文摘

目标。抑制钙/钙调蛋白- (CaM)依赖激酶2 (CaMKII)是与癫痫相关。然而,基于学习和记忆障碍的具体机制,CaMKII抑制神经元死亡尚不清楚。材料和方法。在这项研究中,KN93, CaMKII抑制剂,用于研究在epileptogenesis CaMKII的角色。我们首次发现差异表达基因(度)主要培养海马神经元有或没有使用RNA-sequencing KN93治疗。然后,学习和记忆的损伤KN93-induced CaMKII抑制使用莫里斯水迷宫测试评估。此外,免疫印迹、免疫组织化学和TUNEL染色法进行确定神经元死亡,细胞凋亡和相关信号通路。结果。KN93-induced CaMKII抑制减少营地反应元件结合蛋白(分子)活动与学习和记忆受损纯种和震颤(TRM)大鼠的遗传癫痫动物模型。CaMKII也抑制诱导神经元死亡和反应性星形胶质细胞的激活在纯种和TRM海马,解除对增殖蛋白激酶。同时,神经元死亡和神经元细胞凋亡主要观察PC12和培养海马神经元接触KN93后,由SP600125逆转,c-Jun n端激酶的抑制剂(物)。结论。CaMKII导致学习和记忆障碍和抑制细胞凋亡,这可能是与物特异表达信号有关。

1。介绍

癫痫是一种慢性神经系统疾病的特征是不自然的,快速放电的神经元(1,2]。地震鼠(TRM) (tm / tm)一直在培养Kyoto-Wistar殖民地(3)和遗传癫痫是一个有利的模式动物,因为人类癫痫发病机制相似的情况。我们先前的研究发现异常变化CaMKII通路参与epileptogenesis TRM老鼠(4- - - - - -11]。CaMKII是多个信号通路的重要调节器由钙信号。首先,CaMKII夫妇和calcium-bound钙调蛋白和目标底物磷酸化神经元,如电压门控钠通道、增殖蛋白激酶(MAPKs),和营地的反应元件结合蛋白(分子)12- - - - - -14]。此外,CaMKII广泛分布在海马和皮层(15]。减少CaMKII水平已报告在各种癫痫模型16- - - - - -19]。然而,在epileptogenesis CaMKII的功能仍然是未知的。

一系列的研究表明,MAPKs,包括细胞外signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2), p38 MAPK, c-Jun n端激酶(物),参与许多细胞通路引发的细胞外凋亡刺激,也扮演着关键的角色在细胞死亡和生存20.,21]。生物信息学的研究可以揭示MAPK通路如何影响记忆丧失的潜在分子机制在颞叶癫痫(框架)22]。

分子是一种转录因子,发挥重要的生理生化作用结合营地的保守序列响应元素,主要参与重建,学习和记忆的神经元(23]。此外,展品分子神经保护作用表达式是调节,从而增加prosurvival基因的表达(24]。然而,MAPK信号变化和分子在癫痫和CaMKII的关系尚未阐明。

说明的上下文中CaMKII癫痫的影响,我们使用KN93,特定CaMKII抑制剂,在癫痫模型在体外和在活的有机体内。在目前的研究中,第一次,我们的数据表明,抑制CaMKII有助于学习和记忆障碍与物特异表达和细胞凋亡相关的信号。

2。材料和方法

2.1。动物药品监督管理局

男性和女性的野生纯种和TRM老鼠(12周大,50%的男性和50%的女性)被单独安置在一个标准的环境。所有的老鼠被允许获得水和食物随意和安置在控制的情况下适当的温度12小时光/暗周期。老鼠被分为三组,包括控制,低剂量和高剂量组。大鼠对照组有脑室丸的磷酸盐(PBS)包含DMSO和sulfobutylether -β环糊精(SBE -βcd)。低剂量组大鼠服用9μ克/公斤体重KN93(美国Tocris、达拉斯、TX),和那些在高剂量组管理18μKN93克/公斤体重。侧脑室注射都是表现在一个体积为5.5μl在这项研究中,我们在修改管理KN93浓度较剂量选择Sprague-Dawley老鼠第七天(P7)产后25]。我们使用低和高剂量的KN93在活的有机体内实验。机构中国医科大学动物保健和使用委员会证实了实验的计划和程序。动物是处理KN93 24小时。在在体外实验,细胞被处决的孵化5μM KN93在DMSO 24小时。对照组被暴露在DMSO溶液在海马神经元主要培养和PC12细胞。

2.2。西方墨点法

bicinchoninic酸(BCA)蛋白质评估工具包(Beyotime、上海、中国)来量化提取蛋白质的样品。蛋白质样品使用sds - page分离。随后,被转移到PVDF膜的蛋白质。膜是孵化夜间小时4°C包含以下主要抗体:鼠标anti-caspase-3 (1: 500;美国圣克鲁斯、达拉斯、TX),兔子anti-Bcl-2 (1: 500;美国圣克鲁斯、达拉斯、TX),兔子anti-cytochrome c (1: 500;美国圣克鲁斯、达拉斯、TX),兔子anti-NeuN (1: 5000;Abcam,剑桥,英国),兔子anti-GFAP (1: 500;美国圣克鲁斯、达拉斯、TX),兔子anti-CaMKII (1: 500;美国圣克鲁斯、达拉斯、TX),兔子anti-phospho-CaMKII(刺- 286; 1 : 500; Santa Cruz, Dallas, TX, USA), rabbit anti-ERK1/2 (1 : 500; Santa Cruz, Dallas, TX, USA), goat anti-phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204; 1 : 500; Santa Cruz, Dallas, TX, USA), mouse anti-JNK (1 : 500; Santa Cruz, Dallas, TX, USA), mouse anti-phospho-JNK (Thr183/Tyr185; 1 : 500; Santa Cruz, Dallas, TX, USA), rabbit anti-p38 (1 : 500; Santa Cruz, Dallas, TX, USA), rabbit anti-phospho-p38 (Thr180/Tyr182; 1 : 500; Santa Cruz, Dallas, TX, USA), rabbit anti-CREB (1 : 500; Santa Cruz, Dallas, TX, USA), goat anti-phospho-CREB (Ser133; 1 : 500; Santa Cruz, Dallas, TX, USA), and anti-β肌动蛋白(1:1000;美国圣克鲁斯、达拉斯、TX)。膜被洗多次在TBS和孵化利用辣根peroxidase-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白g (1: 5000;圣克鲁斯、达拉斯、Sas)在环境温度为1小时或辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 5000;圣克鲁斯、达拉斯、Sas) 2小时,控制加载,β肌动蛋白是就业。增强化学发光(ECL)工具包来观察免疫反应。同样,CaMKII被实现为一个加载控制p-CaMKII评估。

2.3。莫里斯水迷宫测试

动物受到莫里斯水迷宫,包括导航评估和调查分析,连续七天,如前所述26]。简单地说,老鼠被允许自由游泳1分钟没有一个平台实验基线(天0)。在训练的日子里,一个平台是在水箱里的水进行导航评估每一鼠一天四次测试和一个60秒的间隔空间的收购。如果老鼠不能检测平台在60秒,他们捡起和位于平台在接下来的60秒钟。所需的时间和路径长度为每个老鼠找到隐藏的平台在每个实验观察。在第六天,我们使用探索性测试来评估记忆的巩固。在目前的实验中,该平台从坦克和消除老鼠被允许自由游泳60秒钟。我们选了一个位置,从原始的位置是180°平台作为新起点,确保内存容量为目标位置可以反映在空间偏好,而不是一个特定的路径的游泳。每个老鼠的频率通过象限的中心和时间的百分比,老鼠住在象限中观察到60秒。一个视频跟踪系统(成都Taimeng科技有限公司,成都,中国)被用来记录所有数据。

2.4。甲苯基紫染色

评估大脑的形态改变,大脑部分准备随机,尼氏小体沾甲酚紫(简历)。解散甲酚紫醋酸(0.5 g的水晶粉)是在蒸馏水(500毫升)含1.25毫升的冰醋酸与电磁搅拌器60°C。Deparaffinized和患者部分简历染色法染色,利用0.1%解决方案(50 - 60分钟)和固定在中性胶解决方案。CV-stained日冕部分使用光学显微镜测定。在海马锥体神经元的形态特征(CA1和CA3)和颗粒细胞在DG区进行了分析。此外,细胞密度是评估使用ImageJ软件。

2.5。免疫荧光染色

冷冻老鼠大脑切片与PBS洗之前被屏蔽5% BSA阻断缓冲区(Solarbio,北京)在室温下(45分钟)。片是孵化(隔夜在4°C)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)兔多克隆抗体(1:200;Bioswamp,武汉,中国)。片被洗PBS和孵化在室温下(1 h)使用DyLight 488年,山羊anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 200;Abbkine,武汉,中国)。核与DAPI染色(1:100;中国,北京,Solarbio)。用共焦显微镜和捕获的图像进行了分析使用ImageJ。

2.6。TUNEL染色

TUNEL染色后进行一步的手册中描述的标准协议TUNEL细胞凋亡测定工具包(Beyotime、江苏、中国)。的凋亡细胞双immunofluorescent彩色TDT-mediated dUTP缺口末端标记(TUNEL)试验(绿色)和核反击DAPI染色(蓝色)。

2.7。PC12细胞系文化

冷冻细胞种子在30分钟37°C,重新注入培养基的培养皿。细胞的形态学观察每6小时。当菜肴文化汇合的出现,细胞液体在培养皿中丢弃。然后,细胞慢慢转移到预热无血清培养基,洗了三次。胰蛋白酶是添加到媒体,观察细胞的状态。完全消化后,介质被添加到终止消化和细胞悬液离心。然后,浮在表面的游离和100年被抛弃了μL DMSO(细胞冷冻保存方案)补充道。牛和马血清悬挂(900μL)补充道,和细胞转移到低温贮藏管梯度低温贮藏。

2.8。主要海马神经元培养

新生儿出生后两天内,纯种老鼠幼崽是麻醉和斩首;大脑很快被删除,浸泡在汉克的解决方案,并存储在4°C。海马体在显微镜下解剖迅速冰浴,和海马组织三次打扫干净了冷冻细胞培养基(5毫升测距装置/ F-12;美国HyClone,洛根,UT)。海马组织和2毫升果胶酶消化,轻轻地搅拌两次。细胞悬液是删除与果胶酶重复这个过程,直到完全消化。消化后,细胞均匀混合培养基从海马神经元和纹理。Half-volume介质取代了每隔一天24小时后细胞的粘附。细胞培养7天后,观察神经元状态了9天,随后的实验。

2.9。细胞计数设备8细胞毒性试验(CCK8细胞毒性测试)

细胞亚文化过程是重复的,和细胞悬液被转移到一个板包含96井5000 - 7000细胞/(注意混合)。后坚持细胞壁,细胞与不同浓度的药物处理(0、0.1、0.3、1、3、10、30和100)24小时和最后的反应体积是100μl .然后CCK-8试剂添加1:10比和细胞培养2小时。450纳米的吸光度是评估采用酶联免疫吸附试验(ELISA)。如果吸光度是不符合标准,每30分钟吸光度是重新度量界限。细胞的存活率是评估通过以下方程:

2.10。RNA序列和数据分析

RNA-sequencing是由武汉SeqHealth科技公司。细胞接受KN93和车辆控制(DMSO)收获和RNA的提取进行了采用试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。RNA图书馆准备第一,之后HiSeq X 10音序器(Illumina公司)是用来丰富和序列产品的大小不等,从200到500个基点。共同调节或差异表达基因表达下调(度)选定数据集提取的截止条件 和 。生物信息获取是基于生物功能注释信息。度被合并成一个基因列表提交给大卫,一个生物信息数据库,为功能注释。我们进一步进行基因本体论(去)富集分析。

2.11。流式细胞术

在冰浴,细胞被离心与胰蛋白酶消化,然后颗粒状。绑定缓冲(4毫升)与36毫升的去离子水混合,和绑定缓冲试剂稀释10倍。这些细胞被洗了900μL PBS。暂停在1000转离心5分钟。消除后上层清液,细胞和1000轻拂μL绑定缓冲和离心5分钟。上述过程重复两次。离心后,上清液与1000年被和细胞悬液治疗μL绑定缓冲是保留在每个管。除了π单染色和空白对照组,5μL (FITC(绿色)每管增加了10分钟。此后,π(5μL)添加每管1小时。然后,300年μL PBS被添加到每个管和流式细胞术。染色和数据统计:FITC的π的细胞凋亡和细胞凋亡。第四季度:早期;Q2:晚;Q1:坏死。一般由细胞损伤 。

2.12。统计分析

SPSS(11.5版本;美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)是用于统计评估,和所有分析师对每组的治疗也不清楚。所有的成就都表示为 。学生的 - - - - - -测试或方差分析之后,图基的测试被执行。 是为了说明统计意义。

3所示。结果

3.1。识别度的主要培养海马神经元受CaMKII抑制

我们确定度的RNA序列主要培养海马神经元的两组(车辆24小时,5μM KN93 24小时)。图1(一)说明了404年KN93-treated神经元调节基因和511个表达下调基因与未经处理的控制。基因表达水平差异KN93-treated和未经处理的对照组,基于标准 和 ,如图1 (b)和火山映射如图1 (c)。915度受到富集分析(数据1 (d)和1 (e))。这些表达下调度是有关认知(去:0050890,22个基因),学习或记忆(去:0007611,18个基因)和长时记忆(去:0007616、6基因),这表明CaMKII抑制会导致学习和记忆障碍。

3.2。CaMKII抑制诱发学习和记忆障碍纯种和TRM老鼠

基于RNA序列分析的结果,我们检查下是否CaMKII抑制导致学习和记忆障碍。根据一项研究,我们KN93注入成人TRM大鼠右心室( )的剂量30μg每公斤体重(25]。然而,所有的TRM老鼠死后30μ克/公斤体重KN93 ( )。考虑到毒性,KN93的剂量减少到18岁μ克/公斤体重( )。正如预期的那样,KN93 18岁时的剂量μ克/公斤体重没有造成死亡的老鼠。因此,我们认为,18岁μ克/公斤体重KN93可能方法的最大容许剂量TRM老鼠。KN93是用于两个不同剂量(18 - 9所示μ克/千克体重为高、低剂量,分别在后续实验。

然后我们调查KN93治疗是否影响学习和记忆在纯种和莫里斯TRM老鼠进行水迷宫测试(图2)。一天比一天,逃避延迟高集团(TRM与群Wistar鼠相比,与类似的结果路径长度,超过的控制( , ,数据2(一个)- - - - - -2 (c))。的频率传递整个目标KN93-treated Wistar鼠(高剂量)低于观察纯种老鼠的对照组( , ,图2 (d))。的频率传递整个目标KN93-treated TRM老鼠相比,下降的控制( , ,图2 (d))。类似的结果观察时间在目标象限(图2 (e))。

之前的调查表明,组蛋白demethylase PHF2能够提高分子信号通路通过调控相关的基因记忆(27]。我们下决定了分子的表达水平在纯种和TRM治疗后大鼠KN93使用西方墨点法。的表达p-CREB KN93-treated TRM老鼠是减少与控制老鼠( , ,数据2 (f)和2 (g))。此外,的表达在Wistar鼠p-CREB KN93的应用(高、低剂量)的价格相比显著降低控制Wistar鼠( 和 , ,数据2 (f)和2 (g))。此外,p-CREB水平在TRM老鼠KN93管理(高剂量)相比,减少了控制TRM老鼠( , ,数据2 (f)和2 (g))。因此,CaMKII抑制由KN93治疗诱导学习和记忆障碍纯种和TRM老鼠。

3.3。CaMKII抑制体内和体外诱导神经元死亡

老鼠一直在观察和监督,通过调节CaMKII-related信号通路、细胞凋亡和炎症可以抑制28]。因此,我们研究是否CaMKII抑制诱导神经元死亡TRM老鼠。我们检查的影响KN93使用简历染色和星形胶质细胞免疫荧光染色。死细胞被公认的形态和凝聚核大小和形状的变化。锥体和颗粒细胞的细胞核具有很好的描述核膜和核仁明显可见被确认为活细胞。如图3(一个)KN93(高剂量)诱导的神经元死亡DG, CA3,海马的CA1区域地区TRM和控制Wistar鼠。GFAP星形胶质细胞是一种特殊的标记。如图3 (b)KN93(高剂量)星形胶质细胞激活诱导的大鼠海马CA3区域的四组。其余的区域的GFAP免疫荧光染色是补充图所示S1。神经元标记NeuN和星形胶质细胞标记GFAP的表达使用免疫印迹分析,显示在图3 (c)。的表达NeuN控制纯种和高剂量KN93-treated TRM老鼠的价格相比显著降低控制纯种和TRM老鼠( , ,数据3 (c)和3 (d))。然而,GFAP的表达水平控制纯种和高剂量KN93-treated TRM老鼠显著增加与检测控制纯种和TRM老鼠( , ,数据3 (c)和3 (d))。总之,我们的结果表明,CaMKII抑制诱导神经元死亡和反应性星形胶质细胞的激活在纯种和TRM鼠海马。

此外,我们决定使用CCK8 KN93在细胞的浓度效应曲线分析。如图3 (e),细胞存活率下降KN93浓度增加,25岁μ摩尔计算half-maximal抑制浓度(IC₅₀)的KN93 PC12细胞。NeuN在PC12细胞的蛋白表达和主要培养海马神经元KN93-processed组比,较小的控制( 和 ,分别 ,数据3 (f)和3 (g))。总之,CaMKII抑制KN93治疗引起神经元死亡在体外和在活的有机体内。

3.4。CaMKII抑制凋亡在纯种和TRM老鼠的海马

我们下一个调查CaMKII是否可以诱导神经细胞凋亡抑制TRM老鼠。令人惊讶的是,我们发现凋亡细胞被显示在CA1, CA3, DG的区域控制纯种和TRM老鼠后KN93管理局通过TUNEL染色图(高剂量)4(一)。然而,凋亡细胞未出现在未经处理的纯种和TRM老鼠的海马。接下来,我们检测到的表达蛋白,与细胞凋亡相关(图4 (b))。Caspase-3表达增加海马的纯种和TRM治疗后大鼠的高剂量的KN93(所有 , ,数据4 (b)和4 (c))。此外,蛋白质表达的细胞色素c TRM海马增加相比,在控制Wistar鼠( , ,数据4 (b)和4 (c))。因此,CaMKII KN93治疗诱导细胞凋亡的抑制海马神经元的纯种和TRM老鼠。

3.5。CaMKII抑制就是说MAPK信号在纯种和TRM老鼠

MAPKs非常重要在调节细胞的生理活动,包括细胞凋亡(29日,30.]。因此,我们决定MAPK表达水平在纯种和TRM KN93管理后大鼠。我们发现p-ERK表达TRM老鼠没有差别的价格相比健康的老鼠。然而,表达水平的p-ERK控制Wistar鼠的海马神经元和TRM KN93治疗后大鼠显著降低与控制纯种和TRM老鼠(中发现 , ,数据5(一个)和5 (b))。此外,与控制Wistar鼠相比,p-JNK TRM老鼠增加(的表达 , ,数据5 (c)和5 (d))。的海马神经元的表达p-JNK控制Wistar鼠治疗后KN93(高、低剂量)的价格相比大幅提高控制Wistar鼠(所有 , ,数据5 (c)和5 (d))。此外,p-JNK表达调节与KN93 TRM治疗后大鼠海马(高剂量)的价格相比治疗TRM组。然而,p-p38的表达改变与KN93 TRM和Wistar鼠治疗后(所有 , ,数据5 (e)和5 (f))。总之,CaMKII KN93治疗MAPK信号特异表达抑制的纯种,TRM老鼠。

3.6。p-JNK信号通路参与通过CaMKII抑制细胞死亡

接下来,我们测试是否ATP-competitive物抑制剂,SP600125, KN93-induced细胞死亡的影响在体外。首先,CCK8试验是用于定义p-JNK抑制剂的效果(SP600125) KN93-treated细胞死亡,如图6(一)。我们发现,治疗25μ10 M KN93-treated细胞μM和20μM SP600125增强细胞生存,而SP600125-untreated组(所有 , ,图6(一))。免疫印迹结果表明NeuN和p-JNK组中表达降低接收SP600125和KN93表达在PC12细胞减少,主要培养神经元的价格相比SP600125-untreated组(所有 , ,数据6 (b)和6 (c))。因此,p-JNK参与的信号通路通过CaMKII抑制细胞死亡。

3.7。p-JNK通过CaMKII抑制信号通路导致细胞凋亡

我们调查是否p-JNK信号参与通过CaMKII抑制细胞凋亡在体外。第二季度和第四季度的表达减少SP600125和KN93组与SP600125-untreated细胞相比,表明SP600125逆转KN93-induced细胞凋亡( , ,数据7(一)和7 (b))。接下来,几个apoptosis-related发现蛋白质和代表乐队在图所示7 (c)。表达caspase-3,伯灵顿,细胞色素c是调节,但在PC12细胞和bcl - 2减少的主要接受KN93海马神经元,而未治疗组(所有 或 或 , ,数据7 (c)和7 (d))。这些数据表明,KN93激活凋亡通路,诱导细胞凋亡后24小时内管理。此外,政府一起SP600125 KN93 caspase-3的表达减少,伯灵顿,细胞色素c和bcl - 2表达增加,主要在PC12细胞和海马神经元,而SP600125-untreated组(所有 , ,数据7 (c)和7 (d))。因此,管理p-JNK抑制剂SP600125逆转这些apoptosis-related蛋白质的变化,表明p-JNK信号参与通过CaMKII抑制细胞凋亡。

4所示。讨论

我们的研究的目的是发现CaMKII的影响在癫痫和证明其与神经元死亡的关系。我们发现治疗KN93 24小时诱导细胞死亡在正常和TRM老鼠。KN93的浓度在这项研究中的应用是基于之前的研究,使用的重量Sprague-Dawley产后7天(P7)来确定KN93剂量(25]。CaMKII钙的信号是一个重要的组件,和它的作用往往是讨论31日]。作为小分子抑制剂,CaMKII KN93已被证明是神经保护反对excitotoxic侮辱在体外(32,33]。此外,CaMKII执行生存至关重要的任务,会引起的神经元(34]。在我们的研究中,我们发现神经毒性,但不是神经保护,被诱导在活的有机体内和在体外由KN93,表明持续CaMKII抑制(24小时)导致毒性作用在体外和在活的有机体内。

分子磷酸化是各种细胞外信号转导过程的关键,在下游靶基因的激活和扮演的角色参与癫痫的发生和发展35]。先前的研究已经表明在癫痫动物模型和分子的表达升高癫痫患者。分子在海马神经元的表达明显增加,与对照组相比,增加持续了至少8周的癫痫毛果芸香碱小鼠模型(36]。此外,p-CREB表达式在颞叶皮层在颞叶癫痫患者,增强与集团的控制(37]。然而,减少表达p-CREB中检测出pentylenetetrazol-kindled老鼠与控制老鼠相比,表明一个有争议的结果p-CREB水平不同的癫痫模型(38]。在我们的研究中,表达的p-CREB TRM老鼠的价格相比是减少控制老鼠。此外,p-CREB在纯种的表达与KN93 TRM大鼠治疗后明显降低与控制未经处理的动物相比,表明CaMKII p-CREB水平抑制可能与癫痫相关模型。

主要是分子参与神经重构,学习,记忆在大脑成熟的(23]。Ca^{2 +}涌入,CaMKII和慢性癫痫大鼠模型海马的分子可能与受损的空间学习和记忆(38,39]。我们发现TRM老鼠表现出减少分子表达和逃避延迟和路径长度高于对照组,表明癫痫大鼠表现出认知障碍。KN93治疗组的路径长度增加,以及传递的频率在目标和时间控制的目标象限低于纯种老鼠组。因此,我们的主要发现是,CaMKII抑制诱导认知障碍在纯种和TRM老鼠。

此外,观察神经元细胞凋亡在KN93管理在活的有机体内和在体外实验中,尽管先前的研究表明,凋亡细胞死亡并不是在SER发现老鼠(40]。还被认为是最重要的因素参与程序性细胞死亡在不同的脑损伤实验模型,就像癫痫模型。这些酶通常以潜在的形式存在于细胞质中,在后期被激活的细胞凋亡。细胞色素c,当释放到细胞质中,结合apoptosis-related因子1 (Apaf-1) dATP激活半胱天冬酶家族和诱导细胞凋亡。Caspase-3是细胞凋亡的一个重要中介在癫痫41,42]。在这项研究中,KN93治疗导致增强caspase-3水平的激活。然而,bcl - 2的表达,线粒体膜上发现的凋亡蛋白,细胞色素c在KN93管理调节在体外,这表明持续CaMKII抑制(24小时)导致神经元凋亡。

MAPK通路丰富在中枢神经系统(CNS)。细胞外的刺激,如神经递质、神经营养因子,生长因子,可能影响突触传递和细胞生存通过MAPK通路(43- - - - - -45]。MAPK家族包含ERK1/2、物和p38 MAPK的蛋白质(46]。MAPKs主要因素调节突触的兴奋性,参与监管的认知障碍和癫痫动物模型与人类疾病47,48]。最近的一项研究发现,MAPK活性显著大于pentylenetetrazole-kindled老鼠相比,控制集团(49]。p-ERK的表达也增加了自发性癫痫发作期间pilocarpine-induced后癫痫持续状态(50]。阻塞ERK1/2信号阻止大鼠癫痫样的行为(51,52]。此外,一些研究已经表明,物异常激活在癫痫模型和细胞死亡有关53,54]。p38抑制剂SB203580减少海马病理损害和减少癫痫的频率55]。在我们的研究中,异常表达观察MAPKs TRM老鼠,但只有表达水平的p-JNK控制纯种和TRM老鼠在治疗后显著增加KN93相比与未经处理的动物。此外,在KN93-induced apoptosis-related蛋白质细胞死亡的变化被p-JNK抑制剂SP600125管理逆转,表明p-JNK癫痫神经元死亡的可能是一个潜在的治疗目标。

5。结论

我们的研究表明,KN93-induced CaMKII抑制导致学习和记忆障碍,神经细胞死亡,细胞凋亡与p-JNK特异表达有关。根据上述实验数据,我们发现细胞死亡在癫痫部分是由于CaMKII的抑制。细胞死亡的CaMKII抑制KN93治疗的持续时间和浓度有关。然而,阐明精确的底层机制需要进一步研究。这些实验数据为了解癫痫的发病机理奠定基础,阐明CaMKII的毒理学效应和机制由KN93抑制。

数据可用性

(数据类型)的数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

王W.Y.和f .郭设计研究。J.L.王X.X.徐W.Y.贾,共晶赵,f .郭进行了实验。J.L.王t . Boczek Q.H.高,傅y、m .他Q.H. Wang R.X. Shi, x, M.X. Li和y通分析数据。共晶点、王W.Y.和f .郭敬明写的纸和批准了手稿。

确认

这项工作是支持由中国自然科学基金会(授予数量:81971212,81471323,81601129)和开放基金的教育部重点实验室对中医藏象理论和应用,辽宁中医药大学(zyzx1810)。

补充材料

图S1: CaMKII抑制诱导海马星形胶质细胞活化的纯种,TRM老鼠。a代表图像显示GFAP免疫荧光染色的海马的CA1和DG地区Wistar鼠,TRM老鼠,KN93-treated Wistar鼠,KN93-treated TRM老鼠。酒吧规模:100μm。b .分析数据显示的相对强度Wistar鼠的海马区GFAP蛋白的表达,TRM老鼠,KN93-treated Wistar鼠,KN93-treated TRM老鼠。 ,与控制纯种群; ,相比之下,控制TRM组; ,与控制纯种群; ,相比之下,威斯塔集团控制。(补充材料)