化学和免疫荧光试验
2.13.1。原则
免疫组织化学技术基本原理的基础上抗原抗体反应,即抗原与抗体的特定组合,。通过化学反应,antibody-labeled显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)可以产生颜色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)。然后定位、定性和定量研究进行对这些抗原。免疫荧光分析的原理是一样的免疫组织化学技术。然而,抗原是免疫荧光测定的荧光标记。
肾上腺组织石蜡包埋,切片。石蜡切片脱蜡和水,用过氧化氢密封,然后用蒸馏水清洗。石蜡部分进一步用磷酸盐(PBS、Servicebio G1202,武汉,中国 )。片密封与10%山羊血清(TransGen生物技术,北京)37°C 20分钟。血清与滤纸移除。柠檬酸合酶多克隆抗体( ,16131 - 1 - ap、ProteinTech Rosemont,美国)是应用一滴一滴地,一夜之间,样品被孵化在4°C。PBS是用来洗样品三次(5分钟/时间),然后用第二个样本孵化抗体( )1 h在37°C。Diaminobenzidine (Servicebio G1211,武汉,中国)是用于颜色开发。每个石蜡切片被拍到在六个领域。柠檬酸合成酶水平也发现使用免疫荧光测定。
接下来的过程,检测氧化戊二酸脱氢酶的表达水平(OGDH),类似于上面的,但第一抗体使用OGDH多克隆抗体( ,15212 - 1 - ap, ProteinTech Rosemont,美国)。OGDH水平也发现使用免疫荧光测定。
2.14。实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)
2.14.1。原则
RT-qPCR用于标签和跟踪的PCR产物荧光标记探针和反应过程实时在线监测。结合相应的软件,这个分析可以计算出样品的初始浓度。它可以用来检测基因表达水平的信使rna。
隔离RNA,权力均质器被用来同质化肾上腺组织样本1毫升的试剂盒试剂(Servicebio G3013,武汉,中国)每100毫克的肾上腺组织。核糖核酸的浓度和纯度测定使用ultramicrospectrophotometer(热Nanodrop 2000年,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)。RNA,反转录如下:使用模板2μg;0.5益生元(dT) 18个引物μL和gene-specific底漆1μ;水,nuclease-free 15μ15 L,总量μl .表1显示了CS和OGDH所使用的引物序列。以下组件被添加在显示顺序:5 x反应缓冲区4μL, Servicebio®RT酶混合一个,1μL (Servicebio G3330,武汉,中国),总体积,20μl .进行PCR扩增和结果处理2- - - - - -ΔΔCt。肌动蛋白是作为内生控制。
2.15。西方墨点法
2.15.1。原则
免疫印迹分析可将蛋白质与不同分子量通过sds - page胶,然后目标蛋白质转移到PVDF膜。基于特定的抗原和抗体结合的原则,具体主要抗体可以结合靶蛋白,然后HRP-labeled二级抗体可以结合主要的抗体,这可能被ECL发光液的颜色。最后,这个分析可以检测组织或细胞中的某些蛋白的表达。
肾上腺组织块和预冷PBS洗两到三次,和裂解缓冲(Servicebio G2002,武汉,中国)添加到孤立的总蛋白质。有50到100μ克蛋白质添加到每个车道,然后10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)是用于电泳。接下来,蛋白质从凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,和5%的脱脂牛奶是用来密封膜1小时。主要抗体应用一滴一滴地,一夜之间,样品被孵化在4°C。辣根peroxidase-labeled二级抗体(1:2500)是补充道,和样品在室温下孵化2 h。
GAPDH是作为内生控制。鼠标anti-rabbit GAPDH多克隆抗体( ,GB12002 Servicebio,武汉,中国)是用于检测GAPDH,二级抗体也是一只山羊anti-mouse单克隆抗体( ,ab205719 Abcam,剑桥,英国)。柠檬酸合酶蛋白被发现使用柠檬酸合酶多克隆抗体( ,16131 - 1 - ap, ProteinTech Rosemont,美国)。OGDH蛋白质检测使用一个OGDH多克隆抗体( ,15212 - 1 - ap, ProteinTech Rosemont,美国)。二次抗体应用( )。这部电影是扫描一个增强化学发光设备(美国马萨诸塞州微孔,Billerica)。Image-Pro + 6.0(美国芝加哥媒体控制论Inc .)是用于分析的光密度值的目标乐队。
2.16。线粒体柠檬酸合成酶的酶活性和OGDH
2.16.1。原则
线粒体柠檬酸合成酶的活性测定的酶分析工具包(Abcam ab119692)。的微型板块分析ab119692用于确定线粒体柠檬酸合成酶(CS)活动样本immunocapture-based方式。井内的酶捕获的微型板块,和活动是由记录颜色TNB的发展,这是来自DTNB反应中柠檬酸合成。整体反应产物,TNB,吸收412海里。
OGDH的活性测定的酶分析工具包(USBiological生命科学,219370)。的OGDH生物测定™工具提供了一种方法来监控OGDH活动。化验,OGDH alpha-ketoglutarate转换成一个中间这降低了探测器的产品,并有很强的吸光度在450海里。分析可以检测OGDH活动低于0.1μ的样本。
新鲜的肾上腺组织准备指示。提取的蛋白质浓度测定。所有试剂都是室温。样品稀释至所需的蛋白质浓度在孵化缓冲区,和125年μg蛋白用于试验。100 L样本添加到每个使用。板密封在一个盘子瓶在300 rpm孵化所有步骤和孵化3小时在室温下。送气音和洗两次。每个好洗,吸气,这是重复一次总共两个洗,洗吸气或减压井然后配药300μL 1 x清洗缓冲到每个如上所述。完全删除的液体在每一步对良好的性能至关重要。最后洗后,剩余的缓冲区被愿望或卸载删除。板是反向,涂抹对干净的纸巾去除多余液体。100年μL刚做好1 x轻轻活动的解决方案是添加到每个减少气泡的产生。泡沫破灭,吸光度随时间标在412 nm(柠檬酸合成酶)或450海里(OGDH) 15到30分钟立即被记录。根据协议,酶活性(1 U)可以表示为每分钟吸光度的变化/数量的样本装入。
2.17。柠檬酸合成酶的函数和OGDH击倒肾上腺细胞株的实验
肾上腺细胞从中科购买质量检验有限公司有限公司的介质条件 。柠檬酸合成酶siRNA和OGDH siRNA加剧了北京Qingke生物技术有限公司有限公司柠檬酸合成酶的表达水平和干预后OGDH siRNA RT-qPCR被记录。CCK-8检测进行测试后肾上腺细胞的增殖活动柠檬酸合成酶和OGDH击倒的实验。实验测定随后CCK8工具包的规范(BIYUNTIAN C0038,中国)。电镀后一夜之间,药物补充道。然后,96孔板放置在一个37°C公司5%2孵化器孵化(热,3111)。10μL CCK-8的解决方案是添加到每个细胞中,孵化1 - 4小时孵化器。吸光度与标仪检测到450海里(上海反应实验设备有限公司,K3)。 。
2.18。建设和分析目标Genes-TF-miRNA监管网络
TFmiR (https://service.bioinformatik.uni-saarland.de/tfmir/)是一个免费的web服务器进行整合和分析TF-miRNA-target基因之间的相互作用。所有三个相关疾病的发病机理。细胞的内部工作取决于一个极其复杂的activation-suppression系统的正常运行,这可能会在很多方面感到不安。TFmiR有助于从分子水平上更好的说明的细胞机制的网络。TFmiR提供拓扑属性和功能分析,使其可靠的系统生物学在生命科学研究人员的工具。
2.19。Coimmunoprecipitation (IP)试验检测柠檬酸合成酶和OGDH之间的交互
2.19.1。原则
Coimmunoprecipitation试验可以用来研究蛋白质-蛋白质之间的关系基于特定的抗体和抗原之间的绑定和经常被用来验证是否有两个已知蛋白质之间的相互作用。
肾上腺组织与预冷洗2 - 3次PBS删除血痕,切成小块,放在匀浆管。10倍IP溶解产物(添加蛋白酶抑制剂在几分钟内使用前)添加和匀浆机。匀浆被转移到一家1.5毫升离心管和冰面上30分钟。离心后的上层清液收集(12000 rpm, 10分钟4°C)。和蛋白质浓度由BCA法决定。少量的上层清液是变性输入实验,免疫印迹是用于检测目标蛋白。
柠檬酸合酶蛋白(分子量:45 - kD)检测使用柠檬酸合酶多克隆抗体( ,16131 - 1 - ap, ProteinTech Rosemont,美国)。OGDH蛋白( )被发现使用一个OGDH多克隆抗体( ,# 26865 CST)。二次抗体应用(鼠标anti-rabbit免疫球蛋白轻链具体,合共轭,产品目录号:SA00001-7L, )。
1.0μg免疫球蛋白和20μL蛋白A / G珠子到负控制(免疫球蛋白)集团上层清液(拌匀使用前)。20μL蛋白A / G珠子被直接添加到实验组,动摇了,在4°C孵化1 h。离心后的上层清液中提取在4°C 5分钟在2000 rpm。1 - 10μL (0.2 - 2μg)抗体增加,孵化一夜之间在4°C。80年μL蛋白A / G珠子(混合使用前)添加和孵化在4°C 2 h。在4°C离心5分钟后在2000 rpm,上层是小心翼翼地吸气,免疫沉淀反应复杂的收集。免疫沉淀反应复杂洗4次,1毫升预冷IP溶解产物(不添加各种抑制剂)和离心机在4°C, 2000 rpm, 5分钟,每次洗后上层清液小心丢弃。最后洗后,上层清液吸收尽可能多的。然后,80年μL 1×减少示例加载缓冲区添加和煮10分钟。上层清液离心机在1000 rpm在4°C 5分钟。10μL的上层清液样本为西方墨点法测试。
2.20。对接OGDH和柠檬酸合成酶的研究
软件PyMol 2.3.4(德拉诺科技有限公司https://pymol.org/2/)被用来脱水和删除配体的受体蛋白质(OGDH)。MGLTools软件(分子图形学实验室,斯克里普斯研究所,http://mgltools.scripps.edu/)使用氢化受体蛋白质和计算费用。适当的框中心和框网格点参数设置为包括活性口袋站点配体(柠檬酸合成酶)可能绑定。七弦琴AutoDock 1.5.6 (http://vina.scripps.edu/)是用于受体蛋白的分子对接。二十个构象是通过对接研究,最好的复杂的构象对接使用PyMol 2.3.4得分是可视化。
2.21。统计数据
所有化验研究复制三次。使用SPSS统计分析软件(版本21.0;IBM公司,纽约,美国)。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。样本大小的计算是由PASS15.0软件,和详细的信息提出了补充3。
介绍了作为定量变量 (SD)或均值的标准误差(SEM),并使用Shapiro-Wilk测试正常测试。定性变量当作绝对频率和百分比。统计学意义是利用学生的决定 - - - - - -测试两组相比时或者通过方差分析和事后双尾Newman-Keuls测试当三个或更多组比较。列文的方差的同质性是检查测试。在列文测试中, 代表数据符合方差的同质性测试,和 代表数据没有按照方差的同质性测试。当数据符合方差的同质性测试,使用LSD (L)。当数据没有按照方差的同质性测试,Tamhane T2的多重比较测试使用。斯皮尔曼的ρ测试是用于分析相关性在柠檬酸合成酶、OGDH,肾上腺的横截面积。此外,我们构造的接受者操作特征(ROC)曲线,应用曲线下的面积(AUC)评估的准确性和灵敏度每个因素在诊断肾上腺的横截面积。神经网络模型构造使用柠檬酸合成酶,OGDH,肾上腺的横截面积来探索柠檬酸合成酶的价值和OGDH预测肾上腺的横截面积。最后,柠檬酸合成酶之间的定量关系,OGDH,横截面积的肾上腺被三次样条插值推断。
3所示。结果
3.1。筛选DEPs
所有的蛋白质都是集群并显示在一个热图,显示四组(图中存在众多差异1(一))。高手之间的一个火山情节展示了DEPs和CS组(图1 (b)),另一个显示了DEPs一样+ CS和组之间(图1 (c))。补充4提出Limma DEPs调查ID的完整, , ,adj。值,价值,和基因的名字。和补充5体现了蛋白质ID_gene DEPs的名字。有亲密关系之间的DEPs反对和CS组在第一PPI网络(图1 (d)),也有亲密关系中DEPs一样+ CS和组之间在第二PPI网络(图1 (e))。总共有128 DEPs同时出现在两个PPI网络中,它被定义为共同DEPs(图1 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。蛋白质鉴定中心
字符串在线数据库被用来构造一个DEPs PPI网络的普遍,和Cytoscape软件被用来可视化(图2(一个))。MCODE分析是用来检测PPI网络中重要的模块,如图所示2 (b)。三个不同的算法应用于蛋白质识别中心。如果≥10度,中心蛋白质可以被识别(图2 (c))。此外,蛋白质通过MCC高亮显示(图十中心2 (d))。EPC算法用于识别进一步十中心蛋白质(图2 (e))。共有六个常见中心蛋白得到的维恩图,包括LSS ACAT2, ac,柠檬酸合成酶,OGDH, ATP5C1(图2 (f))。常见的一般信息中心提出了不同的表达蛋白质表2。热图显示六个常见中心蛋白的表达水平在四组。与集团相比,六个常见中心蛋白是调节的a + c群。与对照组相比,六个常见中心蛋白质调节CS组。与对照组相比,中心蛋白质(柠檬酸合成酶和OGDH)是调节CS组(图2 (g))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
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3.3。蛋白质最重要的枢纽
这些列表之间的重叠(一个列表包括DEPs之间的控制和CS组;之间的其他列表包括DEPs和a + c组)所示一个圆环3图(图3(一个))。重叠基因的另一个有用的表示是基于其功能或共享的途径。之间的重叠基因列表可以显著提高通过考虑之间的重叠基因共享同一丰富基因本体论(图3 (b))。使用Metascape DEPs PPI网络的控制和CS组之间决心,如图3 (c)和重要模块被确定使用MCODE(图3 (d))。PPI网络之间的DEPs + CS组一样,也是决定,如图3 (e)和重要模块再次确认使用MCODE(图3 (f))。共有11个共同确定了两个列表(图之间的蛋白质3 (g))。维恩图解说明,这两个最重要的枢纽蛋白(OGDH和柠檬酸合成酶)被发现Metascape和动物模型(图3 (h))。
(一)
(b)
(c)
(d)
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(g)
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3.4。加权Coexpression网络建设和保护模块分析
在这项研究中,我们使用了R软件包“WGCNA”来构造一个coexpression网络。所有的基因表达谱都放在使用聚类分析模块。我们选择的力量 随着软阈值,保证一个无标度网络(图4(一))。一个示例系统树图和特征的热图”补充6:图所示S2一个”。分层聚类分析是使用flashClust函数,执行和结果呈现在图4 (b);这包括17个模块。17个模块集群使用一个eigengene系统树图(“补充6:图S2B”)。我们感兴趣的临床特征之间的关系和模块被确定基于相关性eigengene模块和临床特征。我们计算相关系数每个模块之间的值,每个临床特征来选择我们感兴趣的模块。当我们选择 作为意义的阈值,结果表明,鲑鱼模块之间存在着密切的关系和临床特征( , )(图4 (c))。热图是用来量化相关eigengenes(图组4 (d))。17 coexpressed模块之间的交互对所有基因进行了分析;浅色代表高重叠,逐步深红色表明低重叠。更浅的颜色块沿对角线代表coexpression模块(图4 (e))。散点图清晰地显示鲑鱼模块和临床特征之间的负相关( , )(图4 (f))。其他散点图显示的成员其他16个模块与基因(补充6:图的意义S2C和图S3),柠檬酸合成酶和OGDH MEsalmon PPI网络中扮演了重要的角色(图4 (g))。17 coexpression模块的选择基因的相互作用也进行了分析;浅色代表高重叠,逐步深红色表明低重叠。较浅的颜色块沿对角线代表coexpression模块(补充6:图S3B)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.5。浓缩DEPs的分析
去生物过程的浓缩分析结果显示DEPs calcineurin-NFAT级联的主要富集在消极的监管,对钙离子反应,和积极的调节蛋白质磷酸化(图5(一个))。去细胞成分的富集分析结果显示,线粒体基质DEPs主要是丰富,线粒体,线粒体内膜,线粒体proton-transporting ATP合酶复杂(图5 (b))。去分子功能的富集分析结果显示DEPs主要是富含钙离子绑定和atp酶活性(图5 (c))。KEGG通路富集分析的结果显示DEPs主要富集在代谢途径和AMPK信号通路(图5 (d))。此外,GO-slim富集分析显示DEPs也主要富集在碳水化合物代谢过程,线粒体和金属离子绑定(数字5 (e)- - - - - -5 (g))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
Metascape分析显示DEPs主要富集在前体代谢物的生成和能源和线粒体脂肪酸机会(补充6:图S4),丰富的网络术语表示为饼图,图表的颜色基于身份的基因列表(6:补充图S4B)。丰富的网络术语彩色通过集群ID(补充6:图绘制的S4C);条款包含更多的基因往往更重要值(补充6:图S4D)。在DisGeNET富集分析表明,DEPs主要是丰富精神和运动发育迟缓和认知延迟(补充6:图S4E)。此外,在PaGenBase富集分析显示DEPs主要富集在肾上腺(补充6:图S4F)。
3.6。基因鉴定中心
CTD数据库显示共同中心基因(柠檬酸合成酶和OGDH)与压力相关的疾病和肾上腺疾病,如图5 (h)。
3.7。病理染色分析
根据他染色分析,肾上腺细胞被安排在对照组常规订单。与大小的对照组相比,肾上腺大CS组,而肾上腺细胞的排列是无序的,不规则和坏死的组织。与肾上腺对照组相比,肾上腺的+ CS组更大更无序,不规则,坏死(图6(一))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
免疫组织化学分析表明,柠檬酸合成酶(图的表达6 (b))和OGDH(图6 (c)蛋白质是a + c组高于对照组。
定量分析表明,横截面积的肾上腺AC + CS组大于这个区域在对照组( ,图6 (d))和柠檬酸合成酶的表达( ,图6 (e))和OGDH ( ,图6 (f)蛋白质是a + c组高于对照组。
3.8。横截面积的相关分析肾上腺,柠檬酸合成酶、OGDH
热图显示有着很强的相关性之间的肾上腺的横截面积,柠檬酸合成酶,OGDH(图6 (g))。斯皮尔曼的ρ分析表明,一个强大的横截面积之间的关系存在肾上腺和相关蛋白表达的柠檬酸合成酶( , ,图6 (h))。肾上腺的横截面积也相对相关蛋白表达OGDH ( , ,图6(我))。此外,一个强大的横截面积之间的关系存在肾上腺和柠檬酸合成酶(的相关蛋白表达 , ,图6 (j))。
3.9。免疫荧光检测分析
免疫荧光试验表明,柠檬酸合酶蛋白表达是调节a + c组与对照组的表达(数字7(一)和7 (b))。OGDH蛋白表达是调节a + c组与对照组的表达(数字7 (c)和7 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.10。RT-qPCR化验
启用了RT-qPCR测定柠檬酸合成酶和OGDH表达在mRNA水平被发现。相对柠檬酸合成酶的表达和OGDH mRNA a + c组高于对照组( ,图7 (e))。
3.11。ROC曲线
ROC曲线建立了确定柠檬酸合成酶的影响和OGDH肾上腺的横截面积,与置信度判断曲线下的面积(AUC):柠檬酸合成酶( , )和OGDH ( , ),如图7 (f)。
3.12。柠檬酸合成酶的表达和OGDH蛋白质水平
免疫印迹分析表明,柠檬酸合成酶(图的表达7 (g))和OGDH(图7 (h)蛋白质是a + c组高于对照组。
3.13。神经网络模型和三次样条插值
培训后,神经网络预测模型取得了最好的效果,在均方误差为0.017171时代3000(图8(一个))和相对论为0.96726(图8 (b))。通过验证数据的预报值与实际值,我们发现只有微小的差异(数字8 (c)和8 (d))。基于上述结果,我们可以推测,柠檬酸合成酶和OGDH表达水平可能是肾上腺的横截面积的预测指标。使用三次样条插值算法,我们发现高危预警指标的肾上腺的横截面积: 和 (数据8 (e)和8 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.14。线粒体柠檬酸合成酶的酶活性和OGDH增加动脉粥样硬化的情况下和慢性压力
线粒体柠檬酸合成酶的酶活性在AC + CS组高于控制,CS,组( ,图9(一个))。同时,线粒体的酶活性OGDH AC + CS组高于控制,CS,组( ,图9 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.15。柠檬酸合成酶的函数和OGDH击倒肾上腺细胞株的实验
小干扰rna干扰柠檬酸合成酶基因后,柠檬酸合成酶的表达被rt - pcr检测,核组和柠檬酸合成酶的表达明显低于控制和模拟组(图9 (c))。此外,OGDH核组的表达明显低于控制和模拟组(图9 (d))。通过CCK8化验,肾上腺细胞生存能力大幅下调后柠檬酸合成酶(图的可拆卸的实验9 (e))。此外,肾上腺细胞生存能力OGDH siRNA组低于控制和模拟组(图9 (f))。
3.16。目标Genes-TF-miRNA监管网络
在目标genes-TF-miRNA监管网络,预测微之间的密切关系,提出了柠檬酸合成酶,OGDH(图9 (g))。
3.17。Coimmunoprecipitation (IP)试验检测柠檬酸合成酶和OGDH之间的交互
通过coimmunoprecipitation分析,首先,OGDH免疫沉淀反应,然后是柠檬酸合成酶是通过免疫印迹(数字来衡量的10 ()和10 (b))。此外,柠檬酸合成酶是免疫沉淀反应,然后OGDH被西方墨点法(测量数据10 (c)和10 (d))。在这个过程之后,Co-IP实验显示,柠檬酸合成酶和OGDH coexpressed肾上腺。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.18。OGDH和柠檬酸合成酶的分子对接研究
配体之间的绑定模式(柠檬酸合成酶)和受体蛋白质(OGDH)研究了分子对接。之间的对接构象结合能柠檬酸合成酶和OGDH计算,OGDH之间的对接得分和柠檬酸合成酶是-6.15千卡/摩尔(表3)。最低的结合能优化复杂的构象是-6.15千卡/摩尔,和平均结合能集群中是-6.03千卡/摩尔1(表4)。图11显示OGDH之间的绑定模式和柠檬酸合成酶(可视化选择的构象,集群1)。中氨基酸残基之间的氢键相互作用存在OGDH (VAL618、SER616 ARG631, GLU223, LEU151, ALA139, ASN470,和HIS221)和配体(柠檬酸合成酶)(表5)。
4所示。讨论
作为是一种疾病,其特征是在动脉粥样斑块的形成和产生的血管狭窄以及硬化、心血管和脑血管疾病的主要原因是(24]。随着现代社会经济的快速发展,社会和环境压力增加,CS事件从个人的工作和生活,不同程度的影响人们的生活。研究表明,长期CS事件的一个主要因素诱发心理和生理疾病(25]。CS导致应激激素的释放,如皮质醇和儿茶酚胺,可调节血流量和血压,导致血管内皮损伤,血小板钻井,造血干细胞增殖。交感神经刺激导致儿茶酚胺的释放,导致不仅冠状动脉收缩,而且易损斑块的破裂26,27]。增加炎症细胞因子和粘附分子的表达通过某些途径可以诱导单核细胞和淋巴细胞粘附[积累28]。此外,CS导致脂质代谢的失衡,影响表观遗传模式,诱发抑郁症,直接激活巨噬细胞,促进泡沫细胞形成,诱发动脉粥样硬化斑块的形成(29日]。通过流行病学调查和实验室研究,人们已经发现,压力已经成为最重要的因素之一,在现代社会的发展15]。是非常重要的完全探索CS导致的分子机制。本研究的主要结果是柠檬酸合成酶和OGDH基因在肾上腺组织中高度表达结合CS,和肾上腺肿大的程度更严重时这两个基因高表达。DEPs主要富含钙离子反应的生物过程,线粒体质子运输ATP合酶在细胞定位复杂,ATP酶激活的分子功能,AMPK KEGG通路中的信号通路分析。这四个浓缩方面主要是与能量代谢途径有关。这些研究结果可以作为生物标志物的诊断和治疗。此外,这两个蛋白的作用(柠檬酸合成酶和OGDH)和慢性应激的发病机理值得特别关注。
柠檬酸合成酶、柠檬酸也称为缩合酶,是能量代谢的一个重要组成部分。它催化乙酰辅酶A的反应和草酰乙酸,释放辅酶A和柠檬酸,病原反应酶参与三羧酸循环,并帮助调节乙醛酸循环(30.]。这种酶存在于几乎所有的细胞,可以进行氧化代谢。三羧酸循环中,柠檬酸合成酶活性抑制了琥珀酰辅酶而不是通过乙酰辅酶a或草酰乙酸(31日]。此外,最近的研究揭示了监管柠檬酸合成酶对其他生物过程的影响,如小鼠线粒体的呼吸商和能量消耗,人类淋巴细胞增长,某些疾病(32]。OGDH基因编码复杂2-oxoglutarate脱氢酶的亚基。OGDH-related通路包括柠檬酸循环和丙戊酸途径。基因本体论(去)注释与此相关基因包括合作伙伴绑定和氧化还原酶活动,表演的醛或oxyl团体捐赠,与二硫键受体。在三羧酸循环,这复杂的催化2-oxoglutarate的转换(α酮戊二酸)琥珀酰辅酶和有限公司2(33]。其编码的蛋白质位于线粒体基质,并使用硫胺素焦磷酸作为辅助因子(34]。因此,高表达的柠檬酸合成酶和OGDH促进三羧酸循环,加强ATP合酶复合物和ATP酶的激活,然后促进ATP生产和能量代谢。
肾上腺是人体重要的内分泌腺,分为两个部分:皮质和髓质。肾上腺束状带和网状带的主要分泌糖皮质激素(GC)、皮质醇(主要35]。GC可以通过基因组和nongenomic效果,GC受体存在于大多数组织在体内,所以他们的影响是广泛的。GC对ATP生产和能量代谢具有重要的影响,提高葡萄糖代谢。GC增加血糖主要通过减少葡萄糖利用率在组织和加速肝醣类(36]。主要途径包括以下链接:首先,提高肝内糖质新生所需酶的活性和糖原合成,使用周组织中蛋白质分解产生的氨基酸,特别是肌肉组织,加速肝醣类;第二,加强肝脏禁食期间gluconeogenic激素的响应性;第三,抑制NADH的氧化,从而减少葡萄糖糖酵解和葡萄糖的利用率减少外围组织细胞;第四,抑制胰岛素与其受体的结合,减少组织细胞对胰岛素的敏感性,减少糖的利用,外围组织,特别是肌肉和脂肪组织(37]。
GC可以参与CS的反应。当身体患有各种有害刺激,如外伤、手术、感染,感冒,立即和恐惧,腺垂体释放大量的促肾上腺皮质激素。这种迅速产生和作用于肾上腺分泌大量的GC,诱导体内非特异性防御反应(38]。GC提高葡萄糖代谢和能量代谢,这有利于帮助身体对抗压力。的基础上全面动员整体功能,是具有重要意义的提高对有害刺激身体的宽容和减少各种不良反应来维持身体的活动(39]。此外,GC参与应激分泌的调节。当身体受到压力刺激,下丘脑神经细胞的分泌功能增强,促肾上腺皮质激素释放激素的水平增加。这刺激促肾上腺皮质激素的分泌腺垂体,最终导致大量分泌促肾上腺皮质激素改善身体有害刺激的耐受性。期间增加促肾上腺皮质激素(ACTH)分泌促肾上腺皮质激素释放激素是几乎完全由(CRH)释放的下丘脑室旁核(40,41]。因此,我们推测,当身体处于CS状态很长一段时间,通过增强CRH-ACTH-GC的活动系统,中枢神经系统可显著提高ACTH分泌,完全免费的负面反馈。ACTH然后不断作用于肾上腺,激活它的功能。肾上腺就会放大,以弥补这方面,分泌更多的GC。这增加了柠檬酸合成酶的表达和OGDH,促进三羧酸循环,加强ATP合酶的激活复杂和ATP酶,和促进ATP的生成和能量代谢。因此,推测柠檬酸合成酶和OGDH基因发挥重要作用在肾上腺肿大的过程结合CS。
我们的论文不仅通过生物信息学方法进行了研究,与动物模型和实验结果也证实了这些发现,研究人员可以从中获益。
4.1。限制
尽管严格的分析大量的数据,本研究仍然有一定的局限性。以上意见仅是基于动物实验。然而,仍然有动物和人类之间的区别。目前,由于伦理问题,很难从健康的人获得正常肾上腺组织在临床实践中。因此,结果没有被临床证明的样本。此外,不执行药物干预试验进一步验证这些蛋白在人类的功能。因此,在未来的研究中,这些方面应该深入探讨。
5。结论
结合CS中扮演一个重要的角色在HPA轴,促进肾上腺肿大,增加GC的释放,并可能提高ATP合成和能量代谢体内通过柠檬酸合成酶和OGDH基因的目标。这些发现提供了一个潜在的未来研究方向相关机制的探索。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
伦理批准
所有实验动物保健和使用委员会批准实验动物科学研究所,中国医学科学院&北京协和医学院(摄像头)。所有机构和国家实验室动物保健和使用指南。
的利益冲突
所有作者声明没有利益冲突。
作者的贡献
凌兵孟进行实验和写作的主要贡献者。Ze-mou Yu参与至关重要的知识内容的修订手稿。道锣和刘De-ping作出了实质性的贡献研究概念和设计草案的研究过程。李王关于动脉粥样硬化和Meng-jie山在动物上的数据分析。Yun-qing刘和张袁梦提交手稿的主要贡献者。徐Gai-feng胡锦涛和Hong-xuan实验方法提供了技术支持。所有作者阅读和批准最终的手稿。
确认
本研究是由中国国家重点研发项目(批准号2020 yfc2003000),中国医学科学院医学科学(摄像头)创新基金(批准号2018 - i2m - 1 - 002),中国国家自然科学基金(批准号31271097和31271097)。我们感谢勇王他协助对接研究技术。
补充材料
补充1:慢性压力的详细信息的建立和评估模型。表S1:慢性应激过程。补充2:一般数据的动物体重、食物摄入量,生物化学、炎症和血液形态学。表S2:通用数据的动物。通过莱特染色图S1:血液形态学。补充3:样本量的计算。补充4:Limma DEPs调查ID的完整, , 价值,adj。值,价值,和基因的名字。5:补充蛋白质ID_gene DEPs的名字。补充6:图S2:加权coexpression网络建设。(一)样本系统树图和特质的热图。(B) eigengene系统树图可以集群17模块。(C)散点图显示,加入其他九个模块与基因的意义。图S3:模块保存分析。(一)散点图显示会员其他七个模块与基因的意义。(B) 17 coexpression模块的相互作用进行了分析与选择的基因;光颜色代表高重叠,逐步深红色表示低重叠。 Blocks of lighter colors along the diagonal represent the coexpression modules. Figure S4: enrichment analysis for the DEPs using Metascape. (A) Heatmap of enriched terms across input gene lists, colored by值。(B)丰富的网络术语表示为饼图,图表的颜色基于基因的身份列表。(C)丰富上彩色的网络集群ID,在节点共享相同的集群ID通常是接近对方。(D)丰富的网络方面的值,包含更多基因往往更重要价值。(E)使用DisGeNET浓缩的总结分析。(F)使用PaGenBase浓缩的总结分析。(补充材料)