缺乏抗氧化Paraoxonase 2 (Pon2)导致表型LT-HSCs数量的增加和干扰红细胞生成

文摘

背景。长期造血干细胞(LT-HSCs)驻留在骨髓里,严格控制活性氧(ROS)水平。ROS增加结果LT-HSC分化和干细胞的疲劳。Paraoxonase 2 (PON2)已被证明是重要的ROS控制。目标。我们调查的失活的影响PON2基因对造血细胞分化和活动。方法和结果。在年轻的老鼠灭活Pon2基因(Pon2^{- / -},< 3个月),我们观察到增加LT-HSCs和降低频率的祖细胞。在竞争激烈的移植,年轻Pon2^{- / -}BM公司WT BM在早期的时间点。ROS水平显著提高Pon2^{- / -}整个BM,但不是Pon2^{- / -}LT-HSCs。在造血干细胞的分化阶段,Pon2缺乏导致misbalanced红细胞生成在生理和压力条件。在老年小鼠(> 9个月),Pon2损耗引起的增加LT-HSCs以及水平的提高粒细胞/巨噬细胞祖细胞(gmp)和骨髓倾斜,表明过早衰老表型。ROS水平无显著变化Pon2^{- / -}LT和短期(ST)肝星状细胞观察,但显著减少自发凋亡细胞死亡是测量。RNA-seq分析Pon2^{- / -}LT-HSCs确定群体的基因参与C-X-C趋化因子受体4 (Cxcr4)信号类型,提出补偿机制来克服ROS-mediated造血祖细胞加速老化。结论。总之,我们目前的数据表明,PON2参与调节HSC的功能。

1。介绍

有氧新陈代谢是不可避免地与生产活性氧(ROS)如过氧化物、过氧化氢、羟自由基,可能产生有害的影响正常的细胞功能(1]。严格平衡ROS的生成和解毒可以调节细胞生理学和发展通过氧化还原信号(低浓度的ROS作为信号分子在生理过程)(2)和氧化应激(高浓度的活性氧超过细胞的解毒能力)。氧化应激导致的破坏蛋白质、DNA、膜脂质(3并被描述参与致癌作用[4),心血管疾病(5),和老化6]。

paraoxonase家族(其)酶包括三个蛋白质PON1, PON2,和PON3酶活性不同,定位和监管7]。PON2坐落专门细胞表达蛋白(8]。PON2发挥抗氧化和抗炎功能和显示重要的影响在疾病由氧化应激(9]。PON2调节线粒体功能和减少过氧化物的释放从内线粒体膜10]。对脂质过氧化(PON2还显示一个保护作用11和细胞内活性氧的形成12]。最近我们组显示,氧化还原调控特异表达与灭活老鼠Pon2基因(Pon2^{- / -})导致内皮功能障碍、血管炎症和组织因子依赖高凝结状态(13]。由于其抗氧化活性,抗凋亡的功能PON2也被描述在mitochondria-related [14和ER应激相关12细胞凋亡。

造血作用描述的分层次协调生产所有血液细胞与造血干细胞(hsc)坐在顶端。肝星状细胞的特点是他们的终身自我更新能力和分化成所有血统能力承诺祖细胞(1]。维持造血作用,紧密的分化和自我更新之间的平衡在肝星状细胞必须严格监管15]。这种平衡缺陷导致造血不足和/或造血系统恶性肿瘤的发展。在成年有机体,大多数肝星状细胞是位于骨髓(BM)。不同的细胞类型,可溶性因子,和解剖结构维持HSC协作功能。这种微妙的环境称为“利基”[16]。大英博物馆小众,特别是骨内膜的利基市场的特点是低氧浓度。更限制进入的氧气可能会导致降低ROS水平。分析表明,活性氧是重要的调节干细胞的自我更新和分化之间的平衡。ROS水平低是重要的保持multipotency这些细胞,而较高的活性氧水平将提交限制血统(17,18]。利基的低氧张力支持肝星状细胞的自我更新能力和保持静止。自我更新的肝星状细胞使用无氧糖酵解作为主要能源来源适应低氧条件和满足HSC的相对较低的能源需求19]。然而,线粒体氧化磷酸化的程序如果肝星状细胞开始繁殖和分化20.]。因此,原始的多功能静长期(LT) HSC位于骨内膜的利基(21]。此外,ROS水平受到严格监管的内在机制,例如,通过转录因子调控FoxO1-3 [22]。

干细胞再生细胞或组织的能力随年龄增长而下降(23]。年轻的动物相比,老年动物的肝星状细胞显示定义的差异,如功能导航和分化的变化(24),增强活性氧产量、炎症和细胞凋亡(25,26]。在老年生物,造血作用上显示一个优惠代髓细胞淋巴细胞为代价的。这种所谓的骨髓扭曲和相关免疫衰老似乎源于myeloid-committed造血干细胞和祖细胞的克隆扩张(公司)和减少lymphoid-committed公司(24,26]。

红细胞承诺的过程和differentiation-termed“红细胞生成代表另一个重要的“关卡”ROS-dependent监管(27]。红细胞生成结果生产红细胞(红血球)[28从巨核细胞/红细胞前体细胞(议员)28]。红细胞前体细胞暴露于最高的ROS水平;然而,类似于LT-HSCs,他们还拥有大量的防御机制对活性氧和其他侮辱(29日]。ROS的重要性红细胞成熟支持例如血液参数异常的遗传性疾病,导致抗氧化防御机制不足/减少[30.- - - - - -32]。

如上所述,HSC大多是静止的,显示低代谢活动与无氧糖酵解的依赖,容易刺激和氧化应激的影响。PON2是一种抗氧化剂和抗凋亡酶。除了其在心血管系统的重要作用,抗氧化/凋亡的影响似乎PON2利用不同的肿瘤细胞类型,加强增长和抵抗化疗(33]。尽管PON2表达与病理的不同形式的白血病(33],PON2在造血的作用还没有被分析。因此,当前的研究是进行分析的一般PON2参与造血作用。

2。材料和方法

2.1。材料

所有细胞文化品位塑料材料是来自他一一Bio-One, Frickenhausen,德国、或SARSTEDT Numbrecht,德国。所有的化学物质(如不是另有规定),胎牛血清,从鼠血清免疫球蛋白,RPMI 1640年,杜尔贝科的磷酸盐(PBS)蛋白酶K, Taq来自σ,Deisenhofen,德国。CM-H₂DCF-DA得到从分子探针/热费希尔科学、Dreieich,德国。l - 012 (8-amino-5-chloro-7-phenyl-pyrido [3,4 - d] pyridazine-1, 4 (2 h、3 h)土卫四)和光化学物质,是来自kouichi美国里士满青霉素和链霉素溶液(100 x;10.000 U /毫升青霉素,10.000μg / ml链霉素),杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)和GlutaMax™得到从Gibco /热费希尔科学、Dreieich,德国。高容量cDNA逆转录工具包和大角星®PicoPure®RNA隔离设备从应用生物系统公司购买,达姆施塔特,德国。peqGOLD总RNA工具包,peqGOLD TriFast™,和dNTP-Mix从Peqlab购买,达姆施塔特,德国。PrecisionPLUS 2 x qPCR MasterMix SYBR绿色得到从引物设计、钱德勒的福特,联合王国。Anti-Rat /仓鼠搞笑,κ/负控制(的边后卫 )补偿粒子集,BD Cytofix / Cytoperm™固定/透化作用工具包,BD™CompBeads, PE膜联蛋白V凋亡检测装备,反- ki - 67抗体,和烫/清洗缓冲来自BD生物科学,德国海德堡。

2.2。细胞培养

小鼠造血前体cell-7 (HPC-7 [34])和BA / F3 pro B细胞(35)如前所述培养(36]。分析活性氧的影响发电机2,3-dimethoxy-1, 4-naphthalenedione (DMNQ) [37),这些细胞被镀6-well盘子和处理10μM DMNQ(解决在DMSO)或DMSO(控制)2 - 8 h。

2.3。老鼠和动物研究的批准

PON2-deficient老鼠产生loxP-site侧面插入,β-geo-containing基因陷阱向量Pon2基因内区2 (38]。因此,Pon2蛋白表达减少约95%。这些在其被称为2-deficient老鼠Pon2^{- / -}老鼠。野生型(WT)、C57BL / 6 j和C57BL / 6-Ly5.1,Pon2^{- / -}老鼠住在美因茨一起进行平移动物研究中心。所有标准菌株能获得水和食物饮食随意。实验小鼠10 - 14周的时候称为“年轻”或“岁时超过9个月大。“动物牺牲腹腔注射2%戊巴比妥(0.4毫升/ 25 g体重)。所有动物实验伦理委员会批准,Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz(# 23177 - 07年/ g13 - 1 - 055)。

2.4。抽血和分析

注射致命剂量的戊巴比妥后腹腔内(i.p), intracardial血供以后分析Sysmex XP血液学分析仪获得或使用注射器HEMAVET涂以柠檬酸溶液(σ)和26个G针。

少量的血液在多个时间点,例如,分析红细胞营业额和压力红细胞生成,老鼠轻轻克制,而血液被抓了腔caudalis mediana并立即转移到一个EDTA-coated反应容器。

2.5。体内生物素酰化分析的红细胞寿命/营业额

红细胞寿命/营业额分析使用生物素标记根据出版协议(39,40]。

红细胞细胞生物素酰化在活的有机体内WT, Pon2^{- / -}小鼠尾静脉注入(注射)使用26个G和100½插管μl sulfo-NHS-LC-biotin解决方案(30毫克/毫升),导致标签80 - 95%的循环红细胞。30分钟后的第一个血液样本是为了确定每个老鼠的生物素酰化的起始值。后续每天采集的血液样本(5天),然后每隔5天,从20天每隔7天。大约10μl抽血液和PBS + 2% FCS以及链霉亲和素APC-Cy7(1: 250)和Ter119 APC(1: 500)(从eBioscience热费希尔科学)补充道。孵化15分钟后在黑暗中冰,样本清洗和分析FACSCanto™II流式细胞分析仪。

2.6。感应苯肼的溶血性贫血

大约有80μl血液来自WT, Pon2^{- / -}抓老鼠的腔caudalis mediana转移到一个EDTA-coated反应容器,并使用Sysmex XP血液学分析仪检查。然后老鼠注射50毫克/公斤盐酸苯肼(Sigma-Aldrich)或PBS(对照组)i.p。注入了天1和3。

2.7。流式细胞术和细胞排序

细胞悬浊液从肝脏得到通过一个100把器官μm细胞的过滤器。单细胞BM的悬浮液通过冲洗胫骨和股骨骨使用RPMI / 2% FCS,随后通过细胞过滤器过滤暂停帽。目标抗体(所有从eBioscience热费希尔科学、Dreieich德国,除非另有规定)用于染色的分化的bmc B220 (CD45R) (APC);CD3e (PE);CD4 (APC);CD8 (Ly2) (PE);ckit (PerCP-eFluor710);CD11b (APC);Gr1一起(Ly6G / C) (PE);美国圣地亚哥CD19 (PE、BioLegend);Ter119 (APC); CD71 (PE); and CD138 (Brilliant violet 421, BD Biosciences). For identification of hematopoietic stem and progenitor cells (LT-HSCs, ST-HSCs, MPPs, CMPs, GMPs, and MEPs), cells were incubated with a lineage cocktail of biotin-conjugated antibodies directed against CD3, CD4, CD5, CD8 (Ly2), CD11b (only LT-HSCs, ST-HSCs, and MPPs), CD127 (only CMPs, GMPs, and MEPs; BioLegend), B220 (CD45R), Gr1 (Ly6G/C), and Ter119. After washing, cells were incubated with streptavidin (APC-Cy7), Sca-1 (PECy7), ckit (APC), CD135 (PE, only LT-HSCs, ST-HSCs, and MPPs, BioLegend), CD150 (Alexa Fluor 488, only LT-HSCs, ST-HSCs, and MPPs, BioLegend), CD16/32 (PE, only CMPs, GMPs, and MEPs, BD), and CD34 (Alexa Fluor 488, only CMPs, GMPs, and MEPs, BD). For quantification of apoptotic HSCs, CD135 (PE) was replaced by annexin V (PE), and for measurement of total ROS via H₂DCF-DA染色,CD150 (Alexa萤石488)被CD150(布里尔所取代。紫421)。数据采集是用FACSCanto II (BD生物科学)和分析使用BD FACSDiva™软件。

进行排序,公司丰富使用EasyStep™小鼠造血祖细胞隔离设备(干细胞技术,德国科隆),沾染了前面提到的抗体,和排序FACSARIA™II SORP流式细胞分析仪细胞分选仪(BD生物科学)。所有控制策略如图S4。

2.8。互惠骨髓(BM)移植

BM WT (bmc)或细胞Pon2^{- / -}供体老鼠被冲洗胫骨和股骨骨孤立使用RPMI / 2% FCS / 1% penicillin-streptomycin BM再悬浮细胞在DMEM紧随其后。注射的 bmc静脉注射到老鼠受体的基因型致命辐照后24小时(Cs137,一剂9 Gy;这种辐射剂量后被证实是致命的8 - 10天),Pon2^{- / -}和WT BM嵌合体生成。BM-transplanted小鼠血细胞分析后确认Pon2信使rna表达的存在,没有比BM细胞注射后21天。

2.9。竞争BM移植

bmc是隔绝CD45.2-positive WTPon2^{- /- - - - - -}老鼠和混合1:1的bmc隔绝CD45.1 WT老鼠。后来, WT CD45.1 / WT CD45.2(控制)或WT CD45.1 /Pon2^{- / -}CD45.2混合的bmc是通过静脉注入辐照WT CD45.2接受者老鼠。大约50μl竞争移植小鼠的血液被3、7、11、15、19、22周后注入和沾CD45.1 CD45.2抗体检测公司移植使用句C57BL / 6小鼠在Ly5不同轨迹(41]。辐照小鼠接受Borgal辐照后大约4周。所有控制策略如图S4。

2.10。岁的bmc的串行移植

岁的bmc,隔绝WTPon2^{- / -}小鼠,分别注射。注入辐照,年轻WT接受者老鼠。移植后21天,bmc被冲洗的胫骨和股骨骨孤立接受者老鼠然后resuspended DMEM和一次注射。注入辐照,年轻WT接受者老鼠。在接下来的21天,受体小鼠的存活率。

2.11。测量总ROS的H₂DCF-DA染色

公司使用BM隔离和染色后细胞表面标记如上所述,细胞被孵化与0.5μM荧光CM-H ROS指标₂DCF-DA(分子探针/热费希尔科学、Dreieich,德国)为30分钟37°C。洗后的细胞使用克雷布斯消息灵通的缓冲区(Noxygen、Elzach、德国),通过分析评估总ROS H₂DCF-DA信号强度在FACSCanto II (BD生物科学)流式细胞分析仪与BD FACSDiva™软件(激发/发射CM-H₂DCF-DA: 488/520 nm)。所有控制策略如图S4。

2.12。通过l - 012测量活性氧的生产

活性氧产量决定使用鲁米诺导数l - 012 (8-amino-5-chloro-7-phenylpyridol [3,4 - d] pyridazine-1, 4 (2 h、3 h)土卫四;Wako化工、里士满、美国)如前所述组织匀浆,全血,孤立的白细胞(42]。新鲜WT bmc和孤立Pon2^{- /- - - - - -}老鼠离心机和resuspended修改克雷布斯消息灵通的缓冲区的浓度 细胞/毫升。50μ(包含l细胞悬液/好 细胞)是装载在96孔板。添加40后化学发光被记录μ在某些情况下M l - 012和10μM DMNQ (2 3-dimethoxy-1 4-naphthoquinone) redox-cycling代理,诱发细胞内超氧化物阴离子和过氧化氢的形成。l - 012化学发光测定实验组同时为两个75分钟每4分钟使用一个微型板块Centro LB960光度计(Sprendlingen Berthold技术,德国)。光子数归一化化学发光的l - 012修改克雷布斯消息灵通的缓冲区。

2.13。细胞周期分析BM的人口

细胞表面染色进行如上所述。随后,样本孵化Cytofix / Cytoperm (BD生物科学)15分钟。细胞被洗使用烫/洗,resuspended缓冲区包含反- ki - 67抗体(Alexa萤石647稀释1:30在烫/洗),和孵化至少30分钟。与烫/洗,洗后细胞resuspended在100年μl 33342年赫斯特(PBS稀释1:500)和孵化15分钟。使用BD LSR II流式细胞分析仪分析,和数据分析利用BD FACSDiva™或FlowJo软件。所有控制策略如图S5。

2.14。集落形成单位(cfu)分析

bmc WT和Pon2^{- / -}老鼠培养在MethoCult™GF M3434(干细胞技术,德国科隆)按照制造商的指示。电镀后10 - 12天,殖民地Leitz则被量化,确定使用DM IL显微镜(徕卡,位于德国)。

2.15。归航

归航骨髓造血细胞的分析中描述Yusuf和Scadden43),但bmc被冲洗隔离而不是破碎的骨头。

2.16。评估Gamma-H2AX LSK细胞的水平

细胞表面染色进行使用上面描述的血统鸡尾酒biotin-conjugated抗体以及链霉亲和素(APC-Cy7),本来(PECy7)和ckit (APC)。细胞被固定和permeabilized使用Cytofix / Cytoperm (BD生物科学),然后沾γBioLegend H2AX抗体(Alexa萤石488年,圣地亚哥,美国:a) 2小时在冰上。数据采集进行FACSCanto II (BD生物科学)和柱状图叠加图像创建使用CellQuest Pro软件(BD生物科学)。

2.17。基因表达分析

根据先前的研究,PON2表达水平最高的肺,小肠,心脏,肝脏(44]。为了证明Pon2信使rna表达以及确定特异性Pon2表达公司,我们孤立的信使rna从FACS-sorted LT-HSCs, ST-HSCs,多能祖细胞(mmp),常见的髓系祖细胞(cmp), granulocyte-macrophage祖细胞(gmp),和组祖细胞(议员)和两步中存在执行分析。分析的影响redox-cycler DMNQ趋化因子受体CXCR4 mRNA表达,RNA是隔绝HPC7和BA / F3细胞治疗有或没有10μM DMNQ 2到8 h。RNA是反向转录使用上标™很™大师混合(表达载体/热费希尔科学、Dreieich,德国)。然后,qPCRs进行使用引物和double-labeled探测器( ;从欧陆坊基因组学、德国汉堡;表中列出S1)或PrecisionPLUS 2 x qPCR MasterMix SYBR绿色(引物设计,钱德勒的福特,英国)所描述的制造商。信使rna表达水平进行分析根据先前建立的协议(45),一般应用2看家基因(Gapdh,Actb;底漆使用,见下表S1)。

2.18。总RNA序列

对总RNA序列(RNA-seq)分析,林^{- - - - - -},Sca^{1 +},ckit⁺,CD135^{- - - - - -},CD150⁺细胞(代表LT-HSC和MPP2细胞更好的歧视以下称为肝星状细胞)(46]从BM的年轻WT或被孤立Pon2^{- / -}老鼠( 每个)流式细胞仪如上所述。10肝星状细胞/好,总共有8井/鼠标流式细胞仪分为96孔板(8 RNA-seq每48 RNA-seq鼠标和基因型),包含裂解缓冲(试剂盒,希尔登德国)。随后,细胞被移交基因组学研究所分子生物学的核心设施(美因茨,德国)RNA-seq使用Smart-seq2-protocol图书馆准备和NextSeq®500/550高输出装备v2 (Illumina公司、剑桥、英国)测序。原始测序读质量评估使用FastQC (Babraham生物信息学)和适配器使用Trimmomatic修剪(v0.36 [47])。生RNA-seq读取被映射到鼠标参考基因组(gencode发布M12 GRCm38.p5)使用星对准器(v2.5.3a [48]),选择“-quantModeGeneCounts”数读取映射每个基因的数量。高质量的数字读21.1到3260万读。67至76%的读取是对齐到老鼠基因组。DESeq2 (v1.18.1 [49)被用来识别基因差异表达Pon2淘汰赛。基因与褶皱变化比2和罗斯福低于0.05被认为是差异表达。传播的分析使用ConsensuPathDataBase释放34 [50]。

2.19。RNA-seq或微阵列分析

所有公共RNA-seq或微阵列数据分析的文献进行了使用软件CLC基因组工作台(21.0.03版)使用制造商推荐的参数。

2.20。统计数据

GraphPad棱镜软件(版本9),应用2-tailed学生的 - - - - - -测试(正态分布数据, )两组的比较。超过2组,1路的方差分析与图基的多个测试或双向方差分析比较Bonferroni的多个比较测试应用。实验组的小鼠数量或数量的独立分析细胞实验的数据表示。 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。Pon2 mRNA表达水平不同肝星状细胞和祖细胞在年轻和年老的老鼠

Pon2 mRNA表达以肝细胞的子集的bmc,已知表达Pon2 mRNA水平高,作为一个积极的控制。我们的结果(图1)表明微分,特异性Pon2表达水平在0.15 - 1.35倍之间相比,肝细胞以及Pon2表达的变化在公司年龄的函数。在小动物(10 - 14周),LT -和ST-HSCs Pon2 mRNA表达水平低,稍微增加的承诺祖细胞(多能祖细胞(mmp),常见的髓系祖细胞(cmp))和显著增加组祖细胞(议员)(数据1和S1A)。相比之下,表达式分析公司年龄的动物(> 9个月)显示Pon2 mRNA水平最低的欧洲议会议员,通过和差,但更高的LT -和ST-HSCs(数字1和印地)。没有改变Pon2表达式的函数年龄观察肝细胞的控制。分析RNA-seq可用数据集的肝星状细胞和祖细胞的年轻老鼠(PRJNA603283 [51],PRJNA665066)展示了类似的模式Pon2 mRNA表达我们的实验(图中1和就是S1C)。最后,分析可用RNA-seq (PRJNA524895 [52],PRJNA528500 [53],PRJNA635499或微阵列数据集(GSE76276) [54];参见图S1D)显示没有区别Pon2 LT-HSCs年轻之间的信使rna表达水平,年龄,或者旧的动物。

3.2。年轻Pon2^{- / -}老鼠显示定量变化的公司,而是一个一成不变的骨髓/淋巴比率

使用流式细胞仪分析不同公司的亚种群(数字2(一个)- - - - - -2 (g)LT-HSCs)显示显著增加和减少数量的mmp BM的年轻Pon2^{- / -}老鼠WT动物相比。没有观察到显著变化的总林⁻本来就⁺c - kit⁺(LSK)细胞,ST-HSCs,通过gmp和欧洲议会议员。我们还确定的比率骨髓和外周血淋巴细胞(图2 (h))。没有区别在骨髓/淋巴WT与比例Pon2^{- / -}老鼠被发现。

3.3。Pon2^{- / -}小鼠血液计数显示定量变化

我们下一个测试Pon2不足的后果进行血细胞计数外周血种群的年轻Pon2^{- / -}使用Sysmex自动化血液学分析仪和WT老鼠。

与WT相比,Pon2^{- / -}小鼠白细胞(WBC、图相似3(一个))和红细胞(RBC,图3 (c)),但增加血红蛋白(Hb,图3 (b))。此外,Pon2^{- / -}红细胞显示一些定性的异常,如增强意味着微粒体积(MCV,图3 (d)),意味着微粒血红蛋白(妇幼保健,图3 (e)),意味着微粒血红蛋白浓度(MCHC,图3 (f))和降低红细胞分布宽度(RWD,图3 (g))。

3.4。缺Pon2 Associates偏向于红细胞生成在生理和压力条件

反对与骨髓公司亚种群,异常温和,LT-HSCs和边际产量有限,周边的血Pon2有缺陷的小鼠红细胞严重违规行为。因此,我们未来Pon2是否进行测试^{- / -}有关红色的祖细胞同样数值异常。事实上,如图4(一)- - - - - -4 (c)成红血球细胞的染色流式细胞术分析Pon2^{- / -}百时美施贵宝证明增加数量在所有阶段的区别。我们也分析了红细胞细胞使用的寿命在活的有机体内生物素酰化流式细胞术分析耦合。的重要性,Ter119-positive红细胞细胞Pon2^{- / -}小鼠寿命显著提高( 在WT控件(天)相比 天)(图4 (d))。

最后,我们评估的动态应力红细胞生成Pon2^{- / -}并通过腹腔WT诱导后小鼠的溶血PBS应用苯肼或控制物质。苯肼在WT引起强烈的红细胞计数减少小鼠的第五天开始治疗后(图4 (e))。相比之下,预期的溶血是Pon2弱^{- / -}老鼠,血液中红细胞的比例仍明显高于(图4 (e))。在control-treated动物、WT,之间没有显著变化Pon2^{- / -}动物被认为(图4 (f))。

总之,这些数据表明一个特定的角色Pon2和寿命限制红色的承诺。

3.5。在年轻Pon2^{- / -}老鼠,互惠BM移植揭示细胞内在以及外在的表型

我们下一个旨在评估功能公司隔间的观察定量变化的重要性。确定的影响Pon2对公司缺乏细胞内在或利基,我们进行相互的BM移植(见图S2A),导致四个实验组,每组:WT接受者(r) / WT捐赠(d)和Pon2^{- / -}(r) /Pon2^{- / -}(d)以及组成的嵌合体Pon2^{- / -}(r) / WT (d)和WT (r) /Pon2^{- / -}(d)。成功的重建或损耗的Pon2受体小鼠的造血细胞被证实存在(图开通)。后续流仪分析公司统计显示特异性和混合效果(细胞特定+利基效果)。互惠BM移植显示增加LT-HSC、CMP和议员数字(数字S2C,S2F,S2G)Pon2^{- / -}动物收到Pon2^{- / -}BM。没有重大分歧的嵌合体,这表明补充细胞内在和外在影响。

3.6。Pon2缺乏年轻老鼠导致氧化应激,但不诱导细胞凋亡或引起DNA双链断裂

使用两种方法来分析基底ROS生产,我们调查了在稳态条件下小鼠的bmcPon2^{- / -}老鼠WT动物相比。首先,我们分析了超氧化物/过氧化氢在BMC使用l - 012与化学发光检测调查。按照以前公布的抑制超氧化物/过氧化氢生产PON2 [10),我们发现明显增加l - 012在bmc年轻的化学发光信号Pon2^{- / -}老鼠相比WT老鼠(图5(一个))。此外,我们分析了在WT或总ROS水平Pon2^{- / -}公司与荧光染料CM-H₂通过流式细胞术DCF-DA。测量了显著增强活性氧的形成Pon2^{- / -}ST-HSCs和数字增强活性氧Pon2^{- / -}mmp的年轻动物(图5 (b))。有趣的是,在LT-HSCs没有观察到的差异。

我们假设PON2不足导致增加了肝星状细胞的凋亡细胞死亡。使用膜联蛋白V染色,我们分析了BM的凋亡LT - ST-HSCs百分比Pon2^{- / -}并通过流式细胞术WT老鼠。这些测量显示显著减少膜联蛋白V-positive LT-HSCs但没有膜联蛋白的差异V-positive ST-HSCs在年轻Pon2^{- / -}老鼠相比WT(数据5 (c)和5 (d))。我们还发现没有gamma-H2AX抗体的荧光信号强度的变化Pon2缺乏LSK细胞相比WT细胞(图S3A),表明遗传WT和稳定Pon2^{- / -}老鼠,尽管ROS水平较高Pon2^{- / -}老鼠。

3.7。年轻Pon2^{- / -}BM细胞战胜WT在早期在之后的时间点但不是

分析是否LT-HSCs数量增加Pon2^{- / -}动物可以提高健身,我们执行竞争BM移植化验。移植WT和Pon2^{- / -}分析了bmc流式细胞仪利用细胞表面标记CD45.1 CD45.2,分别(图5 (e))所描述的41]。移植的WT和竞争Pon2^{- / -}bmc 1: 1的比例显示显著的优势Pon2^{- / -}bmc在早期的时间点(图multilineage重建5 (f))而移植WT与相类似Pon2^{- / -}15周后细胞。

3.8。年轻Pon2^{- / -}和WT公司显示在细胞周期状态没有差异,克隆形成能力,归航

因为增加ROS水平会影响肝星状细胞的静止状态,可以刺激他们繁殖和分化(18使用赫斯特33342年),我们进行细胞周期分析和ki - 67区分细胞G0 - G1 -以及G2, S -,有丝分裂期。我们在细胞周期状态的检测没有区别Pon2^{- / -}相比LSK细胞或LT-HSCs WT细胞(数字S4A和S4B)。同样,克隆形成化验显示没有区别WT或克隆形成能力Pon2^{- / -}bmc 10天后孵化。除了等量的总殖民地(图自己),也没有特定的殖民地(图的数量的变化S4D),表示没有Pon2-mediated对集落形成和分化的影响。

我们也分析了归航的bmc的能力。我们检查了归航效率使用荧光染料DiI和分析BM的致命辐照受体小鼠注射染色后48 hPon2^{- / -}或WT bmc(图S4E)。流仪分析显示在WT自导能力和没有差异Pon2^{- / -}bmc(图S3F)。因此,我们推测的频率就越高Pon2^{- / -}派生细胞在竞争BM移植早期点(图5 (f))可能是由LT-HSCs的增加引起的Pon2^{- / -}派生的BM细胞(图2 (b)),而不是由于增加健身的Pon2^{- / -}肝星状细胞。

3.9。岁Pon2^{- / -}老鼠重申LT-HSCs比例的增加,但也表现出变化导致骨髓/淋巴比率的改变

按照分析年轻的老鼠,流式细胞术在BMCPon2^{- / -}老鼠增加LT-HSCs演示。此外,一个令人惊讶的增长的比例达到指出,尽管所有其他承诺祖细胞保持在同类水平与控制老鼠(数字6(一)- - - - - -6 (g))。这些增加了GMP水平表明潜在的强化骨髓扭曲与WT老鼠相比,可明显证实了外周血的骨髓和淋巴转移率Pon2^{- / -}老鼠(图6 (h))。

3.10。类似的总老Pon2 ROS水平^{- / -}肝星状细胞与WT肝星状细胞相比,但明显降低基线细胞凋亡

总ROS的公司Pon2^{- / -}老鼠是评估通过流式细胞术使用H₂DCF-DA染色。类似于年轻Pon2^{- / -}肝星状细胞,没有重大分歧ROS水平观察LSK分数的所有亚种群相比WT细胞(图7(一))。再次,膜联蛋白V-positive细胞明显减少Pon2^{- / -}LT -和ST-HSCs(数据5 (b)和5 (c)),而DNA损伤分析并未显示更高水平的DNA双链断裂而WT细胞(图S3B)。

3.11。在串行移植实验中,Pon2岁BM的接受者^{- / -}小鼠存活率没有减少

分析的功能Pon2^{- / -}BMC,我们执行串行移植实验诱导像样的增殖压力。从WT岁和bmc是孤立的Pon2^{- / -}老鼠。描述了老年动物的肝星状细胞增殖能力减少老鼠在活的有机体内移植化验(55]。因此,我们进行了2轮的移植(图7 (d))。值得注意的是,旨在创建一个高压力的条件在骨髓粒子数再增,我们缩短了时间之间的主要和次要再移植到3周。这些实验显示无统计差异动物移植的存活率Pon2^{- / -}或WT的bmc,尽管样本量较低(5和6的动物)。然而,符合观察LT-HSCs数量的增加和减少的细胞凋亡水平,更多的受体小鼠移植的bmc的年龄Pon2^{- / -}捐助者还活着在21天的第二轮移植相比,接受者的bmc的野生动物(图7 (e))。

3.12。RNA-seq分析显示增强的生存的年轻Pon2基因在肝星状细胞的表达^{- / -}老鼠

虽然在祖细胞ROS水平增加,尤其是在老年小鼠,导致过早衰老表型频率增加骨髓祖细胞和转移myeloid-to-lymphoid比外周血的年龄Pon2^{- / -}老鼠,我们没有观察到疲劳应力条件下表型。这个观察可能增加的结果LT-HSC数字或减少基线Pon2凋亡细胞死亡^{- / -}LT-HSCs。我们假设Pon2引起的损耗补偿计划在最早的造血阶段克服supraphysiological ROS水平的有害影响,我们发现在整个BM。为了解决这个假设,我们执行RNA-seq分析林^{- - - - - -},Sca^{1 +},ckit⁺,CD135^{- - - - - -},CD150⁺细胞(代表LT-HSCs和MPP2-hereafter称为HSC)从年轻WT或孤立Pon2^{- / -}老鼠( 每个基因型)。整个肝星状细胞的转录组的比较从年轻WT或孤立Pon2^{- / -}老鼠用DESeq2识别341个差异表达基因。其中,168个基因表达下调,157个基因调节Pon2^{- / -}肝星状细胞而WT肝星状细胞(见表S2和图6 (b))。样本距离分析(见图8(一个))之间并没有发现明显的集群Pon2^{- / -}和WT组,与此同时类似传播资料的第一主成分(PC1)主成分分析(PCA)。尽管如此,Pon2^{- / -}显然和WT组分别聚集在第二主成分(PC2),导致我们相信,而离散的细胞过程/通路肝星状细胞的年轻人之间的不同Pon2^{- / -}和WT动物。

我们注意到几个重要的监管机构的不同表达的细胞生存,如端粒酶(叔)[56,57]或NRF2通路的基因Nfe2l2和Abcc2(58,59和趋化因子受体CXCR4参与归航的规定,静止/扩散或迁移(60]。值得注意的是,群体分析Pon2基因调节的^{- / -}肝星状细胞表现出显著富集的一个离散路径(图8 (b))。最重要的是,CXCR4-mediated信号事件的途径达到最高水平的意义(FDRq 0.02)在整个数据库(图6 (b);表S3和S4)。此外,治疗与ROS发电机DMNQ导致增强(约2.5倍)趋化因子受体CXCR4 mRNA表达HPC-7造血干细胞和BA / F3 pro B细胞(见图8 (c)和8 (d))。

4所示。讨论

在这项研究中,我们全面调查PON2在造血系统的功能。PON2治疗耐药性和不良预后有关不同类型的白血病,但PON2在造血作用的生物功能还没有被调查。我们的在活的有机体内研究表明,PON2参与调节正常的造血作用。首先,我们确定Pon2 mRNA表达水平在不同公司亚种群的年轻(< 3个月)和老年(> 9个月)老鼠。在年轻的老鼠,Pon2 mRNA水平增加祖细胞,特别是在cmp的议员,相比HSC隔间。令人惊讶的是,但至少符合高表达水平推定地与一个特定的功能的重要性在欧洲议会议员,Pon2缺乏年轻的老鼠与倾向于一种更健壮的红细胞生成在生理和压力条件。虽然这仍有待在后续工作,我们相信,Pon2不足可能会激活一个(对)补偿机制来维持红细胞生成。

同时,表达水平Pon2拒绝在老年小鼠进行分化。有趣的是,在老年小鼠,损耗的Pon2导致增加了gmp伴随着myeloid-to-lymphoid比例的失衡,指着至少部分加速老化Pon2^{- / -}肝星状细胞相比WT细胞。与年龄相关的扩张不同公司的亚种群被描述在不同的HSC老化研究[55,61年]。岁的增强骨髓扭曲Pon2^{- / -}老鼠可能是由于一个小增加ROS水平检测mmp [62年,63年]。

因为研究PON2击倒后以及细胞培养模型Pon2^{- / -}内皮细胞显示增强活性氧形成(12,13),我们决定总ROS水平和超氧化物/过氧化氢水平的bmc年轻的动物。由于他们的低代谢活动,肝星状细胞是容易受到氧化应激引起的细胞损伤。在生理量,ROS作为信号分子,调节干细胞增殖,分化和动员。甚至是一个相对小的ROS增加肝星状细胞会导致自我更新活动的故障和HSC衰老,这可能会导致过早HSC池枯竭和造血障碍(64年]。分析超氧化物/过氧化氢生产显示明显增强的形成率在整个BMC的年轻Pon2^{- / -}动物。然而,总ROS水平没有影响在年轻和老Pon2 LT-HSCs^{- / -}动物。PON2已被证明会降低过氧化物生产主要是线粒体内膜的(10),但LT-HSCs需求少量的能量,这几乎完全是通过糖酵解产生的(19]。线粒体超氧化物产量的增加Pon2^{- / -}因此LT-HSC可能极少或不存在的。与此同时,已经分化成循环利用的第一步ST-HSCs-cells从糖酵解转移到线粒体ATP生产(20.]。增加超氧化物/过氧化氢(例如,ST-HSCs和数值mmp)可能反映了更高的ROS水平Pon2^{- / -}祖细胞,最终导致观察到的表型类似早衰。衰老机制参与HSC是端粒酶的活性降低,导致细胞增殖的局限性肝星状细胞(26]。在我们的研究中,我们观察到的减少叔基因表达在HSC隔绝年轻Pon2^{- / -}老鼠。

有趣的是,定量分析不同的公司在BM WT和亚种群Pon2^{- / -}老鼠透露LT-HSCs比例的增加。进一步,我们观察到的一个优势在竞争重新化验WT-BMCs在年幼的动物早期的时间点,可能由于增加的百分比Pon2^{- / -}LT-HSCs由于减少凋亡细胞死亡在年轻人和老年人Pon2^{- / -}LT-HSCs。有趣的是,保持酶的活性亚基的基因失活的NADPH氧化酶全酶亚基gp91phox (NOX2)导致减少ROS生成产生相反的结果。在竞争与从NOX2 WBM细胞移植^{- / -}动物,减少移植被认为(17]。这些数据表明,Pon2-dependent机制更多的活性氧解毒可能参与调节观察表型。RNA-seq分析在肝星状细胞的年轻动物鉴定了大量的差异表达基因调节细胞死亡和扩散。例如,我们观察到的增强表达ATP-dependent DNA解旋酶第四季度(Recql4, DNA修复),makorin无名指蛋白2 (Mkrn2凋亡),和细胞周期蛋白依赖性激酶5监管subunit-associated蛋白1 (Cdk5rap1)水平以及减少凋亡和酪氨酸激酶(Aatk proapoptotic)。RECQL4基本上是参与dna修复(65年,66年),这个基因的失活导致骨髓衰竭由于凋亡率增加67年]。在初级白血病细胞和不同白血病细胞系,增强MKRN2表达式的结果减少凋亡率和增强细胞增殖(68年]。MCF-7在人类乳腺癌细胞,CDK5RAP1缺乏诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡显示凋亡功能的蛋白质(69年]。AATK被描述是重要的增长逮捕和/或细胞凋亡诱导的骨髓前体细胞(70年]。在以前的研究中,PON2可以诱导凋亡属性(71年,72年]。我们在我们的推测Pon2^{- / -}基因敲除模型中,一个积极的反馈被激活LT-HSC水平以补偿祖细胞的需求增加,加速老化表型导致LT-HSCs数量的增加。除了上述基因,我们发现一个重要的诱导表达Cxcr4所示。CXCL12 / CXCR4轴是参与归航的规定,静止/扩散或迁移60]。在年轻的老鼠灭活芳基碳氢化合物受体(Ahr),一个规模虽小但重要的增强活性氧的生产被认为,类似Pon2损耗。在微阵列实验,作者发现趋化因子受体Cxcr4表达增强(2.91倍值0.045)(54]。此外,治疗与ROS发电机DMNQ导致增强的趋化因子受体CXCR4 mRNA表达HPC-7造血干细胞和BA / F3 pro B细胞。CXCL12 / CXCR4信号的一个重要机制在维护HSC体内平衡是预防(氧化)压力73年]。所以很可能增强Cxcr4表达Pon2^{- / -}HSC保护细胞免受transplantation-induced压力在早期的时间点。符合之前的数据73年),这一发现让我们推测,趋化因子受体CXCR4 / CXCL12轴调节的结果增加了活性氧来抵消造血干细胞疲惫Pon2的损失。而Pon2损耗原因增加了活性氧在更为成熟的祖细胞和细胞疲惫的年轻老鼠,补偿upregulation Cxcr4可能保护LT-HSCs这些老鼠,导致增加细胞数量和减少细胞凋亡提供充足供应的祖细胞,一个假设,在未来的调查仍有待探索。

5。结论

总之,我们目前的数据表明,PON2参与调节HSC的功能。增强ROS水平Pon2^{- / -}祖细胞与频率的增加通过gmp和myeloid-to-lymphoid比例的失衡,在老老鼠。的损失Pon2LT-HSCs激活凋亡程序,但也导致增加在干细胞维护相关基因的表达,例如,趋化因子受体Cxcr4 Recql4, Aatk。我们推测,“维护”计划的感应Pon2损耗抵消ROS-mediated过早衰老表型并确保适当的供应的承诺岁的祖细胞在老鼠。然而,需要进一步的实验来解决这个假设。

数据可用性

原始RNA-seq数据可通过基因表达综合(GEO)库(74年通过加入GSE122553数量。

的利益冲突

作者没有利益冲突。

作者的贡献

LS设计研究中,进行了研究,分析了数据,和写的手稿;我、VS MM、PSH、副总裁,DS,点,和NC-W进行了研究,分析了数据,和写的手稿;SH、美联社和广告设计的研究,分析了数据,和写的手稿;信息战、DS、TK和香港设计和监督的研究,分析了数据,并写了手稿。LS和信息战以及DS, TK,和香港的贡献同样工作。

确认

作者感谢研究所分子生物学gGmbH (IMB),美因茨,德国,可能使用FACSARIA™II SORP流式细胞分析仪细胞分选仪(BD生物科学)的国际海事局流式细胞仪核心设施在我们的实验。我们谢谢IMB基因组学的核心设施,美因茨,提供排序功能。这项工作得到了DFG格兰特WI3897/3-1 IW和香港中心血栓和止血美因茨(BMBF资金分配ID 01 e01003项目TRPX2 SH和香港)。

补充材料

图S1:Pon2信使rna表达不同的WT小鼠骨髓细胞。图S2:在年轻Pon2^{- / -}老鼠,互惠BM移植揭示细胞内在以及外在的表型。图S3:Pon2^{- / -}bmc没有增强的DNA双机座减免LSK细胞。图S4:骨髓细胞的年轻Pon2^{- / -}和WT老鼠显示在细胞周期状态没有差异,克隆形成能力,归航。图S5:控制策略。图S6:代表直方图显示的DCF-DA数据LT - ST-HSC以及从年轻WT, Pon2 MPP孤立^{- / -}老鼠。表S1:序列的引物和探针用于qRT-PCR-based量化Pon2信使rna表达。表S2:确定使用DESeq2和全基因组的差异表达基因RNA-seq数据来自WT和肝星状细胞分离Pon2^{- / -}动物。表S3:通路在肝星状细胞分离浓缩Pon2^{- / -}动物。表S4:途径减少肝星状细胞分离Pon2^{- / -}动物。(补充材料)

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