文摘
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种最常见的慢性肝脏疾病。据报道,epigallocatechin-3-gallate (EGCG)在哺乳动物细胞中发挥重要的生物和药理作用。然而,机制的有益作用EGCG对非酒精性脂肪肝的发展尚未完全阐明。在目前的研究中,EGCG在增长的行动的机制,细胞凋亡和自噬研究使用油酸(OA)治疗肝细胞和脂肪饮食——(HFD)诱导非酒精性脂肪肝小鼠模型。EGCG管理提升OA-treated肝细胞的生长。EGCG能减少mitochondrial-dependent细胞凋亡和自噬可能通过增加活性氧(ROS)介导的增殖蛋白激酶(MAPK)通路OA-treated肝细胞。符合在体外结果,我们在活的有机体内研究证实,EGCG减毒HFD-induced治疗非酒精性脂肪肝通过减少细胞凋亡和促进自噬。EGCG可以减轻HFD-induced非酒精性脂肪肝可能通过减少细胞凋亡和自噬通过增加活性氧/ MAPK通路。EGCG可能是一种有前途的治疗非酒精性脂肪肝。
1。介绍
茶,用的叶子茶树全球,长期以来被认为是一个受欢迎的饮料(1- - - - - -3]。茶可以根据生产流程主要分为三种类型,包括绿茶(nonfermented)乌龙茶(semifermented),红色和黑色的茶(发酵)4]。茶的功能成分可以归因于多酚化合物,特别是儿茶素(1]。四个主要在绿茶儿茶素已确定,如epigallocatechin-3-gallate (EGCG),儿茶素,epicatechin-3-gallate,表儿茶素,EGCG最活跃和丰富的化合物(3,5]。这些儿茶素b环上的不同羟基的存在/缺乏galloyl一半(4]。EGCG展品强结合生物活性大分子,如DNA和蛋白质通过π- - - - - -π堆积相互作用、氢键和疏水作用[5,6]。
EGCG, flavone-3-ol酚类化合物,有八个自由羟基(2),这可能导致其不同的生物和药理特性,如antiamyloidogenic [7],chemopreventive [8],renoprotective [9,抗癌10,抗衰老的11],antiautoimmune [12),和抗病毒13)活动。非酒精性脂肪肝病(NAFLD),一种常见的慢性肝病,一直认为是终末期肝病的主要原因之一,肝移植和肝细胞癌(14- - - - - -16]。非酒精性脂肪肝的患病率增长与全球肥胖流行病、高血压、2型糖尿病、高脂血症、代谢综合症(15,16]。它已经表明,EGCG可以减弱高脂肪饮食——(HFD)诱导非酒精性脂肪肝在老鼠和老鼠17- - - - - -19]。然而,EGCG的抑制效果和详细的机制在非酒精性脂肪肝的发生和发展需要进一步调查。
在这项研究中,EGCG在增长的作用机理,细胞凋亡和自噬的油酸(OA)治疗肝细胞被阐明。HFD-induced NAFLD小鼠模型进一步采用确认EGCG对非酒精性脂肪肝的作用和机制。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
人类肝细胞系L02和qsg - 7701买来Feiya生物科技有限公司有限公司(江苏盐城,中国)。细胞培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)与10%胎牛血清(链霉素的边后卫)和1% /青霉素。每次实验之前,细胞在无血清DMEM饥饿12 h。然后,细胞治疗中包含0.5毫米OA-bovine血清白蛋白(BSA);脂肪无酸的,低内毒素)复杂(4:1、摩尔比),有或没有一个50浓度μM EGCG 24 h。中只有BSA被选为控制(20.]。
2.2。油红O染色(奥罗)
细胞被固定在4%多聚甲醛15分钟,孵化与异丙醇为20分钟,20分钟和彩色奥罗解决方案,其次是在室温下与苏木精复染色。奥罗的染色强度是衡量ImageJ软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)(21]。
2.3。细胞生长试验
的5-ethynyl-2 - - - - - -脱氧尿苷(EdU)实验进行了使用经济的工具(RiboBio、广州、中国)。细胞增殖率计算阳性细胞占总细胞的百分比。此外,细胞计数kit-8 (CCK-8)检测试剂盒(Beyotime、上海、中国)被用来检测细胞的可行性。细胞生存能力表示为一个百分比对照组(22]。
2.4。流式细胞术分析
细胞培养与propidium碘(π)/核糖核酸酶混合物为20分钟。一个FACSVerse流式细胞分析仪(美国BD,圣何塞,CA)采用分析细胞周期。凋亡水平研究膜联蛋白V-FITC /π试验板(注册机、南京、江苏、中国),并进一步分析了使用FACSVerse流式细胞分析仪。
2.5。免疫荧光染色
绿色荧光蛋白(GFP)红色荧光蛋白- 1 (RFP) microtubule-associated蛋白轻链3 (MAP1LC3 / LC3)质粒已经被用于检测自噬水平(23]。然后,GFP-RFP-LC3质粒(Hanbio、上海、中国)转染到细胞。48 h的孵化后,细胞荧光测定使用Eclipse Ti荧光显微镜(美国纽约尼康,梅尔维尔)。自噬体(黄点)和自吞噬泡(红点)计算positive-stained细胞占总细胞的比率(24]。
2.6。Monodansylcadaverine (MDC)染色
细胞质中的形态,自噬空泡的形成是一个典型的自噬的特征。MDC是自噬空泡的一个关键标志(25]。简而言之,肝脏细胞被沾染了50μmol / L MDC的30分钟37°C。然后,细胞与5%多聚甲醛固定,立即一个Eclipse Ti在荧光显微镜下观察(尼康)。
2.7。测量活性氧(ROS)
细胞ROS水平衡量2 ,7 - - - - - -二乙酸dichlorodihydrofluorescein (Beyotime)。
2.8。抗氧化活性测定
总超氧化物歧化酶(SOD)活性测定使用工具包和WST-8 (Beyotime)。过氧化氢酶(CAT)活性进行了分析使用猫分析工具包(Beyotime)。谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)活动氧化酶试验检测到的装备与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Beyotime)。
2.9。免疫印迹
采用免疫印迹试验确定蛋白质的表达水平。主要抗体,比如anti-cyclin D1 / E1, anti-cyclin-dependent激酶(CDK) 2/4, anti-p21, anti-p27, anti-beclin-1, anti-P62, anti-LC3A / B, anti-extracellular signal-regulated蛋白激酶1/2 (ERK1/2) anti-phospho——(p) ERK1/2 (Thr202 / Tyr204), anti-c-Jun n端激酶(物),anti-p-JNK (Thr183 / Tyr185), anti-p38,和anti-p-p38 (Thr180 / Tyr182)和辣根peroxidase-conjugated二级抗体购自细胞信号技术(CST,丹弗斯、马、美国)。Anti-B-cell lymphoma-2 (bcl - 2), anti-Bcl-2-associated X蛋白(伯灵顿),Anti-B-cell lymphoma-extra大(Bcl-xl) anti-Bcl-xl / Bcl-2-associated死子(坏),anti-cleaved caspase-3/9, anti-cleaved poly-ADP-ribose聚合酶(PARP)和反β肌动蛋白是来自Proteintech(美国芝加哥,IL)。乐队与化学发光检测系统(美国热,罗克福德,IL)。微使用ImageJ软件带强度进行了分析。
2.10。动物
动物实验是医学伦理委员会批准,为河南大学医学院实验动物福利(husom - 2017 - 208)。C57BL / 6 j小鼠(8周大,男),HFD千卡,脂肪(60%),和低脂饮食(最晚完成日期,10%千卡,脂肪)获得至关重要的河实验动物科技有限公司有限公司(中国,北京)。所有老鼠都保持在12 h光/暗周期和允许获得食物和水随意。老鼠HFD ( )或者最晚完成日期( )总共14周。喂养10周后,HFD-fed老鼠分配给HFD集团( )和HFD + EGCG(50毫克/公斤/天)组( )。老鼠治疗4周。老鼠的食物/水的摄入量和身体重量测定。然后,老鼠死亡,收集血液样本。肝脏、棕色脂肪和白色脂肪被移除并且称重。
2.11。生物化学分析
的浓度甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的等离子体是由一个自动检查血液学分析仪(bc - 6900、迈瑞、深圳、广东,中国)。TG, TC的内容在肝细胞和组织,以及nonesterified脂肪酸(NEFA)在肝组织中被商业酶联免疫吸附试验检测试剂盒(南京建成生物工程研究所、江苏、中国)。
2.12。苏木精和伊红染色(他)
肝脏组织在中性10%福尔马林固定,嵌入在石蜡切片在4μ米,然后沾着他。
2.13。免疫组织化学(包含IHC)
肝脏样本分别沾anti-Ki67 (CST) anti-beclin-1, anti-cleaved caspase-3抗体。扩散指数、指数自噬和凋亡指数测定阳性细胞占总细胞的比率。
2.14。统计数据
所有的数据提出的 。两组之间的差异是由双尾学生的决定 - - - - - -测试和单向方差分析使用GraphPad棱镜6软件。 被认为是表明一个统计上的显著差异。
3所示。结果
3.1。EGCG促进OA-Treated肝细胞的生长
如数据所示1(一)和1 (b),OA诱导OA-treated肝细胞的脂质积累,进一步证明的TC和TG水平增加(数据1 (c)和1 (d))。EGCG治疗减少了OA-treated肝细胞脂质水平(数字1(一)- - - - - -1 (d))。肝细胞的生存能力和扩散是减少了办公自动化;然而,EGCG提升OA-treated肝细胞的生存能力和扩散(数字1 (e)- - - - - -1 (g))。此外,结果表明,OA引起细胞周期阻滞在G1期和EGCG逆转这一趋势(数据2(一个)和2 (b))。许多细胞cycle-related蛋白已确定在哺乳动物中,如细胞周期调控蛋白,包括细胞周期蛋白D1 / E1和CDK2/4,以及抑制细胞周期调控,包括p21和p27 [26,27]。我们的数据表明,OA增加了细胞周期蛋白D1的表情,细胞周期素E1, CDK2,到但表达下调p21和p27蛋白水平;然而,EGCG管理表现出反向趋势(数据2 (c)和2 (d))。综上所述,这些数据表明,EGCG可以通过促进促进OA-treated肝细胞的生长G1期细胞周期进程。
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3.2。EGCG减少OA-Treated肝细胞凋亡
如数据所示3(一个)和3 (b),数据表明,OA早期和晚期凋亡细胞数量增加,而EGCG的早期和晚期凋亡减少OA-treated肝细胞。伯灵顿的比率/ bcl - 2和坏/ Bcl-xl被认为是调节细胞凋亡的关键因素。比率的增加伯灵顿/ bcl - 2和坏/ Bcl-xl mitochondrial-dependent细胞凋亡的关键现象在哺乳动物28,29日]。此外,裂解caspase-3/9可以通过mitochondrial-mediated通路诱导细胞凋亡(30.]。PARP、核酶参与DNA修复,是一个重要的目标还存在在细胞凋亡(31日]。数据显示,OA增加了伯灵顿/ bcl - 2和坏/ Bcl-xl比率和caspase-3/9裂解和裂解PARP的表达水平,扭转的EGCG的政府(数字3 (c)和3 (d))。结果表明OA可以诱导mitochondrial-dependent在肝细胞凋亡和EGCG可能减少OA-treated肝细胞凋亡水平。
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3.3。EGCG OA-Treated肝细胞自噬在增加
自噬负责降解细胞内蛋白质的聚集,入侵的病原体,因此受损的细胞器,是至关重要的维持细胞内稳态和应对压力条件(32,33]。自噬是一个至关重要的一步转换nonlipidated LC3的形式(LC3-I) lipid-conjugated形式(LC3-II) [33,34]。自噬的营业额可以分子监控使用GFP-conjugated LC3 LC3-I LC3-II[的转换35]。在目前的研究中,GFP-RFP-LC3质粒转染进入肝细胞,通过荧光显微镜进一步检测。治疗OA减少的数量免费红点(自吞噬泡)和黄点(自噬小体),而政府的EGCG(数据显示相反的影响4(一)和4 (b))。类似的趋势在MDC染色观察(数字4 (c)和4 (d))。除了LC3, beclin-1和P62也被认为是自噬的特定标记(33,36]。beclin-1的表达水平和LC3在OA组低于对照组,但这两个因素的蛋白质含量在OA +高EGCG组比OA组。此外,P62的表达水平表现出反向趋势(数据4 (e)和4 (f))。这些结果共同表明OA-treated肝细胞的自噬水平表达下调与EGCG可能上调自噬机制和治疗。
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3.4。EGCG抑制ROS /增殖蛋白激酶(MAPK)通路OA-Treated肝细胞
氢氧自由基等活性氧,过氧化氢和过氧化物阴离子生成通常作为有氧新陈代谢的副产品(37,38]。活性氧可以回收的抗氧化防御系统,主要包括氧化酶SOD,和猫37- - - - - -39]。与对照组相比,ROS水平增加,但氧化酶SOD,猫和活动是OA组中表达下调,可逆转的EGCG管理局(数字5(一个)和5 (b))。结果表明,EGCG可以减少OA-induced肝细胞的氧化应激。已经表明,活性氧可以激活MAPK通路和衰减的活性氧ROS拾荒者可以禁用MAPK信号(40,41]。如数据所示5 (c)和5 (d),OA p-ERK1/2的表达减少,但增加的水平p-JNK p-p38,虽然政府EGCG表现出反向对激酶的影响。数据表明,EGCG可能抑制ROS / MAPK通路OA-treated肝细胞。
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3.5。EGCG变弱HFD-Induced非酒精性脂肪肝小鼠
比老鼠为10周,最晚完成日期HFD-fed老鼠表现出增加的体重,这表明一个滋养肥胖模型已成功建立。此外,最小的致命剂量组相比,HFD-fed老鼠食物和水的摄入量减少,以及增加肝脏的重量、白色脂肪、棕色脂肪。治疗EGCG逆转这些变化除了食物摄入量(数字6(一)- - - - - -6 (h))。此外,HFD-fed老鼠表现出水平的提高TC, TG、ALT、AST最小的致命剂量组相比,治疗可以逆转的EGCG(数字6(我)- - - - - -6(左))。此外,HFD-fed老鼠调节水平的TC, TG,和NEFA在肝脏与最小的致命剂量组相比,减少了EGCG的管理(数据6 (m)- - - - - -6 (o))。最小的致命剂量组相比,HFD组表现出更高的凋亡指数,以及较低的扩散指数和自噬指数,可以逆转的EGCG管理局(数字7(一)- - - - - -7(d))。这些结果表明,EGCG可以减弱HFD-induced非酒精性脂肪肝小鼠。
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4所示。讨论
非酒精性脂肪肝,最常见的慢性肝病,导致终末期肝病、肝移植和肝细胞癌(14- - - - - -16]。它已经表明,EGCG在哺乳动物中扮演重要的生物和药理作用。然而,EGCG的效果和机理的过程中,非酒精性脂肪肝在很大程度上是未知的。人类正常肝细胞qsg - 7701和L02被广泛用于研究新型药物的作用机制和捐助者(42,43]。单一不饱和脂肪酸OA,已成功地应用在非酒精性脂肪肝模型的建立[44]。在这项研究中,qsg - 7701和L02细胞被用来检查EGCG在OA引起的非酒精性脂肪肝的影响在体外。最近的一项研究表明,环氧硬脂酸,一种从OA氧化产品,可以诱导细胞毒性和G0 / G1期细胞周期阻滞在HepG2细胞(45]。我们的数据表明,OA可行性和降低肝细胞增殖和诱导细胞周期G1期被捕。更改管理EGCG可以逆转。这些数据表明,EGCG充当效应分子在促进OA-treated肝细胞的生长。
细胞凋亡是一种守恒的细胞死亡通路可以扮演关键角色在维护生物的体内平衡和真核的正常发展46,47]。在哺乳动物中有两种主要的凋亡通路识别:mitochondrial-mediated内在途径和死亡受体介导外在途径(48]。bcl - 2家族蛋白参与细胞凋亡的规定,如伯灵顿,坏,bcl - 2,和Bcl-xl49]。还存在许多凋亡刺激可以激活,PARP激活caspase-3裂解,从而导致细胞凋亡的发生(31日,38,49]。据报道,OA可以诱导细胞凋亡增加伯灵顿的水平和PARP但减少bcl - 2在HepG2细胞水平(50]。另一项研究表明,OA可以促进裂解的表情caspase-3和PARP151]。同样,我们的数据表明,OA早期和晚期凋亡诱导,以及增加的比率伯灵顿/ bcl - 2和坏/ Bcl-xl和裂解的表情caspase-3/9和裂解PARP肝细胞。EGCG OA组的凋亡水平显著降低。数据显示,OA-treated肝细胞的凋亡水平提高和治疗与EGCG能减少细胞凋亡。
自噬,进化守恒的分解途径,服务交付胞质材料为回收和溶酶体降解,导致大分子合成和能源生产(36,52]。自噬激活许多环境因素,包括细胞因子、激素和营养物质(53]。最近的研究表明,自噬在lipid-overloaded受损肝细胞在肝脏从非酒精性脂肪肝小鼠模型和非酒精性脂肪肝患者(54- - - - - -56]。符合上面的研究,我们发现OA-treated肝细胞的自噬水平下降。另一项研究报道,EGCG可以增加自噬水平增加溶酶体酸化和刺激肝细胞自噬流量和老鼠的肝脏(57]。我们的数据表明,EGCG能够增加OA-treated肝细胞自噬,表明自噬激活可以作为一个潜在的非酒精性脂肪肝的治疗目标。
它已经表明,低浓度的细胞内ROS是必要的许多生理角色包括信号转导和细胞增殖。然而,ROS生产过剩可以诱导氧化应激和细胞氧化还原平衡,从而最终影响许多细胞功能(41,58]。我们的数据表明,OA ROS水平和减少氧化酶的活动增加,SOD,和猫,与先前的研究结果一致(59]。影响与EGCG显著逆转治疗。在哺乳动物细胞中,三个主要类型的MAP激酶存在:兵,p38,和物与EGCG MAPK通路中的作用[60,61年]。MAPK级联非酒精性脂肪肝的发展中扮演关键性的角色,和海拔的活性氧激活MAPK通路(38,41,62年]。已经显示腹腔内政府的EGCG为14天(5毫克/公斤)抑制ERK的磷酸化,物和p38动物人工单侧输尿管梗阻(63年]。另一项研究表明,MAPK和低氧诱导因子- 1αEGCG治疗后下降,这表明EGCG可能抑制MAPK-related氧化应激(64年]。最近的一项研究表明,EGCG能增加抗氧化酶的表达水平,扭转ROS增加生产,调节mitochondrial-involved自噬(65年]。此外,EGCG能阻止α从H TC1-6细胞2O2全身的ROS生产通过一种蛋白激酶的激活信号和抑制p38和物的途径(66年]。在这项研究中,OA调节p-JNK的表达水平和p-p38但表达下调p-ERK1/2的水平。然而,政府EGCG显著逆转的蛋白质的水平。此外,ROS / MAPK通路是一个重要的信号级联,可以调节细胞凋亡和自噬的过程在哺乳动物细胞(67年,68年]。总之,这些数据表明,EGCG可以减少细胞凋亡,诱导自噬可能通过ROS / MAPK通路在OA-treated肝细胞。
在这项研究中,一只老鼠HFD-induced NAFLD模型被用来模拟不健康的饮食习惯。我们的研究结果表明,HFD喂养诱导体重明显增加,肝脏重量,白色脂肪体重,和棕色脂肪重量,以及TC、TG、ALT、AST小鼠的血浆中,表明非酒精性脂肪肝模型的成功建立。据报道,非酒精性脂肪肝患者往往有更高的TC和TG水平(69年]。EGCG显著降低TG, TC的水平在血浆和肝脏。此外,ALT和AST是肝损伤的重要指标在非酒精性脂肪肝70年]。EGCG管理明显减轻肝损伤HFD-fed老鼠通过降低ALT和AST水平。NEFA可以交付的通量为TG合成肝细胞,导致非酒精性脂肪肝的发展(71年]。治疗EGCG的NEFA水平下降HFD-fed小鼠的肝脏。此外,EGCG可以增加扩散和自噬但减少HFD-fed老鼠的肝细胞凋亡。数据表明,EGCG可能缓解HFD-induced NAFLD通过抑制细胞凋亡,促进自噬。
总之,我们的数据表明,EGCG可以减轻HFD-induced NAFLD通过抑制细胞凋亡,促进自噬可能通过ROS / MAPK通路。EGCG可以开发一个有效的代理非酒精性脂肪肝的治疗。
缩写
| EGCG: | Epigallocatechin-3-gallate |
| 非酒精性脂肪肝: | 非酒精性脂肪肝病 |
| HFD: | 高脂肪饮食 |
| 办公自动化: | 油酸 |
| DMEM: | 杜尔贝科修改鹰的媒介 |
| 的边后卫: | 胎牛血清 |
| BSA: | 牛血清白蛋白 |
| 奥罗: | 油红O |
| EdU: | 5-Ethynyl-2 - - - - - -脱氧尿苷 |
| CCK-8: | 细胞计数kit-8 |
| PI: | Propidium碘化 |
| 绿色荧光蛋白: | 绿色荧光蛋白 |
| 招标书: | 红色荧光蛋白 |
| MAP1LC3 / LC3: | Microtubule-associated蛋白质1轻链3 |
| 争取民主变革运动: | Monodansylcadaverine |
| ROS: | 活性氧 |
| SOD: | 超氧化物歧化酶 |
| 猫: | 过氧化氢酶 |
| 氧化酶: | 谷胱甘肽过氧化物酶 |
| CDK: | 细胞周期蛋白依赖性激酶 |
| ERK1/2: | 细胞外signal-regulated蛋白激酶1/2 |
| 病人: | 磷 |
| 物: | 小君n端激酶 |
| 中科: | 细胞信号技术 |
| bcl - 2: | b细胞lymphoma-2 |
| 伯灵顿: | Bcl-2-associated X蛋白 |
| Bcl-xl: | b细胞lymphoma-extra大 |
| 缺点: | 启动子Bcl-xl / Bcl-2-associated死亡 |
| PARP: | Poly-ADP-ribose聚合酶 |
| 最晚完成日期: | 低脂肪饮食 |
| TG: | 甘油三酸酯 |
| TC: | 总胆固醇 |
| ALT: | 丙氨酸转氨酶 |
| AST: | 天冬氨酸转氨酶 |
| NEFA: | Nonesterified脂肪酸 |
| 他: | 苏木精和伊红 |
| 包含IHC: | 免疫组织化学 |
| MAPK: | 增殖蛋白激酶。 |
数据可用性
所有生成的数据或分析在这项研究中都包含在发表的这篇文章。
伦理批准
动物实验是医学伦理委员会批准,为河南大学医学院实验动物福利(husom - 2017 - 208)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
d . W。,Z. X., A. J., and Y. L. conceived and designed the experiments; Z. L., Y. W., Q. Z., J. L., and P. Z. performed the experiments and prepared the figures; and D. W. wrote the main manuscript text. All authors reviewed and approved the manuscript.
确认
这项研究是支持由中国国家自然科学基金(U1504817。81802718, 81870591),河南省科技部门的基础,中国(号。202102310480,182102310335,192102310151),年轻骨干教师的培训项目在河南省高等学校的,中国(2020号ggjs038),和年轻人才的科学基金会河南大学医学院,中国(2019013)。