NP细胞程序性死亡引起的线粒体ROS在致命一击加载椎间盘退化器官培养模型

文摘

越来越多的证据表明,线粒体活性氧(ROS)在机械压力诱导扮演关键角色腰椎退行性椎间盘疾病(DDD)。然而,详细的基本病理机制需要进一步调查。在这项研究中,我们利用一个致命一击加载椎间盘退化器官培养模型,探讨椎间盘的反应(试管)机械应力。试管受到40%的应变盘高度一秒然后生理载荷作用下培养。Mitoquinone甲磺酸(MitoQ)或其他抑制剂注入试管。只试管受到生理负荷文化被用作控制。线粒体膜电位明显抑郁后立即机械应力( )。ROS-positive细胞的百分比显著增加后的头12个小时,机械应力,然后由48小时下降到一个低水平。预处理与MitoQ或鱼藤酮显著下降的比例ROS-positive细胞( )。髓核(NP)细胞生存能力急剧减少机械应力在12小时后,48小时内达到一个稳定状态。虽然necroptosis的水平——apoptosis-related标记显著增加机械应力在12小时后,没有观察到显著变化在第七天。预处理与MitoQ NP细胞生存能力和缓解标记的变化增加了机械应力后12小时。线粒体活性氧水平升高也与细胞外基质(ECM)退化迹象,包括分解upregulation标志、合成代谢,差别标志对这些增加粘多糖(GAG)损失,试管动态抗压刚度减少,和形态退化变化在早期机械应力后时间点。预处理MitoQ缓解一些退行性变化的机械应力后12小时。这些变化被第七天了。综上所述,我们的研究结果表明,线粒体ROS作为重要的监管机构NP细胞程序性死亡在试管和ECM变性早期机械应力后时间点。

1。介绍

退行性椎间盘疾病(DDD)是一种慢性脊髓疾病的特点是结构失效的椎间盘(试管),蛋白水解活性增加,髓核细胞死亡(NP)和促炎细胞因子释放1,2]。腰椎DDD是最常见的一种慢性退化性疾病。它影响百分之四十的人年龄在40年,影响超过80岁人口的百分之八十,有近百分之二十的人腰DDD显示一个贫穷的响应非手术治疗(3]。因此,迫切需要有一个深入了解潜在的分子机制负责DDD为了更好的管理。

Nonphysiological机械应力(MS)被视为一个重要的危险因素的发展腰椎DDD (4]。女士过度导致细胞死亡和细胞外基质(ECM)退化,从而导致重大的结构性变化在试管5]。Necroptosis和细胞凋亡是细胞程序性死亡的两个主要类型,涉及腰DDD (6,7]。尽管越来越多的证据,但机制MS-induced DDD尚未完全阐明。

线粒体是中央细胞质中心不仅细胞代谢所必需的各种类型的程序性细胞死亡,包括细胞凋亡和necroptosis,由于他们生产活性氧(ROS)和其他prodeath介质(8]。多种复杂的机制构成MS-induced线粒体活性氧的生产,包括细胞内Ca^{2 +}过载和细胞骨架应变(9- - - - - -11]。最近表明,机械刺激诱导的内质网^{2 +}发布和细胞外钙^{2 +}涌入(12]。过度的胞质钙^{2 +}海拔诱导线粒体去极化和ROS生成(13]。线粒体作为细胞骨架相互作用严重,难怪细胞株在应变线粒体ROS生成结果。此外,细胞骨架的溶解试剂防止冲击造成的ROS生成(9]。

几项研究已经强调了线粒体ROS的重要性在NP细胞的机械损伤。过多的活性氧生成激活多种细胞凋亡通路造成损害蛋白质,核酸,脂质,细胞膜和细胞器。Mitochondrial-derived氧化压力被认为是导致necroptotic通路在receptor-interacting蛋白激酶3 (RIPK3)或mixed-lineage激酶域蛋白质(MLKL)水平14]。最近的一项研究报道,线粒体ROS促进RIPK1自身磷酸化丝氨酸残基161 (S161),然后招募RIPK3进一步形成一个功能necrosome和necrosomal RIPK3增强活性氧产量(8]。近年来,越来越多的研究文章凸显了线粒体ROS的关键作用NP细胞的程序性死亡,为腰椎的发展提供至关重要的新的见解DDD (15]。例如,一个孤立的NP细胞研究表明增加RIPK1表达式后compression-induced损伤诱导的线粒体功能障碍和氧化应激。然而,线粒体ROS如何影响试管的NP细胞生存能力仍不清楚。

增强表达异化的标记,如矩阵metalloproteases(基质金属蛋白酶)和disintegrin和金属蛋白酶(ADAMTS)蛋白质和血小板反应蛋白图案粘多糖的损失后曾被观察到在NP组织有趣的是,女士Nasto等人报道,线粒体ROS NP细胞体外诱导MMP基因表达,表明线粒体ROS扮演一个在体内试管变性的病理作用[16]。其他一些报告表明,抗氧化治疗抑制ECM-destructive酶的基因表达在软骨(女士17]。因此,我们假设MS-induced降解标记表达式和ECM变性部分由线粒体ROS。

多项研究表明,高加载DDD(是一个重要的因素18- - - - - -24]。基于这一发现,我们成功地建立了一个椎间盘退化器官培养模型通过致命一击加载(24]。这个模型显示出早期退化的迹象,包括纤维环(AF)裂缝,ECM降解,粘多糖(GAG)释放,并调节异化的标志基因的表达。我们的致命一击加载模型可能不完全揭示DDD发展的整个过程。然而,它是适合调查MS-induced DDD的发病机理在早期阶段。

本研究的目的是调查程序性细胞死亡的发生,ECM变性,线粒体ROS生产女士在一个致命一击后加载模型。女士之间的相关性,更重要的是,线粒体ROS、程序性细胞死亡,ECM退化评估通过测量细胞反应来帮助阐明DDD的分子病理生理学。

2。材料和方法

2.1。分离和培养的试管

从牛的尾巴从当地屠宰场获得。当我们使用屠宰场的剩菜,不需要伦理委员会批准根据中国法规。试管隔离和培养进行了如前所述在0天(19]。总之,解剖后周围的软组织,个人试管与侧切除带锯。终板与磷酸盐(PBS)使用一个冲洗APEXPULSE一次性脉冲灌洗系统(顶点、广州、中国)。然后,包含10%的试管被用PBS青霉素和链霉素(Gibco沃尔瑟姆,MA)在振动台15分钟。试管被孵化与杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM Sigma-Aldrich,德国慕尼黑)补充2%胎牛血清(FCS)、青霉素、链霉素的1%,1% + 1 (Sigma-Aldrich), 50μg / ml L-ascorbic酸(Sigma-Aldrich),和0.1% Primocin(美国InvivoGen,圣地亚哥,CA)在湿润(85%)的气氛中有5%的公司₂在37°C。所有试管培养生理载荷作用下(0.02 - -0.2 MPa;0.2赫兹;1小时/天)从第一天(图在一个专门设计的生物反应器1(一))。培养基是取代生理负荷后每天一次。试管从相同的尾巴被随机分配到不同的组。只试管受到生理负荷文化被分配给控制(CON)组。

2.2。机械应力

试管受到使用定制的万能力学试验机女士在一个专门设计的孵化室室温1天(图1(一))。女士期间,试管被孵化的培养基,以防止脱水。试管是首先受到一个预加载10 N 3分钟,以防止水分过多,确保可靠的终板之间的接触,孵化室,机械测试。女士受伤是申请一秒钟的应变盘高度的40%。女士受伤后,分析了试管或孵化培养基日常生理加载另一个1到7天。

2.3。动态抗压刚度

专门设计的动态抗压刚度测量的生物反应器在几个时间点:1天,一夜后第二天,第七天free-swelling文化(25]。光盘是首先加载应变为10% 3分钟,然后装载10轮正弦压缩应变增长5 - 15%。动态应力是由以下方程: 。 和表示最大和最小的力量实现在一个圆的,分别试管的截面积。每个加载的动态抗压刚度测量圆的,和10轮的平均值计算。刚度测量在第一天被用作基线进行标准化。

2.4。抑制剂的研究

抑制剂研究各种试剂溶解在二甲亚砜(DMSO)和PBS稀释。然后,100年μl (PBS包含试剂与26-gauge针注入NP组织在动态载荷循环的中间。排除潜在的干扰,100μl (PBS含有0.05% DMSO溶液注入诈骗试管。2小时free-swelling复苏后,试管受到一次性女士受伤。区分细胞凋亡和necroptosis RIPK1抑制剂necrostatin-1 (Nec-1, 80μ美国新泽西m,多国评价)和pan-caspase抑制剂N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone (Z-VAD-FMK 50μ米,MCE)。电子传递链抑制剂鱼藤酮(20μ米,Sigma-Aldrich)被用来抑制线粒体ROS生成。验证线粒体ROS参与MS-induced NP细胞程序性死亡和椎间盘变性,线粒体活性氧清除剂mitoquinone甲磺酸(MitoQ 4μ使用m, MCE)。MitoQ混合成日常中更新后的培养基。

2.5。细胞生存能力分析

细胞生存能力评估使用钙黄绿素acetoxymethyl酯(钙黄绿素点,eBioscience,法兰克福,德国)和propidium碘(π,多国评价)。在此系统中,绿色荧光显示可行的细胞与完整的膜,绿色/红色荧光显示可行的细胞损害等离子体膜,和红色荧光显示死细胞(26]。组织学分析,房颤和终板与手术刀解剖。NP组织切成薄片(100μ米)的振动切片机(徕卡VT1200S、徕卡微系统公司、德国)。NP组织切片孵化了一个包含1培养基μg / ml钙黄绿素和1μg / mlπ为一小时37°C。洗后用PBS,片立即查看使用倒置的共焦激光扫描显微镜(蔡司共焦LSM 780年,卡尔蔡司Jena GmbH,耶拿,德国),每盘和一个随机的形象进行了分析。可行的和死细胞的数量使用ImageJ手动测量软件(美国国立卫生研究院)。

2.6。线粒体膜电位的测量

线粒体膜电位是评估使用5、5 ,6、6 - - - - - -tetrachloro-1 1 ,3,3 - - - - - -”tetraethylbenzimidazolocarbocyanine碘(JC-1 MCE)。线粒体在细胞与正常的线粒体,JC-1聚集在红/绿荧光强度高的比率。与线粒体受损细胞,JC-1总量成为JC-1单体,红/绿荧光强度比率减少。NP组织切片与培养基含有10孵化μ米JC-1一小时37°C。洗后用PBS,片立即使用倒置的共焦激光扫描显微镜,查看每盘和一个随机的形象进行了分析。使用ImageJ JC-1红色荧光强度分析软件。

2.7。活性氧的检测

细胞内ROS生成检测使用dihydroethidium”(MCE)。Dihydroethidium穿透等离子体膜很容易,转化为溴化乙锭的超氧化物阴离子和插入到DNA核,发射红色荧光标记。NP片孵化了一个包含10个培养基μm dihydroethidium和1μg / ml钙黄绿素是一小时在37°C。洗后用PBS,片立即使用倒置的共焦激光扫描显微镜,查看每盘和一个随机的形象进行了分析。可行的细胞和dihydroethidium-positive细胞的数量是手动测量使用ImageJ软件计算dihydroethidium-positive细胞的比例。

2.8。RNA提取和实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

NP组织收获的第一天和第七天基因表达分析。每个试管的软骨终板分离,大约150毫克的NP组织收集。RNA提取的组织样本和2毫克/毫升链霉蛋白酶消化1小时在37°C, flash冻结,在液态氮粉,均质使用TissueLyser [27]。执行总RNA提取使用三试剂(分子研究中心,辛辛那提,哦,美国),然后,400 ng的RNA被转换为互补使用上标很互补脱氧核糖核酸合成装备(生活技术,卡尔斯巴德,CA)。RT-qPCR执行使用PowerUp SYBR绿色主混合(热费希尔科学、美国)在实时系统(Bio-Rad)。每个反应混合物是10μl和包含2μ5 ng / lμl cDNA、5μl (2 x PowerUp SYBR绿色主人混合,2μl nuclease-free水,和0.5μl每10μ正向和反向引物。以下循环条件应用:50°C 2分钟和95°C 2分钟紧随其后的是44 15秒的周期在95°C和1分钟60°C。在这项研究中使用的特定的引物设计通过使用引物6.0软件(应用生物系统公司,培育城市,CA),和提供的序列表1。核糖体蛋白侧杆单元P0 (RPLP0)作为参考基因。数据分析使用2^{- - - - - -ΔΔCt}算法。

2.9。组织学

NP组织在4%多聚甲醛固定24小时,在分级脱水蔗糖的解决方案,之后10μ米厚的部分做好准备的话。免疫荧光染色法对CASPASE3 (Proteintech 1: 400年,中国),BCL2(1: 200年,Proteintech),伯灵顿(1:400年,Proteintech) MLKL(1: 400年,表达载体、钙、美国),可以(1:200年,表达载体),MMP3(1: 100年,Proteintech) ADAMTS5(亲和力1:200年,美国),和胶原蛋白II(1: 200年,亲和力)执行。短暂,部分permeabilized 0.3% Triton x - 100 30分钟,然后用5%牛血清白蛋白和0.1%堵塞Triton x - 100 1小时在室温下。随后,部分被孵化与抗体在一夜之间4°C。组织部分被彻底清洗与Tween-20 Tris-buffered盐水(TBST)和孵化萤石- 594共轭anti-rabbit二级抗体(杰克逊ImmunoResearch Inc .)、西树林,PA,美国)在1:300稀释1小时在室温下。然后,部分再次用TBST洗净,和核复染色与4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI Abcam,德国)10分钟。

终端原位dUTP尼克结束标记(TUNEL)是用于检测DNA碎片,这被认为是细胞凋亡的特征。TUNEL染色根据指令执行的TUNEL细胞凋亡分析工具(大连Meilun生物技术。大连,中国),细胞核与DAPI复染色(Abcam) 10分钟。图像可视化使用LSM 780共焦显微镜(蔡司)与禅宗黑人使用ImageJ软件和分析。

后0、4、7天文化、试管很快被新鲜冷冻,横切成10μ米厚的部分,然后固定在100%甲醇。快速绿色红色染料O (Sigma-Aldrich)和0.02% (Sigma-Aldrich)被用来显示整体矩阵组织和Weigert苏木精(Sigma-Aldrich)被用来显示核分布。病理染色部分数字成像系统(Kfbio、宁波、中国)。半定量的评分系统是用于确定退化的程度(18]。组织学分级标准主要基于间隙模式在试管中发现,得分从0到9。

2.10。测量氧化谷胱甘肽(GSSG)和总谷胱甘肽

GSSG和总谷胱甘肽测定使用谷胱甘肽(减少谷胱甘肽)和GSSG试验设备(Beyotime生物技术,中国)。短暂,NP组织在液氮粉,均质在缓冲区根据指令,然后离心机。测量GSSG,谷胱甘肽反应前被谷胱甘肽还原酶和NADPH。测量总谷胱甘肽(GSSG +谷胱甘肽),上层清液被添加到缓冲含有谷胱甘肽还原酶和NADPH。五分钟后,dithionitrobenzoic酸(DTNB)补充说,在412 nm和吸光度测定。

2.11。分析发布呕吐

插科打诨的累积释放条件培养基测定使用修改后的1,9-dimethylmethylene蓝色(DMMB)方法(28]。DMMB解决方案是由溶解16毫克DMMB (Sigma-Aldrich), 3.04 g的甘氨酸(Sigma-Aldrich), 1 L和2.37克氯化钠的蒸馏水(pH值3.0)。稀释条件培养液(20μl)是200年混合μl DMMB解决方案的,吸光度是立即以535海里。连续稀释的软骨素4-sulfate钠盐(阿拉丁、上海、中国)被用来生成呕吐标准参考曲线。

2.12。统计分析

所有使用SPSS 22.0统计分析(美国芝加哥,IBM IL)。Shapiro-Wilk正常测试进行评估数据的正常分布。比较两组使用学生的进行 - - - - - -检验正态分布数据和Mann-Whitney - - - - - -测试非正态的分布数据。时被认为是显著的不同值< 0.05。

3所示。结果

3.1。存在线粒体活性氧的积累在NP细胞和线粒体功能障碍

Dihydroethidium染色是用来检测在NP细胞ROS生产几个时间点后显著增加ROS-positive细胞比例女士和女士保持在一个稳定的高水平在第一个12小时(数字2(一个)和2 (b))。随后,ROS-positive细胞的比例大幅下降,48小时内达到较低的水平。ROS-positive细胞的比例保持稳定在生理载荷文化团体。线粒体电子传递抑制剂鱼藤酮的比例显著降低ROS-positive细胞后立即(~ 78%,女士 )(图2 (c))。线粒体活性氧清除剂MitoQ也显著下降的比例ROS-positive细胞(~ 73%, )。

JC-1染色是用于监控的线粒体膜电位在NP组织后立即女士NP细胞线粒体膜电位明显降低女士组(数字2 (d)和2 (e))。MitoQ预处理部分线粒体膜电位的衰减大萧条。这些结果表明,女士可以直接诱导线粒体功能障碍。

GSSG /总谷胱甘肽比例计算进一步评估ROS水平NP组织。如图2 (f)女士治疗增加了GSSG /总谷胱甘肽比,这增加被MitoQ预处理减轻。此外,RT-qPCR结果表明MitoQ显著地抑制过氧化氢酶(CAT)的mRNA表达引起的女士(数字2 (g)和2 (h))。这些结果表明,含活性氧积累主要是来源于线粒体女士。

3.2。女士后NP细胞生存能力的变化

探讨NP细胞死亡机制女士后,试管培养,随后分析了在不同时间点细胞生存能力。女士到试管的应用导致了戏剧性的时间减少NP细胞生存能力(数据3(一个)和3 (b))。一小部分NP细胞死亡后立即发生,女士和细胞生存能力保持稳定在第一次12小时([反对与0小时]女士:9.2%, ;[0小时和12小时女士]女士:1.9%, )。超过70%的NP细胞死亡发生后12 - 48小时内(女士(女士反对与12小时):11.1%, ;(12小时女士与女士48小时):27.8%, )。细胞生存能力达到了一个相对稳定的状态([48小时和72小时女士女士]:2.2%, )女士在48小时后的应用程序。CON组的细胞生存能力保持稳定在近94%((欺诈和诈骗72小时):1.8%, )在生理载荷72小时后的文化。因此,大小和细胞死亡的机制后随时间。

NP细胞生存能力急剧降低女士建议12小时后,直接由女士除了坏死,细胞程序性死亡是激活的。出于这个原因,试管用Z-VAD-FMK预处理,Nec-1或MitoQ 2小时然后女士受到细胞生存能力分析表明,抑制剂预处理明显缓解NP细胞死亡(MitoQ集团20%的细胞生存能力 ;Z-VAD-FMK集团15.82%的细胞生存能力 ;Nec-1集团13.12%的细胞生存能力 )对MS组(图3 (c))。

3.3。程序性细胞死亡率标记NP女士后组织的变化

我们进一步研究了细胞凋亡指标的相对变化的基因(CASPASE3、BCL2和伯灵顿)和necroptosis指示器基因(RIP1, RIP3, MLKL)(数据4(一)- - - - - -4 (f))。细胞凋亡和necroptosis基因的信使rna表达水平显著增加女士在12小时后,和MitoQ预处理减轻一些变化(CASPASE3, RIP1、RIP3 MLKL)。符合mRNA表达的结果,免疫荧光染色结果显示,细胞凋亡(CASPASE3,伯灵顿,伯灵顿/ BCL2广播)和necroptosis (MLKL)显著增加(女士在12小时后的数字4 (g)- - - - - -4 (j)和4(米))。MitoQ预处理明显抑制程序性细胞死亡相关的表达标记MLKL CASPASE3,伯灵顿和高架BCL2的表达。此外,TUNEL染色表明MitoQ显著逆转NP细胞凋亡引起的女士( )(数据4 (k)和4(左))。

女士是否有持久影响NP细胞程序性死亡,细胞凋亡和necroptosis基因的信使rna /蛋白质含量和蛋白质测定的女士7天组。这些标记物的水平没有显著不同女士7天组和7天CON组(数字4(一)- - - - - -4 (j)和4(米))。TUNEL染色表明,细胞凋亡水平没有显著差异这两个组之间(数字4 (k)和4(左))。

3.4。在NP组织代谢失调

NP组织从MS组和代谢分析的CON组收获后在12小时和7天与CON组相比,女士女士组表现出调节分解代谢的基因(MMP1、MMP3和ADAMTS5)表达水平和表达下调胶原蛋白II型α1 (COL2A1)表达水平12小时后女士(数字5(一个)- - - - - -5 (f))。免疫荧光染色结果进一步证实了上述变化(数据5 (g)- - - - - -5 (j))。MitoQ预处理部分缓解MS-induced代谢失调。

进一步研究代谢失调的程度,我们分析了累积GAG释放使用DMMB方法。后的条件培养基收集每日free-swelling文化。测量值在第一天被用作正常化的底线。女士显著增加累计GAG释放在7天。MitoQ预处理部分损失预防呕吐(图5 (k))。

3.5。试管的动态抗压刚度和形态

女士后第一天,动态抗压刚度的变化没有显著不同的案子,女士,女士MitoQ +组(图6 (c))。与那些诈骗集团相比,试管女士组表现出显著降低刚度7天,但这种差异是由MitoQ减毒(图6 (d))。这些结果表明,女士的刚度降低试管部分是通过线粒体ROS。

然后我们评估试管的形态学番红精O /快速绿色和苏木精染色。女士申请后七天,女士组织变性得分要明显高于CON组。此外,在变性成绩没有明显差异后第四天至第七天女士的应用程序。在MitoQ-pretreated试管,变性分数显著降低(数字6 (e)和6 (f))。

4所示。讨论

女士已被确定为一个重要的危险因素的发病和进展DDD (27]。众多报道表明,复杂的分子级联参与的病理生理学MS-induced DDD (29日,30.]。在当前的研究中,我们试图解决之间的相互作用线粒体ROS和DDD试管器官培养模型通过使用一个定制的万能力学试验机。我们获得的证据表明,多个细胞死亡方式参与MS-induced NP细胞死亡,与线粒体ROS-orchestrated程序性细胞死亡中发挥重要作用。我们的数据表明,线粒体活性氧的主要来源是氧化剂在试管,此外,我们发现MS-induced ECM变性是介导的,至少部分由线粒体ROS。此外,我们发现,改变代谢女士和程序性细胞死亡相关标记物表达水平在早期的时间点。

多向性的病理生理信号代理,ROS生成不同的细胞内的来源,包括胞质膜NADPH氧化酶、线粒体呼吸复合物、黄嘌呤氧化酶、非耦合一氧化氮合酶(31日]。越来越多的证据表明,活性氧中发挥至关重要的作用的发生和恶化DDD (32]。尽管大量的研究表明,mitochondrial-derived ROS参与DDD,没有研究调查在NP细胞活性氧的主要来源MitoQ女士是一个mitochondrial-targeted活性氧清除剂,已被证明在许多研究减轻氧化损伤,降低线粒体ROS水平(33]。在我们的研究中我们使用MitoQ阐明线粒体ROS的重要性MS-induced细胞死亡和ECM降解。我们也使用鱼藤酮抑制线粒体呼吸链复合体i鱼藤酮预处理明显,此外,女士后立即抑制ROS生产mitochondrial-targeted抗氧化剂MitoQ减毒大规模MS-induced ROS生产。因此,数据表明,线粒体活性氧的主要来源是氧化剂在我们的模型系统。我们还研究了ROS生成的时间进程。ROS-positive细胞达到一个高水平的比例最早观察时间点。长期随访显示,阳性细胞的比例保持稳定,从0到12个小时,但大幅降低了24小时后48小时达到了一个相对较低的水平,这些数据表明女士ROS-related后早期病理变化可能有限。

在体外研究中使用牛试管器官培养模型,女士被发现减少NP细胞生存能力(34]。然而,NP细胞死亡模式和时间进程仍然默默无闻。生活/试管的死细胞分析显示,细胞生存能力保持稳定女士第一次12小时后,除了一些细胞丢失后立即,女士,随后的大规模细胞死亡发生在24小时。急性细胞有可能坏死细胞死亡造成的损失由女士随后发生大规模细胞死亡的暗示,除了坏死,细胞程序性死亡开始。

在体外实验中使用各种细胞培养压缩设备显示,NP细胞凋亡和necroptosis[女士15]。然而,先前的报告主要关注短期细胞死亡模式的变化,并没有报告关于女士的长期影响NP细胞。据我们所知,这是第一个研究探讨程序化死亡女士受伤后的变化在早期的时间点(12小时)和长期的时间点(7天)。符合之前的研究,我们的研究表明,necroptosis和细胞凋亡发生在试管器官培养模型,以应对女士在早期的时间点。然而,necroptosis——和凋亡标记恢复正常水平后第七天力的应用程序。这些数据表明,女士在NP细胞生存能力的影响限制在一个相对较短的时期。

NP细胞死亡的时间进程是一致的动力学线粒体ROS在这个模型中,峰值然后保持稳定在第一次12小时减少到一个相对较低的水平之前,48小时后女士这是合理的假设,线粒体ROS necroptosis的感应和细胞凋亡的部分原因。在这项研究中,MitoQ预处理显著提高细胞生存能力和部分恢复necroptosis试管和凋亡标记水平模型。因此,结果表明,诱导细胞凋亡和necroptosis女士通过线粒体ROS NP细胞。

类似于之前的研究,我们的研究显示,增加分解代谢的基因表达和ECM变性(女士35]。在目前的研究中,使用一个体外牛试管器官培养模型,我们发现MitoQ预处理减毒ECM退化和减少异化的标记表达式。基于之前报道的有害活性氧的影响分解代谢的标记和ECM完整的表达,这些发现表明,增加线粒体ROS水平圆盘NP MS-induced退行性变化的部分原因。作为一项研究未能激起矩阵退化通过分解代谢的分子在牛试管,需要进一步研究来探索潜在的分子机制负责线粒体ROS-mediated NP组织变性(36]。

我们的研究有几个限制。首先,体外试管器官模型用于我们的学习受到严重压缩女士是否研究成果可以应用到复杂的生理女士需要进一步调查。第二,我们证实,线粒体ROS的感应部分负责女士后NP细胞程序性死亡,但我们并没有阐明的精确分子机制。第三,线粒体ROS海拔讨论在我们的研究中可能只代表一小部分线粒体功能障碍的机制在起作用。更复杂的线粒体功能障碍的机制在DDD应该在将来的研究中进一步研究。

5。结论

数据表明,活性氧诱导NP细胞程序性死亡和ECM降解早期时间点后女士这些活性氧积累主要是从线粒体。这些发现表明,mitochondrial-targeted抗氧化剂的使用后立即女士可能是一个有前途的方法来防止发病或DDD的进展。我们的研究结果也提供了新颖的见解DDD的病理机制。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Bao-Liang李、刘Xizhe Manman高贡献同样这项工作,应该视为co-first作者。

确认

这项研究是由中国国家重点研发项目(2017 yfc1105000),中国国家自然科学基金(81772400,81772400,32071351),基础研究基金为中央大学(19 ykzd05),广州城市的自然科学基金(201704030082,201704030082,201604046028),深圳市科技创新委员会的基础(JCYJ20190809142211354和GJHZ20180929160004704),医学三明项目在深圳(SZSM201911002)和北京市卫生委员会(批准号。bmhc - 2019 9, bmhc - 2018 - 4和PXM2020_026275_000002)。

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