所有细胞文化品位塑料材料是来自他一一Bio-One, Frickenhausen,德国、或SARSTEDT Numbrecht,德国。所有的化学物质(如不是另有规定),胎牛血清,从鼠血清免疫球蛋白,RPMI 1640年,杜尔贝科的磷酸盐(PBS)蛋白酶K, Taq来自σ,Deisenhofen,德国。CM-H₂DCF-DA得到从分子探针/热费希尔科学、Dreieich,德国。l - 012 (8-amino-5-chloro-7-phenyl-pyrido [3,4 - d] pyridazine-1, 4 (2 h、3 h)土卫四)和光化学物质,是来自kouichi美国里士满青霉素和链霉素溶液(100 x;10.000 U /毫升青霉素,10.000 μg / ml链霉素),杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)和GlutaMax™得到从Gibco /热费希尔科学、Dreieich,德国。高容量cDNA逆转录工具包和大角星®PicoPure®RNA隔离设备从应用生物系统公司购买,达姆施塔特,德国。peqGOLD总RNA工具包,peqGOLD TriFast™,和dNTP-Mix从Peqlab购买,达姆施塔特,德国。PrecisionPLUS 2 x qPCR MasterMix SYBR绿色得到从引物设计、钱德勒的福特,联合王国。Anti-Rat /仓鼠搞笑, κ/负控制(的边后卫 ∗ )补偿粒子集,BD Cytofix / Cytoperm™固定/透化作用工具包,BD™CompBeads, PE膜联蛋白V凋亡检测装备,反- ki - 67抗体,和烫/清洗缓冲来自BD生物科学,德国海德堡。

小鼠造血前体cell-7 (HPC-7 [ 34])和BA / F3 pro B细胞( 35)如前所述培养( 36]。分析活性氧的影响发电机2,3-dimethoxy-1, 4-naphthalenedione (DMNQ) [ 37),这些细胞被镀6-well盘子和处理10 μM DMNQ(解决在DMSO)或DMSO(控制)2 - 8 h。

PON2-deficient老鼠产生loxP-site侧面插入, β-geo-containing基因陷阱向量 Pon2基因内区2 ( 38]。因此,Pon2蛋白表达减少约95%。这些 在其被称为2-deficient老鼠 Pon2^{- / -}老鼠。野生型(WT)、C57BL / 6 j和C57BL / 6-Ly5.1, Pon2^{- / -}老鼠住在美因茨一起进行平移动物研究中心。所有标准菌株能获得水和食物饮食随意。实验小鼠10 - 14周的时候称为“年轻”或“岁时超过9个月大。“动物牺牲腹腔注射2%戊巴比妥(0.4毫升/ 25 g体重)。所有动物实验伦理委员会批准,Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz(# 23177 - 07年/ g13 - 1 - 055)。

注射致命剂量的戊巴比妥后腹腔内(i.p), intracardial血供以后分析Sysmex XP血液学分析仪获得或使用注射器HEMAVET涂以柠檬酸溶液(σ)和26个G针。

少量的血液在多个时间点,例如,分析红细胞营业额和压力红细胞生成,老鼠轻轻克制,而血液被抓了 腔caudalis mediana并立即转移到一个EDTA-coated反应容器。

红细胞寿命/营业额分析使用生物素标记根据出版协议( 39, 40]。

红细胞细胞生物素酰化 在活的有机体内WT, Pon2^{- / -}小鼠尾静脉注入(注射)使用26个G和100½插管 μl sulfo-NHS-LC-biotin解决方案(30毫克/毫升),导致标签80 - 95%的循环红细胞。30分钟后的第一个血液样本是为了确定每个老鼠的生物素酰化的起始值。后续每天采集的血液样本(5天),然后每隔5天,从20天每隔7天。大约10 μl抽血液和PBS + 2% FCS以及链霉亲和素APC-Cy7(1: 250)和Ter119 APC(1: 500)(从eBioscience热费希尔科学)补充道。孵化15分钟后在黑暗中冰,样本清洗和分析FACSCanto™II流式细胞分析仪。

大约有80 μl血液来自WT, Pon2^{- / -}抓老鼠的 腔caudalis mediana转移到一个EDTA-coated反应容器,并使用Sysmex XP血液学分析仪检查。然后老鼠注射50毫克/公斤盐酸苯肼(Sigma-Aldrich)或PBS(对照组)i.p。注入了天1和3。

细胞悬浊液从肝脏得到通过一个100把器官 μm细胞的过滤器。单细胞BM的悬浮液通过冲洗胫骨和股骨骨使用RPMI / 2% FCS,随后通过细胞过滤器过滤暂停帽。目标抗体(所有从eBioscience热费希尔科学、Dreieich德国,除非另有规定)用于染色的分化的bmc B220 (CD45R) (APC);CD3e (PE);CD4 (APC);CD8 (Ly2) (PE);ckit (PerCP-eFluor710);CD11b (APC);Gr1一起(Ly6G / C) (PE);美国圣地亚哥CD19 (PE、BioLegend);Ter119 (APC); CD71 (PE); and CD138 (Brilliant violet 421, BD Biosciences). For identification of hematopoietic stem and progenitor cells (LT-HSCs, ST-HSCs, MPPs, CMPs, GMPs, and MEPs), cells were incubated with a lineage cocktail of biotin-conjugated antibodies directed against CD3, CD4, CD5, CD8 (Ly2), CD11b (only LT-HSCs, ST-HSCs, and MPPs), CD127 (only CMPs, GMPs, and MEPs; BioLegend), B220 (CD45R), Gr1 (Ly6G/C), and Ter119. After washing, cells were incubated with streptavidin (APC-Cy7), Sca-1 (PECy7), ckit (APC), CD135 (PE, only LT-HSCs, ST-HSCs, and MPPs, BioLegend), CD150 (Alexa Fluor 488, only LT-HSCs, ST-HSCs, and MPPs, BioLegend), CD16/32 (PE, only CMPs, GMPs, and MEPs, BD), and CD34 (Alexa Fluor 488, only CMPs, GMPs, and MEPs, BD). For quantification of apoptotic HSCs, CD135 (PE) was replaced by annexin V (PE), and for measurement of total ROS via H₂DCF-DA染色,CD150 (Alexa萤石488)被CD150(布里尔所取代。紫421)。数据采集是用FACSCanto II (BD生物科学)和分析使用BD FACSDiva™软件。

进行排序,公司丰富使用EasyStep™小鼠造血祖细胞隔离设备(干细胞技术,德国科隆),沾染了前面提到的抗体,和排序FACSARIA™II SORP流式细胞分析仪细胞分选仪(BD生物科学)。所有控制策略如图 S4。

BM WT (bmc)或细胞 Pon2^{- / -}供体老鼠被冲洗胫骨和股骨骨孤立使用RPMI / 2% FCS / 1% penicillin-streptomycin BM再悬浮细胞在DMEM紧随其后。注射的 5 × 10 6 bmc静脉注射到老鼠受体的基因型致命辐照后24小时(Cs137,一剂9 Gy;这种辐射剂量后被证实是致命的8 - 10天), Pon2^{- / -} 和WT BM嵌合体生成。BM-transplanted小鼠血细胞分析后确认 Pon2信使rna表达的存在,没有比BM细胞注射后21天。

bmc是隔绝CD45.2-positive WT Pon2 ^{- /- - - - - -}老鼠和混合1:1的bmc隔绝CD45.1 WT老鼠。后来, 8 × 10 6 WT CD45.1 / WT CD45.2(控制)或WT CD45.1 / Pon2^{- / -} CD45.2混合的bmc是通过静脉注入辐照WT CD45.2接受者老鼠。大约50 μl竞争移植小鼠的血液被3、7、11、15、19、22周后注入和沾CD45.1 CD45.2抗体检测公司移植使用句C57BL / 6小鼠在Ly5不同轨迹( 41]。辐照小鼠接受Borgal辐照后大约4周。所有控制策略如图 S4。

5 × 10 6 岁的bmc,隔绝WT Pon2^{- / -} 小鼠,分别 注射。注入辐照,年轻WT接受者老鼠。移植后21天,bmc被冲洗的胫骨和股骨骨孤立接受者老鼠然后resuspended DMEM和一次 注射。注入辐照,年轻WT接受者老鼠。在接下来的21天,受体小鼠的存活率。

公司使用BM隔离和染色后细胞表面标记如上所述,细胞被孵化与0.5 μM荧光CM-H ROS指标₂DCF-DA(分子探针/热费希尔科学、Dreieich,德国)为30分钟37°C。洗后的细胞使用克雷布斯消息灵通的缓冲区(Noxygen、Elzach、德国),通过分析评估总ROS H₂DCF-DA信号强度在FACSCanto II (BD生物科学)流式细胞分析仪与BD FACSDiva™软件(激发/发射CM-H₂DCF-DA: 488/520 nm)。所有控制策略如图 S4。

活性氧产量决定使用鲁米诺导数l - 012 (8-amino-5-chloro-7-phenylpyridol [3,4 - d] pyridazine-1, 4 (2 h、3 h)土卫四;Wako化工、里士满、美国)如前所述组织匀浆,全血,孤立的白细胞( 42]。新鲜WT bmc和孤立 Pon2 ^{- /- - - - - -}老鼠离心机和resuspended修改克雷布斯消息灵通的缓冲区的浓度 1 × 10 7 细胞/毫升。50 μ(包含l细胞悬液/好 5 × 10 5 细胞)是装载在96孔板。添加40后化学发光被记录 μ在某些情况下M l - 012和10 μM DMNQ (2 3-dimethoxy-1 4-naphthoquinone) redox-cycling代理,诱发细胞内超氧化物阴离子和过氧化氢的形成。l - 012化学发光测定实验组同时为两个75分钟每4分钟使用一个微型板块Centro LB960光度计(Sprendlingen Berthold技术,德国)。光子数归一化化学发光的l - 012修改克雷布斯消息灵通的缓冲区。

细胞表面染色进行如上所述。随后,样本孵化Cytofix / Cytoperm (BD生物科学)15分钟。细胞被洗使用烫/洗,resuspended缓冲区包含反- ki - 67抗体(Alexa萤石647稀释1:30在烫/洗),和孵化至少30分钟。与烫/洗,洗后细胞resuspended在100年 μl 33342年赫斯特(PBS稀释1:500)和孵化15分钟。使用BD LSR II流式细胞分析仪分析,和数据分析利用BD FACSDiva™或FlowJo软件。所有控制策略如图 S5。

3 × 10 4 bmc WT和 Pon2^{- / -}老鼠培养在MethoCult™GF M3434(干细胞技术,德国科隆)按照制造商的指示。电镀后10 - 12天,殖民地Leitz则被量化,确定使用DM IL显微镜(徕卡,位于德国)。

归航骨髓造血细胞的分析中描述Yusuf和Scadden 43),但bmc被冲洗隔离而不是破碎的骨头。

细胞表面染色进行使用上面描述的血统鸡尾酒biotin-conjugated抗体以及链霉亲和素(APC-Cy7),本来(PECy7)和ckit (APC)。细胞被固定和permeabilized使用Cytofix / Cytoperm (BD生物科学),然后沾 γBioLegend H2AX抗体(Alexa萤石488年,圣地亚哥,美国:a) 2小时在冰上。数据采集进行FACSCanto II (BD生物科学)和柱状图叠加图像创建使用CellQuest Pro软件(BD生物科学)。

根据先前的研究,PON2表达水平最高的肺,小肠,心脏,肝脏( 44]。为了证明 Pon2信使rna表达以及确定特异性 Pon2表达公司,我们孤立的信使rna从FACS-sorted LT-HSCs, ST-HSCs,多能祖细胞(mmp),常见的髓系祖细胞(cmp), granulocyte-macrophage祖细胞(gmp),和组祖细胞(议员)和两步中存在执行分析。分析的影响redox-cycler DMNQ趋化因子受体CXCR4 mRNA表达,RNA是隔绝HPC7和BA / F3细胞治疗有或没有10 μM DMNQ 2到8 h。RNA是反向转录使用上标™很™大师混合(表达载体/热费希尔科学、Dreieich,德国)。然后,qPCRs进行使用引物和double-labeled探测器( 5 ′ 量 FAM公司 量 > 3 ′ TAMRA ;从欧陆坊基因组学、德国汉堡;表中列出 S1)或PrecisionPLUS 2 x qPCR MasterMix SYBR绿色(引物设计,钱德勒的福特,英国)所描述的制造商。信使rna表达水平进行分析根据先前建立的协议( 45),一般应用2看家基因( Gapdh, Actb;底漆使用,见下表 S1)。

对总RNA序列(RNA-seq)分析,林^{- - - - - -},Sca^{1 +},ckit⁺,CD135^{- - - - - -},CD150⁺细胞(代表LT-HSC和MPP2细胞更好的歧视以下称为肝星状细胞)( 46]从BM的年轻WT或被孤立 Pon2^{- / -}老鼠( n = 6 每个)流式细胞仪如上所述。10肝星状细胞/好,总共有8井/鼠标流式细胞仪分为96孔板(8 RNA-seq每48 RNA-seq鼠标和基因型),包含裂解缓冲(试剂盒,希尔登德国)。随后,细胞被移交基因组学研究所分子生物学的核心设施(美因茨,德国)RNA-seq使用Smart-seq2-protocol图书馆准备和NextSeq®500/550高输出装备v2 (Illumina公司、剑桥、英国)测序。原始测序读质量评估使用FastQC (Babraham生物信息学)和适配器使用Trimmomatic修剪(v0.36 [ 47])。生RNA-seq读取被映射到鼠标参考基因组(gencode发布M12 GRCm38.p5)使用星对准器(v2.5.3a [ 48]),选择“-quantModeGeneCounts”数读取映射每个基因的数量。高质量的数字读21.1到3260万读。67至76%的读取是对齐到老鼠基因组。DESeq2 (v1.18.1 [ 49)被用来识别基因差异表达 Pon2淘汰赛。基因与褶皱变化比2和罗斯福低于0.05被认为是差异表达。传播的分析使用ConsensuPathDataBase释放34 [ 50]。

所有公共RNA-seq或微阵列数据分析的文献进行了使用软件CLC基因组工作台(21.0.03版)使用制造商推荐的参数。

GraphPad棱镜软件(版本9),应用2-tailed学生的 t 以及(正态分布数据, 偏态 < 1 ),比较两组。超过2组,1路的方差分析与图基的多个测试或双向方差分析比较Bonferroni的多个比较测试应用。实验组的小鼠数量或数量的独立分析细胞实验的数据表示。 P < 0.05 被认为是显著的。

Pon2 mRNA表达以肝细胞的子集的bmc,已知表达Pon2 mRNA水平高,作为一个积极的控制。我们的结果(图 1)表明微分,特异性Pon2表达水平在0.15 - 1.35倍之间相比,肝细胞以及Pon2表达的变化在公司年龄的函数。在小动物(10 - 14周),LT -和ST-HSCs Pon2 mRNA表达水平低,稍微增加的承诺祖细胞(多能祖细胞(mmp),常见的髓系祖细胞(cmp))和显著增加组祖细胞(议员)(数据 1和 S1A)。相比之下,表达式分析公司年龄的动物(> 9个月)显示Pon2 mRNA水平最低的欧洲议会议员,通过和差,但更高的LT -和ST-HSCs(数字 1和 印地)。没有改变Pon2表达式的函数年龄观察肝细胞的控制。分析RNA-seq可用数据集的肝星状细胞和祖细胞的年轻老鼠(PRJNA603283 [ 51],PRJNA665066)展示了类似的模式Pon2 mRNA表达我们的实验(图中 1和 就是S1C)。最后,分析可用RNA-seq (PRJNA524895 [ 52],PRJNA528500 [ 53],PRJNA635499或微阵列数据集(GSE76276) [ 54];参见图 S1D)显示没有区别Pon2 LT-HSCs年轻之间的信使rna表达水平,年龄,或者旧的动物。

使用流式细胞仪分析不同公司的亚种群(数字 2(一个)- - - - - - 2 (g)LT-HSCs)显示显著增加和减少数量的mmp BM的年轻 Pon2^{- / -}老鼠WT动物相比。没有观察到显著变化的总林⁻本来就⁺c - kit⁺(LSK)细胞,ST-HSCs,通过gmp和欧洲议会议员。我们还确定的比率骨髓和外周血淋巴细胞(图 2 (h))。没有区别在骨髓/淋巴WT与比例 Pon2^{- / -} 老鼠被发现。

我们下一个测试Pon2不足的后果进行血细胞计数外周血种群的年轻Pon2^{- / -}使用Sysmex自动化血液学分析仪和WT老鼠。

与WT相比,Pon2^{- / -}小鼠白细胞(WBC、图相似 3(一个))和红细胞(RBC,图 3 (c)),但增加血红蛋白(Hb,图 3 (b))。此外,Pon2^{- / -}红细胞显示一些定性的异常,如增强意味着微粒体积(MCV,图 3 (d)),意味着微粒血红蛋白(妇幼保健,图 3 (e)),意味着微粒血红蛋白浓度(MCHC,图 3 (f))和降低红细胞分布宽度(RWD,图 3 (g))。

反对与骨髓公司亚种群,异常温和,LT-HSCs和边际产量有限,周边的血 Pon2有缺陷的小鼠红细胞严重违规行为。因此,我们未来Pon2是否进行测试^{- / -}有关红色的祖细胞同样数值异常。事实上,如图 4(一)- - - - - - 4 (c)成红血球细胞的染色流式细胞术分析 Pon2^{- / -} 百时美施贵宝证明增加数量在所有阶段的区别。我们也分析了红细胞细胞使用的寿命 在活的有机体内生物素酰化流式细胞术分析耦合。的重要性,Ter119-positive红细胞细胞 Pon2^{- / -} 小鼠寿命显著提高( t 1 / 2 = 16 在WT控件(天)相比 t 1 / 2 = 11 天)(图 4 (d))。

最后,我们评估的动态应力红细胞生成 Pon2^{- / -} 并通过腹腔WT诱导后小鼠的溶血PBS应用苯肼或控制物质。苯肼在WT引起强烈的红细胞计数减少小鼠的第五天开始治疗后(图 4 (e))。相比之下,预期的溶血是Pon2弱^{- / -}老鼠,血液中红细胞的比例仍明显高于(图 4 (e))。在control-treated动物、WT,之间没有显著变化 Pon2^{- / -} 动物被认为(图 4 (f))。

总之,这些数据表明一个特定的角色Pon2和寿命限制红色的承诺。

我们下一个旨在评估功能公司隔间的观察定量变化的重要性。确定的影响 Pon2对公司缺乏细胞内在或利基,我们进行相互的BM移植(见图 S2A),导致四个实验组,每组:WT接受者(r) / WT捐赠(d)和 Pon2^{- / -}(r) / Pon2^{- / -}(d)以及组成的嵌合体 Pon2^{- / -}(r) / WT (d)和WT (r) / Pon2^{- / -}(d)。成功的重建或损耗的Pon2受体小鼠的造血细胞被证实存在(图 开通)。后续流仪分析公司统计显示特异性和混合效果(细胞特定+利基效果)。互惠BM移植显示增加LT-HSC、CMP和议员数字(数字 S2C, S2F, S2G) Pon2^{- / -}动物收到 Pon2^{- / -}BM。没有重大分歧的嵌合体,这表明补充细胞内在和外在影响。

使用两种方法来分析基底ROS生产,我们调查了在稳态条件下小鼠的bmc Pon2^{- / -}老鼠WT动物相比。首先,我们分析了超氧化物/过氧化氢在BMC使用l - 012与化学发光检测调查。按照以前公布的抑制超氧化物/过氧化氢生产PON2 [ 10),我们发现明显增加l - 012在bmc年轻的化学发光信号 Pon2^{- / -}老鼠相比WT老鼠(图 5(一个))。此外,我们分析了在WT或总ROS水平 Pon2^{- / -}公司与荧光染料CM-H₂通过流式细胞术DCF-DA。测量了显著增强活性氧的形成 Pon2^{- / -}ST-HSCs和数字增强活性氧 Pon2^{- / -}mmp的年轻动物(图 5 (b))。有趣的是,在LT-HSCs没有观察到的差异。

我们假设PON2不足导致增加了肝星状细胞的凋亡细胞死亡。使用膜联蛋白V染色,我们分析了BM的凋亡LT - ST-HSCs百分比 Pon2^{- / -}并通过流式细胞术WT老鼠。这些测量显示显著减少膜联蛋白V-positive LT-HSCs但没有膜联蛋白的差异V-positive ST-HSCs在年轻 Pon2^{- / -}老鼠相比WT(数据 5 (c)和 5 (d))。我们还发现没有gamma-H2AX抗体的荧光信号强度的变化 Pon2缺乏LSK细胞相比WT细胞(图 S3A),表明遗传WT和稳定 Pon2^{- / -}老鼠,尽管ROS水平较高 Pon2^{- / -}老鼠。

分析是否LT-HSCs数量增加 Pon2^{- / -}动物可以提高健身,我们执行竞争BM移植化验。移植WT和 Pon2^{- / -}分析了bmc流式细胞仪利用细胞表面标记CD45.1 CD45.2,分别(图 5 (e))所描述的 41]。移植的WT和竞争 Pon2^{- / -}bmc 1: 1的比例显示显著的优势 Pon2^{- / -}bmc在早期的时间点(图multilineage重建 5 (f))而移植WT与相类似 Pon2^{- / -} 15周后细胞。

因为增加ROS水平会影响肝星状细胞的静止状态,可以刺激他们繁殖和分化( 18使用赫斯特33342年),我们进行细胞周期分析和ki - 67区分细胞G0 - G1 -以及G2, S -,有丝分裂期。我们在细胞周期状态的检测没有区别 Pon2^{- / -}相比LSK细胞或LT-HSCs WT细胞(数字 S4A和 S4B)。同样,克隆形成化验显示没有区别WT或克隆形成能力 Pon2^{- / -}bmc 10天后孵化。除了等量的总殖民地(图 自己),也没有特定的殖民地(图的数量的变化 S4D),表示没有Pon2-mediated对集落形成和分化的影响。

我们也分析了归航的bmc的能力。我们检查了归航效率使用荧光染料DiI和分析BM的致命辐照受体小鼠注射染色后48 h Pon2^{- / -}或WT bmc(图 S4E)。流仪分析显示在WT自导能力和没有差异 Pon2^{- / -}bmc(图 S3F)。因此,我们推测的频率就越高 Pon2^{- / -} 派生细胞在竞争BM移植早期点(图 5 (f))可能是由LT-HSCs的增加引起的 Pon2^{- / -} 派生的BM细胞(图 2 (b)),而不是由于增加健身的 Pon2^{- / -} 肝星状细胞。

按照分析年轻的老鼠,流式细胞术在BMC Pon2^{- / -}老鼠增加LT-HSCs演示。此外,一个令人惊讶的增长的比例达到指出,尽管所有其他承诺祖细胞保持在同类水平与控制老鼠(数字 6(一)- - - - - - 6 (g))。这些增加了GMP水平表明潜在的强化骨髓扭曲与WT老鼠相比,可明显证实了外周血的骨髓和淋巴转移率 Pon2^{- / -}老鼠(图 6 (h))。

总ROS的公司 Pon2^{- / -}老鼠是评估通过流式细胞术使用H₂DCF-DA染色。类似于年轻 Pon2^{- / -} 肝星状细胞,没有重大分歧ROS水平观察LSK分数的所有亚种群相比WT细胞(图 7(一))。再次,膜联蛋白V-positive细胞明显减少 Pon2^{- / -} LT -和ST-HSCs(数据 5 (b)和 5 (c)),而DNA损伤分析并未显示更高水平的DNA双链断裂而WT细胞(图 S3B)。

分析的功能 Pon2^{- / -}BMC,我们执行串行移植实验诱导像样的增殖压力。从WT岁和bmc是孤立的 Pon2^{- / -}老鼠。描述了老年动物的肝星状细胞增殖能力减少老鼠 在活的有机体内移植化验( 55]。因此,我们进行了2轮的移植(图 7 (d))。值得注意的是,旨在创建一个高压力的条件在骨髓粒子数再增,我们缩短了时间之间的主要和次要再移植到3周。这些实验显示无统计差异动物移植的存活率 Pon2^{- / -}或WT的bmc,尽管样本量较低(5和6的动物)。然而,符合观察LT-HSCs数量的增加和减少的细胞凋亡水平,更多的受体小鼠移植的bmc的年龄 Pon2^{- / -}捐助者还活着在21天的第二轮移植相比,接受者的bmc的野生动物(图 7 (e))。

虽然在祖细胞ROS水平增加,尤其是在老年小鼠,导致过早衰老表型频率增加骨髓祖细胞和转移myeloid-to-lymphoid比外周血的年龄 Pon2^{- / -}老鼠,我们没有观察到疲劳应力条件下表型。这个观察可能增加的结果LT-HSC数字或减少基线Pon2凋亡细胞死亡^{- / -}LT-HSCs。我们假设Pon2引起的损耗补偿计划在最早的造血阶段克服supraphysiological ROS水平的有害影响,我们发现在整个BM。为了解决这个假设,我们执行RNA-seq分析林^{- - - - - -},Sca^{1 +},ckit⁺,CD135^{- - - - - -},CD150⁺细胞(代表LT-HSCs和MPP2-hereafter称为HSC)从年轻WT或孤立 Pon2^{- / -}老鼠( n = 6 每个基因型)。整个肝星状细胞的转录组的比较从年轻WT或孤立 Pon2^{- / -}老鼠用DESeq2识别341个差异表达基因。其中,168个基因表达下调,157个基因调节 Pon2^{- / -}肝星状细胞而WT肝星状细胞(见表 S2和图 6 (b))。样本距离分析(见图 8(一个))之间并没有发现明显的集群 Pon2^{- / -}和WT组,与此同时类似传播资料的第一主成分(PC1)主成分分析(PCA)。尽管如此, Pon2^{- / -}显然和WT组分别聚集在第二主成分(PC2),导致我们相信,而离散的细胞过程/通路肝星状细胞的年轻人之间的不同 Pon2^{- / -}和WT动物。

我们注意到几个重要的监管机构的不同表达的细胞生存,如端粒酶( 叔)[ 56, 57]或NRF2通路的基因 Nfe2l2和 Abcc2( 58, 59和趋化因子受体CXCR4参与归航的规定,静止/扩散或迁移( 60]。值得注意的是,群体分析Pon2基因调节的^{- / -}肝星状细胞表现出显著富集的一个离散路径(图 8 (b))。最重要的是,CXCR4-mediated信号事件的途径达到最高水平的意义(FDRq 0.02)在整个数据库(图 6 (b);表 S3和 S4)。此外,治疗与ROS发电机DMNQ导致增强(约2.5倍)趋化因子受体CXCR4 mRNA表达HPC-7造血干细胞和BA / F3 pro B细胞(见图 8 (c)和 8 (d))。