文摘

之前的研究表明,肿瘤抑制基因的突变冯Hippel-Lindau (VHL)可以导致生产过剩的活性氧(ROS),慢性炎症,是一种重要的诱发因素的发展透明细胞肾细胞癌(ccRCC)。研究VHL ccRCC形成的作用,我们之前开发的一种新型条件基因敲除小鼠模型模拟肾脏炎症和纤维化的特点导致囊肿形成和增生。然而,由于VHL复杂的细胞功能,这一现象的机制仍不清楚。在这里,我们使用了HK-2细胞和小鼠原发性肾小管细胞(mRTCs)携带VHL突变模型来研究活性氧积累的效果和潜在的分子机制。我们还研究了lipocalin 2 (LCN2)的作用在调节巨噬细胞招聘HK-2细胞。我们测量的ROS水平HK-2细胞存在与否LCN2击倒和发现VHL突变引起活性氧过剩,但LCN2击倒可以减弱的过程。VHL也发现调解在体外和在活的有机体内LCN2表达和分泌。因此,VHL可能会影响ROS LCN2-dependent地生产。我们的研究结果还表明,LCN2糖分会让HK-2炎症反应的细胞和巨噬细胞的趋化能力RAW264.7细胞。损失函数的证明冯Hippel-Lindau触发lipocalin 2-dependent炎症反应在培养和主肾小管细胞中,我们的研究结果为一个潜在的治疗方法提供新的见解干扰ccRCC的发展。

1。介绍

突变冯Hippel-Lindau (VHL)发挥重要作用在发展中透明细胞肾细胞癌(ccRCC) [1,2]。我们之前的研究表明,在肾脏损伤Vhl基因敲除小鼠,在炎症和纤维化有显著增加集群内积累大量胶原纤维沉积扭曲的小管(3]。我们之前已经证明炎症和纤维化Vhl敲除小鼠治疗后病变可以缓解丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的抑制剂/内切核糖核酸酶(IRE1α)[4]。可能是由于炎症变化proteostasis由于炎性细胞因子的生产过剩5,6]。值得注意的是,被假定炎症发生过程中发挥了至关重要的作用[7),而VHL从慢性炎症mutation-associated ccRCC可能结果3,8]。

同时,VHL众所周知,调节许多基因参与炎症反应。例如,VHL调节的表达MKI67,一个HIF1Α目标基因(9ccRCC[的],标志10),CA9的表达在肾脏的病变也可能参与ccRCC的发病机制。

我们进一步阐明炎症反应Vhl淘汰赛肾脏通过执行中的基因微阵列分析whole-kidney提取(基因表达混合加入GSE116326)。我们使用了whole-kidney提取而不是孤立的小管细胞提取研究反应的微环境的变化Vhl突变细胞。微阵列数据显示候选基因之一,LCN2编码lipocalin 2,高度的过表达Vhl突变的肾脏。

Lipocalin 2,也称为中性粒细胞gelatinase-associated Lipocalin (NGAL),癌基因24 p3, uterocalin,或siderocalin 24 kDa分泌糖蛋白最初纯化小鼠肾脏细胞感染猴病毒40(猿猴病毒40)[11]。LCN2介导细胞过程,包括细胞凋亡、增殖,epithelial-to-mesenchymal分化、稳定和基质金属蛋白酶9 (12]。高水平的LCN2表达式中观察到肾,乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、和脑癌细胞(13- - - - - -15]。此外,LCN2属于lipocalin总科交通疏水分子的蛋白质,如类维生素a、脂肪酸和有机铁螯合剂(16]。也有越来越多的证据表明,LCN2展品的细胞保护作用改善氧化stress-mediated毒性在有害的情况下,如活性氧积累(17- - - - - -19]。

本研究试图探讨LCN2的潜在作用调节炎症反应VHL突变HK-2细胞。此外,我们测试的假设LCN2有关VHLmutation-sensitized巨噬细胞迁移和通过LCN2-ROS-dependent通路介导的炎症。

2。材料和方法

2.1。试剂

美国密苏里州Liproxstatin-1(σ)和4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI热费希尔科学、马、美国)是购买的。

2.2。细胞培养

HK-2(人工肾近端小管上皮)和HEK293(肾来源的人类细胞系)细胞(生物资源收集和研究中心,台湾)培养在T75烧瓶血压得到较好的控制(美国纽约康宁)DMEM /火腿的F12(美国纽约Gibco)补充10%胎牛血清,葡萄糖25毫米,2毫米谷酰胺、丙酮酸钠1毫米,和penicillin-streptomycin (50 U /毫升;σ,密苏里州,美国)37°C的5%的股份有限公司2/ 95%空气孵化器。新鲜的培养基是每隔一天更换一次。一旦细胞达到60 - 70%融合,他们使胰蛋白酶化以下实验。

小鼠单核细胞/巨噬细胞细胞株RAW264.7(生物资源收集和研究中心、台湾)是培养在杜尔贝科T75烧瓶血压得到较好的控制修改鹰的介质(美国纽约DMEM, Gibco)补充10%胎牛血清,4毫米谷酰胺,4500 mg / L葡萄糖、丙酮酸钠1毫米,1500 mg / L碳酸氢钠和penicillin-streptomycin (50 U /毫升;σ,密苏里州,美国)37°C的5%的股份有限公司2孵化器。新鲜的培养基是每隔一天更换一次。一旦达到50 - 60%的细胞融合,他们使胰蛋白酶化以下实验。

2.3。文化主要的肾小管上皮细胞

老鼠主要近端小管细胞(mRTCs)与野生型Hoxb7-Cre-GFP / +(W)或突变Hoxb7-Cre-GFP / +;Vhlfl / fl(M)小鼠使用先前描述的方法(20.- - - - - -22),做了一些调整。简单地说,老鼠被颈椎脱位牺牲。肾脏是立即删除并放置在15毫升锥形管与冰冷的汉克的平衡盐溶液(生物产业、CT、美国)。肾小囊,皮层,并删除多余脂肪,剩下的皮层组织被添加到傻瓜使用两个剃须刀。接下来,柱塞被下推到玻璃的底部5次打破组织。然后,组织被转移到50毫升锥形管在冰上。管状组织在摆动斗离心机转子在500 rpm和4°C 2分钟。然后,上层清液吸气,丢弃的同时保留着完整的颗粒状组织。

之后,充满了温暖的消化管中含有胶原酶(美国新泽西州沃辛顿)140单位/毫升,15毫克大豆胰蛋白酶抑制剂(σ,密苏里州,美国)在20毫升哈佛商学院和孵化一个轨道振动器在70 rpm 15分钟37°C。小管悬挂是混合了10毫升移液管和返回到孵化器每5分钟。消化后,小管悬挂是孵化20毫升的寒冷马血清灭活酶和丰富的小管;管倒到悬挂变得均匀。然后,小管被允许接受一分钟。包含近端小管的上层清液被转移到一家50毫升锥形管和离心2分钟500转斗摆动转子。小管是用10毫升的哈佛商学院和离心机在500转2分钟。增加了体积的1 - 2毫升的培养基混合使用无菌移液管轻轻与颗粒。皮质小管悬挂Percoll轻轻地分层到预制40% / 60%培养基梯度。然后,小管离心机 10分钟在4°C。近端肾小管最大的乐队被转移到50毫升锥形管包含20毫升的培养基和离心机在500转2分钟。

最后,小管颗粒resuspend MRPTC培养基20毫升,由DMEM / F-12文化传媒(美国纽约Gibco)和胰岛素/转铁蛋白/硒(5μg / mL, 5μ5 g / mL, ng / mL,分别0.05σ)μ50 M氢化可的松(σ)μ和光,M L-ascorbic acid-2-phosphate (kouichi东京,日本),和1%的抗生素/抗真菌的解决方案(10000单位/毫升青霉素,链霉素0.1毫克/毫升、和0.25μg / mL两性霉素B、生物产业、CT、美国)。

Dilutional进行研究以确定所需resuspended小管的体积不同的板块,以确保最佳生长。小管镀在12-well (1 - 1.5 mL /)或6-well(3毫升/)Nunclon-treated组织培养板(耐尔根/ Nunc国际,罗彻斯特,纽约)和孵化37°C公司为5%2。媒体每天MRPTC文化传媒所取代。融合可以实现在5 - 12天。

2.4。转染

HK-2细胞转染与炒序列或一个向量向量表达shVHL1 (V1) shVHL3 (V3),或shLCN2 (L1)(请提供的t .许博士,生物医学科学和工程系,国立中央大学,Jhongli,台湾)使用BTX™双子座X2电穿孔系统(BTX、马、美国),根据制造商的协议。简单地说, 细胞转染4μg (100 V的质粒为10毫秒脉冲,在6-well板镀,培养48小时之前被分析VHL通过免疫印迹确定转染效率表达式。

2.5。测量细胞内ROS生成

的分析测量细胞内ROS生成与一些修改(根据我们先前的研究23]。这些细胞被洗与磷酸盐(PBS)和孵化10μM dihydroethidium(她;美国圣克鲁斯、达拉斯、TX)在汉克的平衡盐溶液在37°C在黑暗中30分钟。与ROS孵化期间,她被氧化成为荧光。孵化后,细胞使胰蛋白酶化和洗冰冷的PBS三次。ROS水平量化了流式细胞仪(美国BD生物科学,圣何塞,CA)。

2.6。免疫印迹分析

抗体免疫印迹分析包括鼠标单克隆抗体VHL (BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国);NF -κB p65亚基(美国CA GeneTex欧文分校);物(美国马细胞信号);p-JNK,β肌动蛋白和fibrillarin(美国圣克鲁斯、达拉斯、TX);和兔多克隆抗体LCN2和GAPDH(美国马ABclonal)。的β肌动蛋白稀释1:500年最后一个工作方案;所有其他抗体稀释1:1000。

2.7。核部分提取

趋化性分析与一些修改(根据我们先前的研究23]。核分数从HK-2中提取或mRTC细胞。细胞在低渗的收集和resuspended缓冲区(10毫米玫瑰,pH值7.9;10毫米氯化钾;1.5毫米MgCl2;0.2毫米PMSF;20μg / mL抑肽酶;德勤约0.5毫米;和0.5% NP-40)在冰上15分钟。使离心后 15分钟在4°C,颗粒与基底收集和清洗缓冲(低渗的缓冲区没有NP-40 0.5%)。使离心后再在 15分钟在4°C,颗粒收集和resuspended高渗缓冲(20毫米玫瑰,pH值7.9;400毫米氯化钾;1.5毫米MgCl2;0.2毫米PMSF;20μg / mL抑肽酶;德勤约0.5毫米;0.2毫米EDTA;10%甘油)在室温下30分钟。使离心后 30分钟在4°C,包含核分数的上层清液收集。

2.8。趋化性试验

趋化性分析与一些修改(根据我们先前的研究23]。一个24-well Transwell板(8μm孔隙大小,康宁,美国纽约)是用来衡量RAW274.7细胞的趋化现象的能力。HK-2细胞被添加到众议院和转染载体携带炒或者shVHL24电穿孔)序列。孵化后48小时内,细胞治疗与指定的抑制剂24小时无血清培养基补充5%牛血清白蛋白(BIONOVAS,多伦多,加拿大)。然后, RAW264.7细胞被添加到参议院和一个裸膜无血清培养基补充5%牛血清白蛋白(BIONOVAS,多伦多,加拿大)。在不同的实验中,RAW264.7细胞暴露在重组人类lipocalin 2 / NGAL蛋白质(rhLCN2)(罗福斯生物制品有限公司,美国)添加到无血清培养基及其迁移量。24小时后,迁徙膜的细胞背面参议院沾0.1%结晶紫5分钟,清洗与H2O,并使用一个爱普生V750 PRO扫描仪扫描。结晶紫的细胞使退色甲醇为15分钟,以OD570协同HT(美国VT BioTek)。

2.9。统计分析

数据被表示为 。组比较使用单向或双向方差分析其次是Bonferroni事后分析; 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。VHLMutation-Induced ROS LCN2-Dependent地生产

我们调查的影响VHL缺乏对ROS生产通过测量的ROS水平VHL可拆卸的HK-2细胞使用先前描述的协议(25- - - - - -27]。我们发现VHL击倒在HK-2引起活性氧过剩细胞(图1)。

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图1
VHL HK-2细胞ROS生产的影响。HK-2细胞转染用向量表示一个炒shRNA (SC)或shRNA特定VHL (shVHL1) (V1)(4)通过电穿孔双子座X2系统和孵化48小时。(一)转染后,使用DCFDA细胞内ROS水平测定。(b)使用FACSCalibur分析检测到的荧光强度。所有的数据提出的 。 而炒向量。

LCN2的主要候选基因与免疫反应有关;然而,它的作用在肾脏癌前细胞仍不清楚。我们假设VHLoverexpressing不足引起的炎症和免疫细胞浸润LCN2在HK-2细胞和小鼠原发性肾小管细胞(mRTCs)。VHL可拆卸的发现导致HK-2 LCN2分泌细胞(数字2(一个)和2 (b))。与此同时,LCN2水平升高Vhl突变mRTCs(图3)。有趣的是,提高水平的LCN2中检测出的尿液Vhl条件性基因敲除小鼠(图2 (d))。LCN2在尿液的存在表明急性肾损伤(AKI) [28]。这些发现表明,VHL LCN2缺乏诱导表达和分泌在体外和在活的有机体内。

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图2
VHL可拆卸的诱导LCN2 HK-2细胞分泌。HK-2细胞转染用向量表示一个炒shRNA (SC)或一个成分具体VHL: shVHL1 (V1)或shVHL3 (V3)中描述的一项研究(4)通过电穿孔(双子座X2系统)和孵化48小时。(a)的免疫印迹分析LCN2使用anti-LCN2抗体在50岁μg蛋白质/巷在条件中指定的条件下HK-2细胞。(b)使用ImageJ LCN2是量化的水平。(c)细胞溶解产物受到anti-LCN2抗体免疫印迹分析。(d)同等体积的10μ从野生型和L的尿液样本Vhl分析了条件基因敲除小鼠使用anti-LCN2抗体免疫印迹分析。较低的面板显示的水平LCN2被ImageJ量化。所有的数据呈现的 。 和 。
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图3
LCN2是增加Vhl变异mRTCs。(一)主要老鼠肾小管细胞(mRTCs)被孤立于野生型Hoxb7-Cre-GFP / +(W)或突变Hoxb7-Cre-GFP / +;Vhlfl / fl老鼠(M)。细胞溶解产物经免疫印迹分析表明抗体。β肌动蛋白被用作加载控制。的淘汰赛Vhl证实了分析VHL(上)的水平。(b)使用ImageJ LCN2是量化的水平。所有的数据呈现的 。 。

我们进一步研究的角色LCN2 ROS生产通过检查的影响LCN2可拆卸的ROS水平。ROS水平的增加衰减LCN2击倒的VHL不足(降价)HK-2细胞(图4)。

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图4
LCN2可拆卸的减毒的活性氧产量的增加VHL可拆卸的HK-2细胞。(a)的变化HK-2细胞转染的细胞ROS水平向量表示一个炒shRNA (SC),两个炒shRNA (SC + SC),炒的成分(SC)和shRNA特定LCN2 (L1) (SC + L1), VHL (V3)和炒的shRNA特定成分(SC) (V3 + SC),或成分具体VHL (V3)和shRNA特定LCN2 (L1) (V3 + L1)。(b) ROS生成表示为平均荧光强度。(c)的变化HK-2细胞转染的细胞ROS水平与一个向量表达VHL (V1)和炒的shRNA特定成分(SC) (V1 + SC)或成分具体VHL (V1)和shRNA特定LCN2 (L1) (V1 + L1)。(d) ROS生成表示为平均荧光强度。所有的数据呈现的 。 。
3.2。Vhl突变引起的炎症反应和敏化RAW264.7细胞趋化性LCN2-Dependent的方式

我们通过调查解剖LCN2在炎症的作用的影响LCN2击倒的磷酸化作用物和NF -核易位κB HK-2 p65亚基的细胞和RAW264.7细胞的趋化作用。LCN2击倒被发现明显减弱的增加激活图p-JNK表达式5。LCN2击倒也减少核p65的易位VHL击倒HK-2细胞,免疫印迹(图做了演示6)。

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图5
VHL损失函数LCN2-dependent炎症反应的方式展出。与一个向量(a) HK-2细胞转染表达炒shRNA (SC)的shRNA特定VHL: shVHL1 (V1),或shLCN2 (L1)。细胞溶解产物使用表示抗体和免疫印迹分析。β肌动蛋白被用作加载控制。LCN2的地位和VHL证实了分析LCN2和VHL蛋白的水平,分别。的VHL击倒p-JNK水平增加,但增幅减毒VHL(V3)和LCN2(L1)双击倒的细胞。(b)使用ImageJ p-JNK是量化的水平。与一个向量(c) HK-2细胞转染表达炒shRNA (SC), VHL shRNA具体:shVHL3 (V3),或shLCN2 (L1)。细胞溶解产物分析使用表示抗体免疫印迹。β肌动蛋白被用作加载控制。的可拆卸的LCN2和VHL证实了分析LCN2和VHL蛋白的水平,分别。VHL击倒p-JNK水平增加,但增幅减毒VHL(V1)和LCN2(L1)双击倒的细胞。(d)使用ImageJ p-JNK是量化的水平。所有的数据呈现的 。 和 。
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图6
VHL损失函数引起的核易位p65 LCN2-dependent方式。(一)HK-2细胞培养和治疗,如图所示4。他们的细胞溶解产物收集并分为胞质及核分数。NF -的亚细胞定位κB是由免疫印迹检测使用一个抗体NF -κB亚基p65。β肌动蛋白被用作胞质标记和fibrillarin核标记。(b) NF -κB的胞质定位是减少的VHL击倒(V3)细胞;这种减少是减毒的VHL(V3)和LCN2(L1)双击倒的细胞。胞质p65水平(阶段p65)使用ImageJ量化。(c) NF -κB核本地化的增加VHL击倒(V3)细胞;然而,这样的减毒在增加VHL(V3)和LCN2(L1)双击倒的细胞。核的表达p65(核p65)使用ImageJ量化。(d) HK-2细胞培养和治疗,如图所示4。细胞溶解产物收集和分为胞质及核分数。NF -的亚细胞定位κB使用抗体与免疫印迹检测对NF -κB亚基p65。β肌动蛋白被用作胞质标记和fibrillarin核标记。(e) NF -κB的胞质定位是减少VHL击倒(V1)细胞;然而,减少衰减VHL(V1)和LCN2(L1)双击倒的细胞。胞质p65水平(阶段p65)使用ImageJ量化。(f) NF -κB核本地化增加VHL击倒(V1)细胞;增加减毒VHL(V1)和LCN2(L1)双击倒的细胞。水平的核p65(核p65)使用ImageJ量化。所有的数据呈现的 。 和 。

另一方面,Vhl突变被发现诱导RAW264.7细胞的趋化作用(图7V3 / SC与SC / SC)相比,和LCN2击倒可以减少Transwell RAW264.7迁移引起的VHL击倒HK-2细胞(图7V3 / L1与V3 / SC)。这表明LCN2趋药性的功能是必需的VHL缺乏HK-2细胞。我们确认的趋化作用LCN2通过比较的相对迁移RAW264.7细胞(100 ng / mL)的缺失和存在重组人类LCN2 (rhLCN2)。我们发现LCN2显著诱导RAW264.7细胞迁移后rhLCN2治疗(图8)。总之,我们的研究结果表明,LCN2糖分会让HK-2炎症反应的细胞和巨噬细胞的趋化现象的能力RAW264.7细胞。

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图7
LCN2可拆卸的减毒的VHL inactivation-induced巨噬细胞的趋化作用。HK-2细胞或没有击倒的VHL(V3)或没有(SC)和可拆卸的LCN2(L1)或没有(SC)化验的能力招募单核细胞/巨噬细胞RAW264.7细胞。与向量包含(a) HK-2细胞转染炒shRNA序列(SC)、shVHL3 (V3),或shLCN2 (L1)化验为各自能力诱导巨噬细胞趋化作用48小时。Transwell钱伯斯的肉眼观察。(b)迁移Transwell系统被允许24小时。迁移细胞的相对数量由结晶紫染色测定OD570年。所有的数据提出的 。 和 。
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图8
LCN2显著诱导巨噬细胞细胞迁移。(a)的治疗人类重组LCN2 (rhLCN2) 100 ng / mL RAW264.7细胞迁移而没有增加(0 ng / mL rhLCN2)治疗。(b)迁移Transwell系统被允许24小时。迁移细胞的相对数量由结晶紫染色测定OD570年显示。所有的数据呈现的 。 。

4所示。讨论

炎症反应的机制VHL失活在肾小管细胞提供了一个有趣的病理生理问题和潜在的治疗目标。它已被证明VHL突变细胞参与蛋白质合成增加,活性氧积累(4),可能由于增加mTOR信号突变细胞(29日,30.]。此外,显著提高活化的免疫细胞在炎性疾病可能大大有助于组织损伤。

VHL/Vhl突变导致低氧诱导因子超表达(31日,32]。在低氧诱导因子发生过度,过度的蛋白质合成,从而导致代谢问题,活性氧积累,最终,ER应激。此外,低氧诱导因子过度导致线粒体损伤,柠檬酸循环的破坏,严重的缺氧应激,Warburg效应(30.,33]。

LCN2至关重要的炎症在视网膜变性34],眼部疾病[35],肠道[16,36),缺血性中风(37],牛皮癣[38),心血管疾病(39),酒精性脂肪肝(40,41),非酒精性脂肪肝炎(纳什)[42],muscle-skeletal障碍[43)、肺部感染(44]。然而,LCN2中所扮演的角色VHL-mutation-mediated进展通过调节肿瘤形成的氧化体内平衡和线粒体代谢没有先前的研究。目前的研究表明,突变体VHL诱导活性氧产量LCN2-dependent方式(数字1- - - - - -4)。另一方面,结果还表明,突变体VHL敏化RAW264.7细胞趋化性LCN2-dependent地(数字5- - - - - -8)。多样化的功能角色LCN2例证在中枢神经系统(45]。因此,新出现的证据表明,LCN2有保护以及致病性活动(46- - - - - -48]。我们建议LCN2的双重生物效应可能被认为是在设计针对ccRCC的疗法。

5。结论

我们的结果表明,VHL不足导致生产过剩的活性氧(ROS),而是一个LCN2击倒可以逆转这一过程。VHL缺陷被发现增加在体外和在活的有机体内LCN2表达和分泌。我们的研究结果显示,监管的效果VHL在ccRCC进展可能介导慢性炎症,至少部分通过LCN2-ROS通路(图9)。我们的研究为治疗提供了新的见解衰减ccRCC的发展目标和策略。


图9
方案的机制。击倒HK-2细胞诱导LCN2 VHL基因的超表达和活性氧积累,导致炎症与p-JNK /物比率增加,p65核易位,巨噬细胞趋化作用。结果显示VHL的监管效果通过LCN2-ROS通路在HK-2炎症细胞。

数据可用性

原始数据用来支持本研究的结果都包含在这篇文章。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

我们表达感谢的研究助理,Yi-Ying林太太和Ming-Cheng李,核心实验室部门的研究,台北慈济医院,佛教慈济医疗基金会新台北市,台湾的援助与流式细胞术和免疫印迹,分别。本研究支持的台北慈济医院,佛教慈济医疗基金会新台北市,台湾(tcrd - tpe - 109 - 06赛季和109 - 2320 - b - 303 - 004 - my3)。