文摘
心肌梗死与氧化应激和线粒体损伤有关。然而,在心肌梗死心肌细胞氧化应激的监管机制尚未完全了解。在目前的研究中,我们探索视神经萎缩的心血管作用1 - (Opa1)介导的线粒体自噬(mitophagy)氧化stress-challenged心肌细胞,专注于线粒体稳态和MAPK / ERK通路。我们的研究结果表明,过度的Opa1培养鼠H9C2心肌细胞,刺激mitophagy的过程,变弱氧化应激,提高细胞的抗氧化能力。激活Opa1-mediated mitophagy抑制心肌细胞凋亡的表达下调伯灵顿,caspase-9, caspase-12和移植bcl - 2和c-IAP。使用线粒体追踪染色和活性氧指标,我们的分析表明,Opa1-mediated mitophagy减毒在心肌细胞线粒体分裂和减少ROS生产。此外,我们发现抑制MAPK / ERK通路废除的抗氧化作用Opa1-mediated mitophagy在这些细胞。综上所述,我们的数据表明,Opa1-mediated mitophagy保护心肌细胞免受氧化应激损伤通过抑制线粒体分裂和激活MAPK / ERK信号。这些发现揭示的一个关键角色Opa1调制的心肌细胞氧化还原平衡,建议治疗心肌梗死的一个潜在的目标。
1。介绍
氧化应激在心肌细胞被认为是许多心血管疾病的主要病理因素,包括但不限于,糖尿病心肌病,心脏衰竭、心肌肥厚、心脏纤维化和扩张型心肌病(1- - - - - -3]。特别是最近的研究强调了重要作用的氧化应激诱导的心肌梗死(2,4,5]。在分子水平上,氧化应激诱导细胞膜的过氧化反应,包括线粒体膜、内质网的膜,等离子体膜。细胞膜系统的损伤破坏细胞新陈代谢,加速细胞衰老,促进细胞死亡(6,7]。虽然开发了几种抗氧化治疗心血管疾病,促进心肌细胞功能的恢复,几个问题仍然对上游调节机制控制这些细胞抗氧化反应(8- - - - - -11]。
氧化应激主要是由于过度生产和细胞内活性氧的积累(ROS) (12]。因为大多数细胞ROS产生在线粒体氧化磷酸化(13),这种细胞器被广泛认为是一个至关重要的目标在心血管疾病的治疗14- - - - - -16]。而生理(低)ROS水平服务信号功能和导致缺氧适应性反应,过量的活性氧了细胞的抗氧化防御系统和加剧线粒体活性氧的生产,最终促进细胞死亡(17]。因此,战略旨在保护线粒体和衰减ROS生产有很大的治疗心血管疾病的潜在管理(18]。我们之前的研究报告了一个线粒体自我保护程序涉及线粒体自噬(mitophagy)由视神经萎缩1 (Opa1),位于内线粒体膜蛋白(19]。温和的线粒体mitophagy促进线粒体周转率,加速受损的线粒体人口的回收以及块mitochondria-mediated细胞死亡信号(20.- - - - - -23]。然而,Opa1-related的作用在调节细胞氧化应激mitophagy不是完全理解,尤其是在心肌梗死的设置。
线粒体ROS生产似乎主要影响线粒体分裂,这一过程需要控制线粒体代谢和氧化磷酸化24,25]。人口增加线粒体,线粒体裂变的结果,将加速葡萄糖代谢,因此促进ATP生产,伴随着增强活性氧生成产生影响。因此,抑制线粒体分裂已经发现减弱心肌细胞ROS水平(26]。尽管mitophagy作为一种机制来去除多余/分散细胞器造成线粒体裂变,目前尚不清楚Opa1-mediated线粒体mitophagy发挥抗氧化作用通过抑制线粒体分裂。
MAPK / ERK通路已被报道为主要上游调节线粒体分裂(27]。有趣的是,还有一个密切联系MAPK / ERK信号和细胞抗氧化系统的活动28]。然而,Opa1-related线粒体mitophagy之间的关系,MAPK / ERK通路,线粒体分裂仍不清楚。因此,在目前的研究中,假设Opa1-related mitophagy抑制线粒体分裂和通过一个机制涉及氧化应激激活MAPK / ERK通路测试使用控制和Opa1-overexpressing H9C2心肌细胞的挑战与H2O2心肌梗死模型在体外。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和Adenoviral转导
H9C2写明ATCC和培养得到的细胞在DMEM / F12补充10%的边后卫(美国Abcam) 37°C和5%的股份有限公司2(29日,30.]。细胞( )被播种在six-well板块和转导Opa1-encoding腺病毒(Ad-Opa1;供应商)37°C 48 h使用Lipofectamine®2000(美国表达载体)31日]。诱导氧化应激损伤,H2O2(0.3毫米)被添加到媒介H9C2心肌细胞12 h (32]。
2.2。CCK-8化验
控制和Ad-Opa1-transduced H9C2细胞被播种到96 -孔板和孵化与H2O2(0.3毫米)12 h。那时CCK-8试剂添加到每个井和孵化4 h。吸光度检测在490纳米33]。
2.3。评估线粒体形态
H9C2细胞被播种密度 细胞/ 6-well盘子,培养24 h公司37°C的5%2和感染的莫伊50 Ad-Opa1 48 h。未感染H9C2细胞作为消极的控制。在暴露于H2O2(0.3毫米)或车辆12 h,黑暗中的细胞孵化为30分钟37°C的4μM MitoTracker™红色(34]。荧光显微镜(奥林巴斯、东京、日本)被用来分析线粒体形态。
2.4。线粒体膜电位的评估
H9C2细胞被镀和转导Ad-Opa1如上所述,处理车辆或H2O2(0.3毫米)12 h,在黑暗中孵化为20分钟37°C的1μL JC-1 1毫升的DMEM (35]。荧光显微镜是用来确定线粒体膜电位(36]。
2.5。ROS化验
细胞ROS红色荧光分析工具包(猫。不。GMS10111.1;美国GENMED科学,Inc .)被用来检测细胞内ROS。H9C2细胞( )被镀在96 -孔板和两天后暴露于H2O212 h。在一些实验中,细胞使用FCCP,激活线粒体分裂,或PD98059 MAPK / ERK抑制剂,之前接触H2O2。培养基是吸气,和100年μL染色工作的解决方案是添加根据制造商的指示37]。的混合是在37°C的环境在黑暗中20分钟,然后用PBS洗3次。ROS荧光( )测量标由SkanIt控制软件(猫。不。N16699;热科学,Inc .)、美国)38,39]。结果荧光比例相对于对照组。荧光显微镜在细胞播种6-well板块也表现在暴露于H2O212 h。DAPI染色后,一个evo®FL细胞成像系统(美国生活技术)是用来进行荧光成像技术(40]。
2.6。细胞抗氧化活动的评价
细胞抗氧化酶的活性测定通过ELISA如前所述41]。比色决定细胞抗氧化酶的活动进行使用谷胱甘肽还原酶测定工具包(Beyotime、中国、猫。没有:S0055),总超氧化物歧化酶分析工具包(Beyotime,猫。没有:S0101)和细胞谷胱甘肽过氧化物酶测定工具包(Beyotime,猫。没有:S0056) [42]。
2.7。TUNEL染色
心肌细胞凋亡是决定使用TUNEL细胞凋亡测定一步工具包(Beyotime)根据制造商的指示43]。TUNEL标记和DAPI后复染色,荧光显微镜捕捉到的图像。细胞凋亡是相对于对照组(表示为一个百分比44,45]。
2.8。免疫印迹分析
细胞收获和细胞溶解里帕缓冲区包含1%的蛋白酶抑制剂和1%的磷酸酶抑制剂(美国Wako)。溶菌产物是与3 x SDS混合样品缓冲2-mercaptoethanol和煮95°C的SDS - page(前5分钟46]。蛋白质被转移到PVDF膜(美国微孔)和免疫印迹与主抗体。膜被孵化与anti-mouse或anti-rabbit HRP-conjugated二级抗体(Bio-Rad 1: 1000年,美国)使用化学发光和可视化工具包(美国圣克鲁斯生物技术)或SuperSignal西方毫微微最大灵敏度衬底(热费希尔科学)47]。
2.9。rt - pcr
总RNA提取试剂盒试剂(表达载体)和处理DNase我删除基因组DNA。然后,500 ng是相对地转录成RNA cDNA上标IV第一链合成系统(表达载体)48,49)和实时定量rt - pcr进行使用快速SYBR绿色主人混合(费舍尔科学)根据制造商的指示,如前所述50]。变性的PCR协议由40周期在94°C 15年代,退火为15秒60°C,和扩展在72°C 1分钟,紧随其后的是一个7分钟伸展期在72°C (51]。目标基因的表达水平是规范化的内生磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) [52]。
2.10。统计数据
数据了 。每一个在体外实验至少进行三次。意义( )通过学生的决心吗 - - - - - -测试比较两组,通过双向方差分析比较三个或更多的团体。
3所示。结果
3.1。Opa1-Mediated Mitophagy减弱活性氧产量和线粒体功能障碍
调查的角色Opa1-related mitophagy生产活性氧和线粒体功能障碍,培养H9C2心肌细胞转导与一个adenoviral向量编码Opa1 (Ad-Opa1)之前接触H2O2(0.3毫米)诱导的氧化应激微环境。Nontransduced细胞被用作控制。如数据所示1(一)和1 (b),线粒体活性氧的生产在nontransduced心肌细胞显著增加,显著抑制细胞overexpressing Opa1。因为线粒体ROS生产过剩与氧化应激和线粒体和细胞功能障碍,我们接下来评估控制和Opa1-transduced心肌细胞线粒体的功能。如数据所示1 (c)和1 (d),线粒体膜电位降低了H2O2暴露在控制细胞,但仍然在很大程度上影响Opa1超表达。过度的线粒体损伤与mitochondria-dependent心肌细胞死亡。使用ELISA,我们发现线粒体通透性转换孔的速率注射(mPTP药物),早期缺血再灌注损伤后心肌细胞死亡的标志,显著提升控制心肌细胞治疗H2O2。然而,过度的Opa1注射能够阻止mPTP药物打开(图1 (e))。这些数据表明,Opa1-mediated mitophagy抑制线粒体ROS生产和维护线粒体氧化应激微环境下的函数。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.2。Opa1-Induced Mitophagy增加细胞抗氧化酶的活性
因为线粒体氧化应激也可以从抗氧化能力下降,结果我们被问及Opa1-induced mitophagy也会调节抗氧化酶的活性。我们发现谷胱甘肽的含量,SOD、GPX显著降低在H2O2治疗心肌细胞。有趣的是,这些变化是由Opa1逆转过度(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。因为细胞抗氧化酶的活动主要是在转录水平调节,我们评估的影响Opa1超表达两个关键转录因子的表达,也就是说,Nrf2 HO-1,调节抗氧化酶的表达。qPCR分析结果表明,Nrf2和HO-1 mRNA水平显著下调在心肌细胞治疗H2O2而是调节后Opa1过度(数字2 (d)和2 (e))。这些数据表明,Opa1-mediated mitophagy提高心肌细胞的抗氧化潜力通过转录的upregulation HO-1 Nrf2。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3。Opa1-Mediated Mitophagy维持心肌细胞氧化应激条件下的生存能力
在氧化应激条件下,线粒体功能受损和有限的抗氧化能力降低心肌细胞的生存能力通过激活细胞死亡通路。CCK-8化验的结果表明H9C2细胞的生存能力在应对显著降低H2O2治疗。相比之下,细胞生存能力明显被Opa1拯救过度(图3(一个))。这一发现进一步分析使用TUNEL染色。如数据所示3 (b)和3 (c)暴露于H后,细胞凋亡显著提升2O2。反过来,诱导mitophagy通过Opa1超表达明显减少心肌细胞凋亡的数量。探讨分子基础底层Opa1-mediated凋亡作用,西方的屁股被用来分析细胞死亡相关蛋白表达的变化。如数据所示3 (d)- - - - - -3(我)伯灵顿的显著增加,caspase-9 caspase-12表达式,平行的差别,对这些基因bcl - 2和c-IAP表达式,在心肌细胞治疗H2O2。有趣的是,Opa1过度后,proapoptotic蛋白质的表达减少,而凋亡蛋白的水平恢复至接近正常水平。这些数据表明,减少心肌细胞生存能力由H2O2接触可以逆转Opa1-induced mitophagy。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
3.4。Opa1-Mediated Mitophagy抑制线粒体分裂
最近的研究报告说,线粒体分裂是主要的触发线粒体活性氧的生产过剩通过加速葡萄糖代谢。评估是否Opa1-mediated mitophagy可以减弱异常线粒体氧化应激条件下裂变,心肌细胞线粒体形态在培养H9C2首次检查使用MitoTracker染色。如数据所示4(一)- - - - - -4 (c)H2O2治疗引起大量线粒体分裂,就是增加细胞器的平均长度和数量。相比之下,这些变量都是显著规范化Ad-Opa1-transduced心肌细胞。提供更多的证据支持的监管作用Opa1-related mitophagy线粒体裂变,qPCR fission-related蛋白质的转录水平进行分析。如数据所示4 (d)- - - - - -4 (g),与对照组相比,Drp1的表达,Fis1, Mid49, Mid51明显增加心肌细胞治疗H2O2。然而,与Opa1刺激mitophagy转导后,Drp1, Fis1, Mid49, Mid51 mRNA水平明显调节。综上所述,这些研究结果表明,Opa1-related mitophagy抑制线粒体分裂在H2O2治疗心肌细胞。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
评估是否Opa1压制线粒体ROS通过线粒体分裂的失活,之前接触H2O2,使用FCCP Opa1-overexpressing心肌细胞,线粒体分裂的一个催化剂。如数据所示4 (h)和4(我),FCCP废除了抑制Opa1 ROS生产引起的过度。总体而言,我们的数据表明Opa1-mediated线粒体ROS抑制可归因于减少线粒体分裂。
3.5。Opa1-Mediated Mitophagy激活MAPK / ERK信号通路
MAPK / ERK通路以来监管报告,线粒体活性氧的生产,我们想知道是否Opa1-mediated mitophagy限制心肌细胞的活性氧产量通过激活MAPK / ERK信号。免疫印迹结果表明p-ERK的表达显著下调心肌细胞治疗H2O2,这种影响是抑制Ad-Opa1转导(数字5(一个)和5 (b))。如数据所示5 (c)和5 (d)p-ERK免疫荧光后,也观察到类似的结果。基于上述数据表明Opa1-mediated mitophagy是一个上游激活MAPK / ERK通路,MAPK / ERK活化的参与Opa1-mediated线粒体ROS抑制是评估使用PD98059 MAPK / ERK信号传导抑制剂。如数据所示5 (e)和5 (f)在H, Opa1施加的抑制过度2O2全身的线粒体ROS PD98059孵化后生产显著抑制。总的来说,这些数据表明,Opa1-mediated mitophagy变弱线粒体ROS生产通过激活MAPK / ERK信号通路。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
介绍了虽然及时的再灌注治疗心肌梗死的临床治疗,器官复苏受阻所导致的心肌细胞死亡这些治疗方法。氧化应激已被确定为主要病理因素调节心肌细胞功能障碍和再灌注治疗后心肌梗死和死亡。虽然开发了几种抗氧化剂治疗心肌梗死患者管理的机制,调节抗氧化反应的dt -心仍不清楚。在目前的研究中,我们确定了Opa1-mediated mitophagy的负调节心肌细胞氧化应激通过阻止线粒体分裂和激活MAPK / ERK通路。据我们所知,这是第一个证据之间的关系Opa1-mediated mitophagy和心肌细胞氧化应激在体外心肌梗死模型。因此,我们的研究结果表明,一种很有前途的新目标治疗这种情况和缺血再灌注的病理表现。
心肌细胞含有大量的线粒体,代谢葡萄糖生产所需的大量的ATP维持心脏功能。因此,线粒体损伤诱发不良代谢改变,导致心肌细胞功能障碍和死亡(53]。因为线粒体也发挥着基础性的作用在传输和放大proapoptotic信号缺血性侮辱,这些细胞器代表治疗心肌梗死的主要目标(54,55]。事实上,密集的研究发现潜在的治疗途径针对心肌细胞线粒体功能障碍。例如,硫氧还蛋白被发现通过维持线粒体形态,从而减弱心肌梗死redox-dependent激活信号分子(56]。通过稳定改善线粒体功能在心肌梗死Mzb1据报道的表达减弱的炎症反应和延迟心脏纤维化57]。抑制线粒体活性氧的生产,从而衰减的氧化应激已经被发现可以增强心肌细胞ATP供应和维持收缩功能在缺氧/复氧压力(58- - - - - -60]。通过删除PGAM5 mitochondria-mediated细胞死亡的封锁了改善线粒体质量控制和减少心肌梗塞大小(61年]。反过来,减少线粒体钙超载的超表达SERCA的报道来改善心肌灌注和新陈代谢62年]。
在目前的研究中,线粒体氧化应激诱导的损害是线粒体膜电位下降、线粒体ROS增加生产,提升表达mitochondria-related proapoptotic蛋白质。重要的是,我们进一步表明,增强mitophagy由Opa1超表达能够减弱氧化stress-challenged心肌细胞线粒体损伤。提供的保护机制Opa1-mediated mitophagy涉及抑制线粒体裂变和激活MAPK / ERK通路。mitophagy对线粒体的保护作用体内平衡和心肌细胞生存能力被广泛报道63年- - - - - -65年]。例如,irisin治疗显著激活Opa1-mediated mitophagy从而抑制心肌细胞线粒体凋亡心肌梗死后(66年- - - - - -68年]。反过来,激活Fundc1导致mitophagy维持线粒体代谢和促进缺血性心肌线粒体生物起源的69年,70年]。这些发现也与我们的结果一致。有趣的是,我们的数据进一步说明的监管作用Opa1-mediated mitophagy抑制线粒体的裂变,通过删除通过溶酶体降解成碎片线粒体。
最后,我们还报告,Opa1-mediated mitophagy上游是一个引发心肌细胞MAPK / ERK通路。这是与之前的研究一致,在老年帕金森小鼠进行(71年- - - - - -73年),在睡眠呼吸暂停的小鼠模型74年),在模型doxorubicin-induced毒性(75年,强调了mitophagy和ERK信号通路之间的关系。考虑必要的ERK在调节心肌细胞代谢所扮演的角色和ATP生成,mitophagy-induced ERK激活似乎作为一个关键机制支持在缺氧条件下线粒体代谢和氧化磷酸化。
综上所述,我们的研究结果表明,Opa1-mediated mitophagy函数作为一个保护程序在心肌细胞对氧化应激通过两种不同的机制:一个参与抑制线粒体的分裂和其他由激活MAPK / ERK通路。然而,我们的研究有许多局限性,需要解决。首先,我们使用在体外的保护作用实验来阐明Opa1-mediated mitophagy氧化stress-challenged心肌细胞。因此,动物实验是必要的来验证我们的发现在活的有机体内(76年]。同时,尽管我们的研究强调了功能的重要性Opa1-mediated mitophagy在心肌细胞生存和功能,进一步研究其保护机制受限于缺乏专门的药物激活Opa1在心肌细胞(77年]。
数据可用性
在当前生成的数据集分析研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
概念和方法是由王曰和志华汉;形式分析和数据管理是由王曰和徐Zuojun;验证和调查是由王曰;和草稿准备,审查和编辑是由Junfeng张和王曰。所有作者阅读和批准提交前最后的手稿。
确认
本研究由国家自然科学基金委支持(排名81970289)和上海自然科学基金一般项目(排名12 zr141740)。