文摘

破坏血脑屏障(BBB)是一种常见的和重要病理蛛网膜下腔出血(SAH)后。我们调查了BBB破坏财产的分泌蛋白质酸性和富含半胱氨酸SAH后(SPARC)。总共197只老鼠接受血管内穿孔诱导SAH或虚假的操作。小干扰核糖核酸(siRNA) SPARC或炒siRNA intracerebroventricularly接种大鼠SAH前48 h。Anti-SPARC单克隆抗体(mAb) 236功能性阻塞或正常小鼠免疫球蛋白G(免疫球蛋白)管理intracerebroventricularly SAH后1 h。选择性整合素αVβ3抑制剂三轮车(-RGDfK)或磷酸盐是鼻内接种1 h SAH之前,随着重组SPARC治疗。Neurobehavior SAH严重性,脑水肿,免疫组织化学染色和免疫印迹进行评估。SPARC和整合素的表达αVβ三是调节SAH后内皮细胞。SPARC siRNA anti-SPARC马伯236阻止neuroimpairments通过保护BBB和脑水肿以免疫球蛋白溢出SAH后24和72 h。重组SPARC加剧neuroimpairments和三轮车(-RGDfK)通过抑制抑制有害影响神经系统激活c-Jun n端激酶,p38和矩阵metalloproteinase-9内皮连接蛋白质的保留紧随其后。通过整合素SPARC可能诱发post-SAH BBB破坏αVβ3信号通路。

1。介绍

动脉瘤性蛛网膜下腔出血(SAH)是一种严重危及生命的脑血管疾病引起的破裂颅内动脉瘤(1- - - - - -3]。动脉瘤破裂后,动脉血液传播到蛛网膜下腔导致严重的脑损伤。这种脑损伤引起的血液成分,他们的二次产品,所引起的组织损伤,机械应力引起的颅内压的快速高度(4- - - - - -7]。已报告许多次要产品引起的组织损伤导致的内皮连接形成血脑屏障(BBB),导致vasogenic水肿(这是脑损伤的主要原因和死亡的一个独立危险因素和SAH后的不良预后显著4,8])。此外,增强BBB通透性使免疫分子迁移进入脑实质,进一步传播脑损伤(9]。因此,BBB破坏是一个需要解决的难题,为了在SAH改善临床结果。事实上,许多论文表明,治疗方案保护内皮连接蛋白质保护BBB可能是有益的在改善神经功能在实验SAH模型(10]。然而,post-SAH BBB破坏的分子机制仍不清楚。

分泌蛋白的酸性和富含半胱氨酸(SPARC),也被称为骨粘连蛋白和基底膜40,是一种matricellular蛋白质(兆赫)。SPARC是一个次要产品诱导损伤和发挥不同功能的蛋白表达水平很低在稳态条件,和淘汰赛兆赫在老鼠身上进行正常发展(11,12]。SPARC可能参与急性期的BBB破坏SAH虽然从未调查post-SAH脑损伤包括BBB破坏。SPARC的水平升高在微血管血管和星形胶质细胞在中枢神经系统损伤位点13- - - - - -15]。体外研究表明,暴露在SPARC血管渗透性增加和减少的表达紧密连接标志,zonula occludens(佐薇)1,和occludin13]。

整合蛋白是细胞粘附受体超家族,识别主要ecm和细胞表面配体组成的 和 子单元形成24已知组合(16]。整合素家族,整合素αVβ3位于内皮细胞(17]和承认SPARC,涉及增殖激活下游信号蛋白激酶(MAPKs),促炎介质如白细胞介素(ILs)和基质金属蛋白酶(MMP) 916- - - - - -24),尽管先前的研究从未调查整合素αVβ3在SAH信号通路。MMP-9是导致SAH BBB破坏蛋白水解酶(4]。此外,整合素激活αVβ3诱发ZO-1 occludin内化,破坏血管内皮(VE)钙粘着蛋白定位,并增加表达MMP-9 [25]。因此,post-SAH SPARC感应可能会扰乱BBB通过MAPKs / MMP-9信号通路。因此,本研究的目的是调查如果SPARC施加BBB破坏post-SAH如果SPARC信号包括整合素αVβ3和下游分子MAPKs。

2。材料和方法

制度动物保健和使用委员会(IACUC) Loma Linda大学(LLU)批准了研究协议(8170018),按照美国国立卫生研究院和所有实验动物的使用指南在神经科学研究以及到达的指导方针。所有作者都阅读和批准提交的手稿。

2.1。动物模型

12个Sprague-Dawley雄性老鼠(体重300 - 320克)被用于生产SAH模型血管内穿孔如前所述[5]。短暂,每个大鼠深麻醉下插管和3%异氟烷,由机械通气和呼吸率77 /分钟的持续时间手术。暴露后左边常见,外部和内部颈动脉,一个尖锐的4 - 0单丝尼龙缝线是先进的吻侧进入左颈内动脉的颈外动脉树桩的分岔穿孔前,大脑中动脉。Sham-operated老鼠接受了相同的程序,除了没有刺穿动脉缝合被撤回。我们监控灵感峰值压力和压力控制呼吸机呼吸速率,心率、皮肤色素沉着,踏板反射(公司脚趾捏)操作。这些要害监控每5分钟,确保动物没有遇险,应对相应的麻醉和手术。体温是由一个加热垫保持不变37°C到动物恢复。所有的老鼠被随机分配到下列实验团体(额外的文件1:图描述S1)。选择的时间点是基于前面的研究,据报道,post-SAH BBB破坏峰值在24 h和逆转了48 - 72 h实验SAH后(23,26]。在目前的研究中,大脑含水量测量在24和72 h参与,和免疫印迹(WB),除了实验1,免疫组织化学染色在24小时在所有时间均进行了实验。

2.2。研究协议
2.2.1。实验1

确定的时间进程和细胞定位内生SPARC和整合素αVβ3表达,40老鼠被随机划分和分配到六组:虚假和SAH 3、6、12、24和72 h组。死亡率和SAH严重程度进行评估后,世行样本分析了左半球( 每组)。同时,SPARC和整合素的双重免疫组织化学染色αVβ3与星形胶质细胞和脑内皮细胞进行虚假和建模(SAH小组24小时后 每组)。

2.2.2。实验2.1

评估的影响可拆卸的SPARC的post-SAH BBB破坏在24 h, 48个老鼠被随机划分和分配给四个组:虚假的( ),长官( ),SAH +炒小干扰核糖核酸(可控硅核;500 pmol; ),和SAH + SPARC核(500 pmol; )组。负控制可控硅核(位于马里兰州Rockville SR30004、OriGene技术)和SPARC核(200133年,热费希尔科学Inc .,沃尔瑟姆,MA)是管理intracerebroventricularly (i.c.v)前48 h建模。死亡率、神经分数,SAH严重性,脑含水量(公约; 每组),免疫组织化学染色( 每组)和世界银行( 每组)进行评估后24 h建模。

2.2.3。实验2.2

评估的影响可拆卸的SPARC的结果在72 h, 18老鼠被随机划分,分为三组:骗局,SAH +可控硅siRNA, SAH + SPARC核(500 pmol)组( 每组)。负控制可控硅核和SPARC siRNA管理i.c。v前48 h SAH归纳。死亡率、神经评分、SAH严重性和脑水含量在72 h后评估建模。

2.2.4。实验3

确认的参与内源性SPARC post-SAH BBB破坏,30老鼠被随机分配到三组:骗局,SAH +正常小鼠免疫球蛋白G(免疫球蛋白;0.3μg), SAH + SPARC单克隆抗体(mAb) 236 (0.3μg)组( 每组)。负控制正常小鼠免疫球蛋白(12 - 371,EMD微孔Inc .泰梅库拉,CA)和功能性抑制性抗体SPARC马伯236 (AB_2617208,杂种细胞发育研究银行,爱荷华州的城市,IA)是管理i.c。v 1 h SAH后归纳。后死亡率、神经学分数和SAH严重性评估,脑水含量( 每组)和免疫组织化学染色( 每组)进行评估后24 h建模。

2.2.5。实验4

调查的影响外生SPARC和整合素的参与αVβ3在BBB破坏,30老鼠被随机分配到五组:假+磷酸盐(PBS),假+重组人类SPARC (rSPARC;0.3μg),长官+ PBS, SAH + rSPARC, SAH + rSPARC +三轮车(-RGDfK) (cRGD;2.0μg)组( 每组)。rSPARC (941 - sp,研发系统公司,明尼阿波利斯,MN)是管理i.c。v 1 h建模后,选择性整合素αVβ3抑制剂cRGD (S7834 Selleckchem Inc .,休斯顿,德克萨斯州)鼻内接种1 h在SAH归纳。后死亡率、神经学分数和SAH严重性评估,世行样本分析了左半球后24 h建模。

2.3。SAH严重性和排除标准

SAH的严重性是盲目地评估每个实验动物牺牲(如前所述)(5,27]。短暂,基底池分为6段,每段分配一个从0到3年级根据SAH的数量。老鼠接受了总分从0到18通过添加分数从所有6段。在分析,轻微的长官( )老鼠被排除在外,因为轻微的长官没有诱导神经障碍(5]。

2.4。Intracerebroventricular输液

一个i.c。如前所述(执行v输液5]。简单地说,老鼠被放置在一个立体定位器在2 - 2.5%异氟烷麻醉。10的针μl汉密尔顿注射器(汉密尔顿公司Inc .,雷诺,NV)是通过磨孔插入正确的使用以下坐标相对于侧脑室前囱:0.9毫米后,1.5毫米侧,3.3毫米低于前囱的水平面。药物和核融合的速度是1μl / min。针被i.c后5分钟。v输液,我们很快用骨蜡封住骷髅洞,然后,缝合切口的网站。核的用量是决定基于我们之前体内报告(5]。负控制可控硅核和SPARC siRNA准备100 pmol /浓度μl核糖核酸酶自由再悬浮缓冲。5的总量μl核注射前48 h SAH归纳。SPARC马伯236产生函数阻塞影响行动的舍入(抑制扩散)SPARC在内皮细胞的活动28]。SPARC马伯的用量236年的决定是基于前一个体外报告(28]。在这项研究中,1μ236 g / ml SPARC马伯显著抑制了SPARC内皮细胞的粘附。SPARC马伯的用量236决心实现等效浓度为1μg / ml在大鼠脑脊液(CSF)中,是谁的CSF总额为300μl (29日),确定为0.3μg。SPARC马伯236和正常小鼠免疫球蛋白浓度的41就做好了准备μ在PBS g / ml,总量为7.3μl SPARC马伯236和正常小鼠免疫球蛋白输注1 h SAH后归纳。rSPARC的用量是决定基于先前的体外研究[13]。在这项研究中,1μg / ml rSPARC显著降低紧密连接标记ZO-1 occludin在人类脑微血管内皮细胞培养。实现一个等价的脑脊液浓度老鼠,0.3 rSPARC决心的剂量μg。

2.5。鼻内管理

鼻内政府进行了如前所述[5]。简单地说,老鼠被放置在一个仰卧位低于2%异氟烷麻醉。总体积为2.0μg cRGD溶解在4μl PBS和管理进入左鼻孔前1 h建模。cRGD分子量为717.69,C的分子式27H41N9O7,它可以穿过BBB [30.]。cRGD用量的确定是基于前一个体外报告(31日]。在这项研究中,浓度为1.33 nmol / l cRGD显示,50%抑制信号(IC50值)的抑制vitronectin与整合素结合αVβ3所示。的浓度要高10倍IC50值cRGD初步选定在这个研究。达到同等浓度的老鼠,体液总量被默认为210毫升(体重的70%)32),2.0 cRGD决心的剂量μg。

2.6。神经行为测试

神经损伤是盲目地评估使用修改后的加西亚的神经评分和梁平衡评分系统(如前所述)(5]。简要评价包括6类(自发活动,自发的四肢运动,前掌伸出,攀登,身体本体感受,并须刺激),可以得分0到3或1 - 3。神经得分是由添加6分数得到最后得分3是最坏的和18,最好的(额外的文件1:图S2的平均得分)。3连续试验5分钟间隔计算。一束平衡试验研究动物的行走能力在一个狭窄的木梁为60秒,我们盲目地标志着一个年级从0到4点如下:4分,走≥20厘米;3点,走< 20厘米;2点,走路但下降;1点,而不是走在剩余的梁;和0点,不走(附加文件1:图下降S2b)。3连续试验的平均得分在5分钟内计算。

2.7。脑水含量

脑水肿是决定使用干/湿方法如前所述[5]。牺牲后,大鼠深麻醉下,大脑很快被删除,分为4段(左和右大脑半球、小脑和脑干),并立即重湿重。大脑标本在烤箱干在105°C 72 h,重又干重。每个样品的含水量是按照下列公式计算: 。

2.8。免疫荧光染色

如前所述(执行一个免疫荧光染色5]。深麻醉下,老鼠被transcardial灌注与牺牲100毫升PBS其次是2分钟10%中性缓冲福尔马林。大脑在10%的中性缓冲福尔马林固定24小时在4°C之后,30%的蔗糖溶液72 h。−80°C被冻结后,大脑被切成10μ米厚的日冕部分在前囱1.0毫米后使用低温恒温器(LM3050S;班诺克本,三世,德国徕卡微系统)。幻灯片洗了0.01的PBS三次10分钟然后孵化Triton x - 100 0.3% 0.01 PBS在室温下30分钟。用10%的驴被屏蔽后血清在0.01 M的PBS 1 h在室温下,一夜之间被孵化在4°C的部分与主抗体如下:山羊antiglial原纤维酸性蛋白(GFAP;1:500;ab104224 Abcam Inc .,剑桥,MA),鼠标anti-von血友病因子(vWF;1:400;sc - 365712,圣克鲁斯生物技术公司,达拉斯,TX)、兔anti-SPARC (1: 500;nbp1 - 80972,罗福斯生物制品有限公司有限公司),“兔子anti-integrinαVβ3 (1):50;SC56-07罗福斯生物制品有限公司,有限公司),“兔子antiphosphorylated c-Jun n端激酶(p-JNK;1:100;ab131499 Abcam Inc .,剑桥,MA),兔子antiphosphorylated p38 (p-p38;1:400;9211年,细胞信号技术公司,丹弗斯,马)。然后,0.01米的部分被洗PBS和孵化适当fluorescence-conjugated二级抗体(1:200;杰克逊ImmunoResearch Inc .)、西树林,PA)在室温下1 h。幻灯片是荧光显微镜下观察和拍摄(DMi8;德国徕卡微系统有限公司; ×20). The densitometric analysis of p-JNK and p-p38 was performed using Image Pro Plus 6.0 software (Media Cybernetics Inc., Rockville, MD) in the 4 continuous pictures of the left (perforation side) temporal cortex based on our previous study [4]。

2.9。免疫组织化学染色的免疫球蛋白G(免疫球蛋白)

免疫组织化学染色的免疫球蛋白进行评估BBB通透性使用商用设备(Vectastain ABC过氧化物酶设备;pk - 4004、向量实验室、伯林盖姆,CA)。日冕的大脑部分准备以同样的方式作为免疫荧光染色。0.01 M的PBS三次清洗后10分钟,幻灯片孵化在PBS Triton x - 100 0.01 0.3%在室温下30分钟。孵化后在3%过氧化氢(H2O2)20分钟淬火任何内源性过氧化物酶的活动,10%正常兔血清的部分被封锁在0.01 M的PBS 1 h在室温下之后,一夜之间在4°C孵化与生物素化的兔子anti-rat多克隆免疫球蛋白和1 h在室温下孵化avidin-biotin-horseradish过氧化物酶复杂。颜色反应是在diaminobenzidine开发/ H2O2解决方案,和部分轻与苏木精复染色。评估的免疫球蛋白外渗量4连续左颞叶皮层的照片拍摄在光学显微镜(×20),和相对数量,免疫球蛋白是由图像计算专业+ 6.0软件(位于马里兰州Rockville媒体控制论Inc .)。左边的选择(穿孔)颞叶皮层是基于我们之前的研究(4]。

2.10。免疫印迹

左侧大脑半球分离和利用。等量的蛋白质样品(30μg)加载在sds - page凝胶电泳,转移到一个聚乙二烯二氟化物膜。5%牛血清白蛋白的膜被封锁在0.01 M的PBS 2 h在室温下后跟孵化一夜之间在4°C以下抗体:兔子anti-SPARC (1: 2000;nbp1 - 80972,罗福斯生物制品有限公司有限公司),“兔子anti-integrinαVβ3 (1:1000;SC56-07罗福斯生物制品有限公司,有限公司),“鼠标反β肌动蛋白(1:5000;sc - 47778,圣克鲁斯生物技术公司,达拉斯,TX)、兔anti-p-JNK (1: 1000;ab131499 Abcam Inc .,剑桥,英国),鼠标anti-JNK (1: 5000;66210 - 1 - ig Proteintech Group Inc .)、Rosemont, IL)、兔anti-p-p38 (1: 1000;9211年,细胞信号技术Inc .,丹弗斯马),兔子anti-p38 (1: 1000;9212年,细胞信号技术Inc .,丹弗斯马),兔子anti-IL-6 (1: 1000;PR627热费希尔科学公司,沃尔瑟姆,MA)、兔anti-MMP-9 (1: 1000;ab182734 Abcam Inc .,剑桥,英国),兔子anti-ZO-1 (1: 1000;61 - 7300年,热费希尔科学公司,沃尔瑟姆,MA),兔子anti-VE-cadherin抗体(1:1000;ab33168 Abcam Inc .,英国剑桥)。 On the following day, the membranes were incubated with the appropriate secondary antibody (1 : 5000; sc-516102, Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, and 1 : 5000; 12-348, MilliPore sigma Inc., Temecura, CA) at room temperature for 2 h. Immunoreactive bands were detected with a chemiluminescence reagent kit (ECL Prime; Amersham Biosciences Inc., Arlington Heights, IL) and quantified by densitometry with Image J software (NIH, Bethesda, MD).

2.11。统计分析

神经系统评分和SAH年级被表示为 紧随其后,相比之下,克鲁斯卡尔-沃利斯测试Steel-Dwass多重比较。脑水含量,免疫球蛋白免疫组织化学染色,世行结果表示为 并与单向方差分析比较(方差分析)其次是Tukey-Kramer事后测试。统计分析使用SPSS 23.0版(IBM、东京、日本)。的值 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。一般的观察

比较生理参数显示各组之间无显著差异(数据没有显示)。总共197只老鼠接受血管内穿孔诱导SAH或虚假的操作。死亡率0 sham-operated 54(0%)的老鼠,它是147年16(11%)在SAH-operated老鼠总在观察期间在所有实验。总共15个老鼠不习惯的分析,因为温和(≤7)SAH年级(额外的文件1:图S3)。没有显著差异在SAH年级所有SAH组在SAH后24 h(附加文件1:图S3b, c)。脑水含量,免疫球蛋白免疫染色,世行结果正态分布和方差齐性。

3.2。SPARC的时间进程和空间表达和整合素αVβSAH后3

世行的结果表明,表达SPARC达到12 h SAH后感应,高程是延长至少直到72 h相比,虚假的组(图1(一))。相比之下,整合素的表达αVβ从6 h 3显著升高到至少72 h的峰值在24 h SAH归纳。双重免疫荧光染色法显示,SPARC在星形胶质细胞和内皮细胞表达大脑皮层骗局和SAH组24小时从建模、和整合素αVβ3在内皮细胞表达24 h post-SAH(图1 (b))。

(一)
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(b)
(b)
图1
表达的内源性分泌蛋白质酸性和富含半胱氨酸(SPARC)和整合素αVβ3所示。(一)代表免疫印迹图像和密度测量量化时间SPARC和整合素的表达αVβ蛛网膜下腔出血(SAH)后3。每个蛋白质的表达水平除以的水平β肌动蛋白和表示为一个比平均水平的虚假的归一化模型( ; 每组)。 和 与虚假的组。(b) Colocalization SPARC(绿色)和整合素αVβ3(绿色)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP);红色)或血管性血友病因子(vWF;红色)在大脑皮层左颞后24 h建模。核与DAPI染色(蓝色)。插图强调更高的SPARC和整合素放大图像αVβ3与GFAP和vWF(箭头)。 ( 每组)。
3.3。击倒的SPARC抑制神经障碍、脑水肿,BBB SAH后渗透率

的沉默疗效SPARC核验证由世行和免疫荧光染色后,在左侧大脑半球在72 h核注入(额外的文件1:图S4a、b)。SPARC核注射后,post-SAH加重神经评分显著降低修改加西亚和梁的平衡测试,虽然可控硅siRNA没有SAH后(图产生影响2(一个))。此外,脑含水量在左侧大脑半球24小时post-SAH SAH + SPARC siRNA显著提高,而可控硅siRNA政府SAH后对脑含水量无显著影响(图2 (b))。免疫组织化学染色的免疫球蛋白进行评估的严重性BBB破坏在左侧大脑皮层SAH后24 h(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。SAH +可控硅siRNA集团导致显著增加免疫球蛋白溢出24 h post-SAH,显著抑制在SAH + SPARC核组(图3 (e))。在72 h, SPARC siRNA还抑制post-SAH加重神经评分修改加西亚的测试和脑水肿在左侧大脑半球、小脑与可控硅核(图4)。

(一)
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(b)
(b)
图2
影响的可拆卸的分泌蛋白质酸性和富含半胱氨酸(SPARC)对神经行为功能和脑水肿后24 h建模。(一)SPARC小干扰核糖核酸(siRNA)提高修改加西亚的进球和梁平衡蛛网膜下腔出血(SAH)后得分。数据表示为 ( 每组)。 和 。(b) SPARC siRNA治疗SAH后改善脑水含量。数据表示为 ( 每组)。 和 。可控硅siRNA:炒核。
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图3
分泌蛋白的酸性和富含半胱氨酸(SPARC)小干扰核糖核酸(siRNA)在24 h后血脑屏障通透性建模。(一)代表大脑切片显示染色(小盒子)的位置在左颞叶皮层在前囱1.0毫米后。(罪犯)代表的免疫球蛋白G(免疫球蛋白)免疫组织化学染色sham-operated老鼠(b),蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠治疗的小干扰rna(可控硅siRNA) (c)、炒小干扰rna (d)和大鼠SAH SPARC对待。插图强调更高放大图像的内皮细胞(箭头)。(e)集成光密度的免疫球蛋白g的总和。数据表示为 ( 每组)。 。
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(b)
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图4
影响的可拆卸的分泌蛋白质酸性和富含半胱氨酸(SPARC)对神经行为功能和脑水肿在72 h建模。(一)SPARC小干扰核糖核酸(siRNA)提高修改加西亚蛛网膜下腔出血(SAH)后的分数。数据表示为 ( 每组)。 和 。(b) SPARC siRNA治疗SAH后改善脑水含量。数据表示为 ( 每组)。 和 。可控硅siRNA:炒核。
3.4。内源性SPARC可能加剧Post-SAH神经赤字和BBB破坏通过MAPKs p-JNK p-p38

SPARC马伯236改善神经分数和脑水肿的左半球,而负控制正常小鼠免疫球蛋白SAH后(数字5(一个)和5 (b))。免疫球蛋白的免疫组织化学染色显示,SPARC马伯236政府导致显著抑制免疫球蛋白溢出24小时post-SAH与正常小鼠免疫球蛋白(数字6(一)- - - - - -6 (d))。两个主要的表达MAPKs p-JNK和p-p38内皮细胞被双重免疫荧光染色法进行评估。与正常小鼠免疫球蛋白治疗SAH的老鼠显示p-JNK upregulation和p-p38而SPARC马伯236治疗抑制p-JNK和p-p38内皮细胞的表达。p-JNK-positive细胞和p-p38-positive细胞的微密度明显高于SAH感应后,显著抑制的SPARC马伯236政府(数据6 (e)和6 (f))。

(一)
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图5
功能性阻塞效应对分泌蛋白质酸性和富含半胱氨酸(SPARC)对神经行为功能和脑水肿后24 h建模。(a) SPARC单克隆抗体(mAb) 236提高修改加西亚的进球和梁平衡蛛网膜下腔出血(SAH)后得分。数据表示为 ( 每组)。 和 。236 (b) SPARC马伯治疗SAH后改善脑水含量。数据表示为 ( 每组)。 和 。免疫球蛋白:免疫球蛋白G。
(一)
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图6
功能性阻塞效应对分泌蛋白质酸性和富含半胱氨酸(SPARC)血脑屏障通透性和表达的磷酸化c-Jun n端激酶(p-JNK)和磷酸化p38 (p-p38)在内皮细胞后24 h建模。(a - c)代表免疫组织化学染色的免疫球蛋白G(免疫球蛋白)在左颞叶皮层在1.0毫米后的前囱sham-operated老鼠(a),蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠与正常小鼠免疫球蛋白治疗(b),以及大鼠治疗SAH SPARC单克隆抗体(mAb) 236 (c)。插图强调更高放大图像的内皮细胞(箭头)。(d)集成光密度的免疫球蛋白g的总和。数据表示为 ( 每组)。 。免疫组织化学染色(e, f)代表p-JNK(绿色(e)和p-p38(绿色(f))在左颞叶皮层,前囱1.0毫米后,光密度分析p-JNK-positive细胞(e)和p-p38-positive细胞(f)。核与DAPI染色(蓝色)。插图强调更高放大图像的血管性血友病因子(vWF)阳性细胞(箭头)。 。数据表示为 ( 每组)。 和 。
3.5。整合素αVβ3 / MAPK信号通路可能做出更大的贡献在SAH后SPARC-Mediated BBB破坏

rSPARC并不影响神经系统评分sham-operated老鼠。然而,rSPARC治疗显著加重神经分数post-SAH老鼠与PBS。选择性整合素αVβ3抑制剂cRGD显著降低post-SAH有害神经的影响rSPARC(图7(一))。世行分析也表明,rSPARC对整合素的表达产生影响αVβ3和sham-operated老鼠的细胞内下游介质。相比之下,post-SAH rSPARC政府加强整合素的表达αVβ3、p-p38和活跃MMP-9和减少的表达紧密连接标志ZO-1而PBS。cRGD的保护作用显著抑制post-SAH激活MAPKs包括p-p38和p-JNK,促炎介质il - 6, MMP-9其次是保留adherens结的蛋白质和内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1 VE-cadherin(图7 (b))。

(一)
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(b)
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图7
影响重组蛋白分泌的酸性和富含半胱氨酸(rSPARC)和一个整合素αVβ3抑制剂后24 h建模。(一)rSPARC加剧修改加西亚的进球和整合素的抑制αVβ3抑制的影响rSPARC SAH后( 每组)。 和 。(b)代表免疫印迹图像和密度测量的量化表达磷酸化p46和意味着c-Jun n端激酶(p-JNK)磷酸化p38 (p-p38)、白介素6 (IL),专业和积极的基质金属蛋白酶(MMP) 9日ZO-1,血管内皮钙粘蛋白(VE)。代表西方墨迹来自相同的样本,但多个膜。每个蛋白质表达水平的评估β作为内部控制:肌动蛋白水平表达目标蛋白质/β肌动蛋白、p-p38 / p38或p-JNK /物,比平均水平的假+ PBS组正常化,因为p38和物是不变的水平组( ; 每组)。 和 与假+磷酸盐(PBS),__ 和‡ 与假+ rSPARC,§ 和 与长官+ PBS,# 和# # 与长官+ rSPARC。cRGD:三轮车(-RGDfK):整合素αVβ3抑制剂。

4所示。讨论

这部小说在本研究发现如下:(1)SPARC和整合素的表达αVβ三是调节血管内穿孔SAH老鼠;(2)击倒SPARC和功能性阻塞对内源性SPARC阻止神经障碍通过保护BBB SAH后以免疫球蛋白外渗;(3)外源性SPARC加剧SAH后神经行为障碍,和整合素αVβ3抑制剂抑制有害通过抑制神经的影响SPARC两MAPKs物和p38 MMP-9保留ZO-1和VE-cadherin紧随其后。

post-SAH SPARC和整合素αVβ3水平从来没有确定,同时整合素的表达αVβ3在实验性缺血性中风后微血管明显增加2 h卒中后在成人狒狒(33]。目前的研究表明,SPARC和整合素的表达αVβ三是调节在12 h,因此,SPARC和整合素αVβ3信号通路可能参与SAH后急性期脑损伤。体外研究表明,促炎细胞因子肿瘤坏死因子(TNF),α增加SPARC表达脑内皮(13]。相比之下,SPARC击倒降低TNF的表达α和il - 6和保护血管内皮细胞损伤34]。此外,SPARC是由基质金属蛋白酶(35),而SPARC已被证明诱导基质金属蛋白酶的生产和活动36- - - - - -38]。SPARC与TNF -交互α和基质金属蛋白酶可能放大彼此的表达水平在急性期。

体外研究表明,SPARC transendothelial白蛋白增加通量浓度剂量依赖性的方式。以固定剂量,长时间曝光引起白蛋白通量,被anti-SPARC抗体(39]。戈德布卢姆et al。39)表明,SPARC促进内皮细胞单层膜屏障功能障碍。耕作等。40]表明,增加SPARC抑制胶原蛋白IV-mediated transendothelial电阻(te)的低te脑毛细血管内皮细胞。t值是一个被广泛接受的技术来测量紧密连接的完整性包括BBB [41]。这些研究的结果表明,增加SPARC内皮的通透性。然而,SPARC在出血性中风的影响知之甚少。目前的研究表明,内生SPARC在反应性星形胶质细胞和毛细血管内皮细胞诱导的急性期SAH,立即治疗阻止内生SPARC施加BBB保护效应在SAH外生SPARC施加进一步的有害影响神经系统。这些结果表明,SPARC加剧post-SAH BBB破坏急性期。

BBB主要由化学和结构形成的屏障内皮junction-associated蛋白质,如ZO-1 VE-cadherin,基板,外膜细胞,一个病患血管周的end-feet [18,42,43]。junction-associated蛋白质退化打开内皮和信息枢纽和BBB通透性增加18,44]。蛋白水解酶MMP-9一再报道导致post-SAH BBB破坏降解脑微血管基底膜和内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1 adherens结蛋白VE-cadherin [45- - - - - -50]。MMP的家庭中,MMP-2也对蛋白水解的影响内皮细胞只实验性缺血性中风后几个小时内,虽然其他研究显示没有明显增加MMP-2表达式(45]。然而,MMP-2活动并没有改变在灯丝穿孔SAH后大脑,而MMP-9活动是调节在我们之前的研究中使用zymography [51]。因此,本研究关注的参与SPARC-induced MMP-9 SAH后感应。兆赫SPARC以外也有有益的或有害的影响通过MMP-9 BBB在SAH [18,24,42,46,49,52]。我们最近的研究表明,三种兆赫,tenascin-C, periostin,和galectin-3诱导,使BBB破坏SAH后通过MAPK-mediated激活MMP-9和后续ZO-1退化在老鼠脑毛细血管内皮细胞18,42,46,52]。相比之下,另一个MCP骨桥蛋白在反应性星形胶质细胞和毛细血管内皮细胞诱导,阻止MMP-9激活和BBB破坏灭活MAPK和核因子-κB (49,53]。MAPK激活移植促炎细胞因子如TNF -α,il - 1βil - 6, MMP-9在SAH [45,54,55],MAPK抑制剂已报道保护BBB完整性和失活(差别MMP-9对这些56]。目前的研究表明,外生SPARC紧密连接蛋白的表达减少ZO-1通过激活p38 MAPK然后MMP-9 SAH后。相比之下,整合素αVβ3抑制剂抑制有害神经的影响外生SPARC通过抑制两种形式的MAPKs物和p38然后MMP-9保留ZO-1和VE-cadherin紧随其后。因此,BBB破坏引起的SPARC感应SAH后可能取决于整合素αVβ3 / MAPK信号通路。

有几个限制在这项研究中,需要注意。首先,SPARC信号通路,诱导post-SAH BBB破坏并不是完全嘲笑,部分是由于其他受体,兆赫,生长因子,细胞因子有高亲和力与SPARC [21]。此外,其他下游介质除了MAPKs没有检查在这项研究。一项研究表明,SPARC counteradhesive属性,导致舍入的内皮细胞,内皮细胞扩散的抑制,失去焦点粘连通过tyrosine-kinase-dependent通路(57]。因此,此种SPARC和下游信号通路影响post-SAH BBB破坏在未来应该检查。第二,我们不能排除这种可能性,SPARC核和SPARC马伯236灭活其他神经受体引起neuroregulatory分子参与BBB破坏和神经损伤而不是SPARC。第三,只有i.c。v SPARC siRNA治疗SAH和SPARC马伯236 1小时之前SAH后检测SPARC失活的影响在本研究中。脑脊液引流是经常放置在严重的SAH患者促进SAH间隙或控制急性脑积水,i.c.v.注入本研究可以应用于临床设置。为了更转化,然而,多种治疗的影响在不同的剂量和时间课程和更简单的运送路线如静脉注射之前应该测试未来的临床试验。第四,内源性配体激活整合素αVβ3除了SPARC没有在本研究调查。例如,血管内皮生长因子,已知的诱导物αVβ3整合素的表达,也是调节SAH后导致post-SAH BBB破坏(21,25,58]。还需要进一步的研究来确定是否SAH后发布的其他因素刺激加强整合素的活化αVβ3所示。第五,我们SAH严重性评估使用评分分数除了神经行为测试。我们先前的研究一再表明,脑损伤的严重程度与SAH线性相关评分分数至少在SAH的急性期(5,59]。然而,这将是有用的演示实验依据成功SAH模型与统一的脑损伤。此外,我们没有监控小干扰rna和SPARC马伯的组织分布及其对脑血流(CBF)的影响和其他生理参数从术后安乐死。CBF和生理参数的影响在急性期脑损伤SAH [60]。我们最好的知识,尽管SPARC尚未报道影响CBF,血压,和其他生理参数,这将是值得研究。最后,验证影响其他动物群体的不同年龄、性别、遗传背景主题是解决未来[61]。尽管额外的实验需要执行在未来解决这些局限性,目前的研究是很重要的对BBB小说提供了一个潜在的分子目标SPARC SAH后中断。

5。结论

这项研究第一次证明堵塞内生SPARC阻止post-SAH BBB破坏至少通过整合素的抑制αVβ3 / MAPKs MMP-9信号通路在老鼠。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

确认

作者承认提供的技术援助Desislava Doycheva,杰瑞·弗洛雷斯,戈Gamdzyk,海伦·黄和Prativa Sherchan。本文支持部分由美国国立卫生研究院的资助(批准号NS081740和NS082184)博士。

补充材料

图S1:实验设计和动物群体。公约:脑含水量;cRGD:三轮车(-RGDfK):整合素αVβ3抑制剂;免疫球蛋白:免疫球蛋白G;包含IHC:免疫组织化学;马伯:单克隆抗体;PBS:磷酸盐;SPARC:分泌蛋白酸性富含半胱氨酸;rSPARC: SPARC重组;长官:蛛网膜下腔出血;核:小干扰核糖核酸;可控硅siRNA:炒核; WB: Western blot. Figure S2: neurobehavioral tests. (a) Modified Garcia’s score. (b) Beam balance test. Figure S3: mortality and subarachnoid hemorrhage (SAH) grade. (a) Animal usage and mortality of all experiment groups. (b) Representative basal image of brain in animal models. (c) SAH grade scores of all groups. Data are expressed as 。cRGD:三轮车(-RGDfK):整合素αVβ3抑制剂;免疫球蛋白:免疫球蛋白G;马伯:单克隆抗体;PBS:磷酸盐;核:小干扰核糖核酸;可控硅siRNA:炒核;SPARC:分泌蛋白酸性富含半胱氨酸;rSPARC: SPARC重组。图S4:酸性分泌蛋白的可拆卸的效率和富含半胱氨酸(SPARC)小干扰核糖核酸(siRNA)蛛网膜下腔出血(SAH)后24 h归纳。(一)代表免疫印迹图像和SPARC的光密度的量化表达式。 Expression levels of SPARC are divided by the levels ofβ肌动蛋白和表示为一个比平均水平的虚假的归一化模型( ; 每组)。 。免疫组织化学染色(b)代表SPARC在左颞叶皮层前囱1.0毫米后。核与DAPI染色(蓝色)。 ( 每组)。(补充材料)