文摘

背景。过度的心肌氧化应激会导致充血性心力衰竭。NADPH氧化酶参与左心室(LV)重构的病理过程和功能障碍。β3-Adrenergic受体(AR)可以调节心脏功能障碍证明了最近的研究。的分子机制β3-AR调节氧化应激,尤其是NADPH氧化酶,仍有待确定。方法。心脏肥大是由横向构造主缢痕(TAC)模型。ROS和NADPH氧化酶亚基表达进行了评估β3-AR受体激动剂(BRL)或抑制剂(SR)政府在心脏肥大。此外,心脏功能、纤维化、心脏大小、氧化应激和心肌细胞凋亡的检测也。结果。β3-AR激活显著缓解心脏肥大和重塑pressure-overloaded老鼠。β3-AR刺激也改善心脏功能和心肌细胞凋亡,减少氧化应激和纤维化。与此同时,β3-AR刺激抑制超氧化物阴离子生产和降低NADPH氧化酶活性。此外,BRL治疗增加了神经元NOS (nNOS)表达在心脏肥大。结论。β3-AR刺激心脏功能障碍,减少心肌细胞凋亡,减轻氧化应激和纤维化通过抑制NADPH氧化酶类。此外,的保护作用β3-AR很大程度上归因于nNOS激活心脏肥大。

1。介绍

尽管治疗方法的进步,充血性心力衰竭(CHF)仍有待高发病率和死亡率(1,2]。相当多的证据显示,过量的氧化应激导致瑞士法郎(3- - - - - -5]。实验发现,氧化应激激活与心脏肥大(动物模型6,7]。此外,ROS增加可能导致不仅心脏肥大和心肌细胞凋亡,而且许多其它疾病如急性肾损伤(8- - - - - -12]。此外,瑞士法郎也发现患者氧化应激的标记,表明氧化应激增加在失败的心13]。

ROS主要源于NADPH氧化酶类在心血管系统(14]。典型的NADPH氧化酶类包括氮氧化物、p22phox p40phox, p47phox p67phox, Rac1。组装时,电子会从NADPH转移到分子氧,导致超氧化物的形成(15]。NADPH氧化酶水平提高与心脏肥大和动物模型甚至在CHF患者(5,16]。最近的研究发现,缺NOX2减毒血管紧张素II-induced心脏肥大(17]。此外,Rac1 NOX2激活的重要单元,调节心肌肥大的发生和发展18]。综上所述,这些研究结果表明NAPDH氧化酶类在心脏肥大起着关键的作用。然而,临床应用抗氧化剂已经取得了令人失望的结果,表明氧化应激和心脏之间的具体关系失败仍然需要探索(19]。因此,我们的研究目的是探索分子机制,发现小说治疗心力衰竭治疗的目标。

越来越多的证据表明,3亚型βars调节心脏功能当暴露在压力(20.,21]。的生物学功能β1,β2-AR在哺乳动物中是彻底的研究在过去的几年中22]。以前的研究表明β3-AR起到负性肌力作用,相反的效果β1/2-ARs [23]。此外,β3- / -老鼠加剧心脏肥厚和心力衰竭。然而,是否的生物功能β3-AR期间由氧化应激调节心脏衰竭仍然是不确定的。因此,有必要澄清的突出机理β在氧化应激3-AR,特别是NADPH氧化酶在心脏肥大。

2。方法动物

8-10-week-old男性C57BL6 / J小鼠被随机分配如下:[1]虚假的集团(假的);[2]横向主缢痕集团(TAC);[3]TAC + BRL37344组(TAC + BRL);和[4]TAC + SR59230A集团(TAC + SR)。批准的实验第四军医大学动物保健委员会。

2.1。横向主缢痕模型的建设

横向主缢痕(TAC)如前所述。简单地说,老鼠和2%异氟烷麻醉,气管内插管20克导管,和通风。横向主动脉弓手术访问。然后,25 g针放置在横向主动脉,是安全的。最后,胸部被关闭删除针后,留下一个狭窄。老鼠与BRL37344管理(Ellisville Tocris生物科学,密苏里州)或SR59230A,分别在0.1毫克/公斤/小时通过渗透微型泵。

2.2。原发性心肌细胞文化和治疗

原发性心肌细胞分离得到新生儿鼠标(1 - 3天)心如前所述。心肌细胞肥厚性受体激动剂治疗,去甲肾上腺素(PE)。24小时后,心肌细胞治疗与BRL37344或SR59230A。组如下:[1]盐水;[2]体育;[3]PE +强;和[4]PE + SR。

2.3。细胞的大小

原发性心肌细胞受到免疫染色。抗体来源如下:α辅肌动蛋白(1:200年,Abcam);alexa - 594二级抗体(1:500年,英杰公司)。

2.4。组织学分析和免疫染色

三周后TAC操作,老鼠牺牲。组织部分的心被沾着马森的三色的(σ)检测肝纤维化。fibrosis-related Col1a1基因,Col3a1, fibrillin 1 (FBN1)被q-PCR检测。同时,麦胚凝集素(WGA、σ)用于心肌细胞轮廓。心肌细胞横截面积是决定使用ImageJ从数字化图像和分析程序。ANP、BNP q-PCR探测到。分析心肌NAD (P) H氧化酶亚基的表达,免疫组织化学染色法NOX2, NOX4,第22位phox进行如前所述。主要的抗体是NOX2(1: 200年,Abcam) NOX4(1: 200年,Abcam)和第22位phox(1:200年,Abcam)。

2.5。超声心动图

超声心动图研究进行每周监测心脏功能(如前所述)(19]。我们跟着小林的方法刘et al . (2014)。

2.6。细胞凋亡检测

细胞凋亡在心脏组织确定基于TUNEL和caspase-3活动分析如前所述[19]。

2.7。氧化应激水平的测量

生产的啊2•- - - - - -在LV测量如前所述。同时,原位形成的组织活性氧被染色发现她和DCF最近所描述。简单地说,新鲜冷冻左心室部分与她孵化(2μM;分子探针)或DCF (4μM;分子探针),分别。SOD的活动及谷胱甘肽检测根据Beyotime板。

2.8。蛋白质制备和免疫印迹

从均质膜蛋白或细胞总蛋白提取LV组织。主要的抗体包括NOX2 NOX4第22位phox,p47phox,p67phox,Rac-1(1: 500年,Abcam);以挪士,p-eNOSSer1177,p-eNOSThr495,p-eNOSSer114伊诺,nNOS(1: 1000年,细胞信号技术),β3-adrenergic受体(1:500年,Abcam)β肌动蛋白(1:5000年,Abcam)。

2.9。统计分析

并给出了结果 。所有实验数据分析GraphPad Prism8软件。统计比较不同组使用单向方差分析执行之后,学生的配对,双尾 测试了两组的比较。 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。β3-AR刺激减轻心脏肥大和重塑Pressure-Overloaded老鼠

红心代表数据表明,压力过载引起的心室扩张(图1(一))。同时,心脏重量/胫骨长度比在TAC (HW / TL比率)相比显著增加虚假的( vs。 , ),成功表明压力超负荷诱导心脏病理重构。此外,横截面积,LV质量、壁厚增加后TAC操作(数据1 (b)和1 (d)- - - - - -1 (f))。这些结果表明,小鼠心脏肥大引起的TAC发达明显。然而,3周的BRL应用程序大大缓解LV扩张,心脏肥大,心脏病理重构。ANP、BNP水平显著降低BRL治疗后在TAC小鼠(数字1 (g)和1 (h))。心肌细胞的大小在PE + BRL组相比非常小的PE组(数字1(我)和1 (j))。因此,β3-AR刺激减少心肌肥厚和压力超负荷引起的重构。

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图1
β3-AR刺激减轻心脏肥大和重塑pressure-overloaded老鼠。(一)代表心脏大小的图像。(b)心肌细胞大小彩色的编剧。(c) HW / TL。(d)心肌细胞大小的定量分析。(e, f) LV质量和壁厚测量超声心动图。(g h) ANP、BNP的表达水平。(i, j)主要心肌细胞大小的彩色α辅肌动蛋白。老鼠的数量( )。 。
3.2。βTAC后3-AR刺激减少纤维化

BRL治疗显著降低纤维化与TAC集团(数字2(一个)和2 (b))。此外,间质纤维化中检测出的增加趋势TAC +老群,这是一个β3-AR-specific抑制剂,虽然没有意义。此外,Col1a1的水平,Col3a1 FBN1都减少了TAC小鼠BRL治疗后(数字2 (c)- - - - - -2 (e))。

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图2
βTAC后3-AR刺激减少纤维化。(a, b)心脏纤维化的程度。(汉英)纤维重建标记基因的表达(Col1a1, Col3a1, FBN1)。老鼠的数量( )。 。
3.3。β3-AR刺激改善在TAC小鼠心脏功能障碍

如图3(一个)TAC,收缩功能障碍了,老TAC +组。相反,BRL TAC手术后治疗增强LV前壁运动,表明β3-AR刺激可以改善心脏功能障碍引起的过载压力。此外,LVEDd TAC小鼠LVESd增加。此外,LVEDd, LVESd TAC小鼠BRL治疗后明显下降(数字3 (b)和3 (c))。同样,提高LVEF和FS TAC + BRL组的观察,表明β3-AR刺激改善心脏功能障碍在TAC(数字3 (d)和3 (e))。

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图3
β3-AR刺激改善压力overload-induced心脏功能障碍。(一)超声心动图的形象代表。(中)LVEDd, LVESd、LVEF和LVFS由超声心动图测量。老鼠的数量( )。 。
3.4。在TAC小鼠心肌细胞凋亡的抑制是BRL治疗

图4(一)显示,相比老交集团和交+组,BRL治疗明显减少心肌细胞凋亡指数。TAC + BRL组细胞凋亡指数 ,不到,在TAC集团( , )老和TAC +集团( , )(图4 (b))。同时,caspase-3酶活性降低的TAC + BRL组相比TAC组( vs。 , )老和TAC +集团( vs。 , )(图4 (c))。这些数据表明β3-AR pressure-overloaded心脏刺激细胞凋亡的减少。

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图4
在TAC小鼠心肌细胞凋亡的抑制是BRL治疗。(a, b)代表的图像TUNEL染色,细胞凋亡指数。(c) Caspase-3活动。老鼠的数量( )。 。
3.5。β3-AR刺激减少Pressure-Overloaded小鼠氧化应激水平

ROS的产生,以她和DCF染色,显著增加了TAC组和TAC +老组。然而,BRL治疗显著降低ROS生成pressure-overloaded老鼠(图5(一个))。与此同时,NADPH氧化酶活性增加TAC集团( 单位/分钟/ mg vs。 单位/分钟/毫克; )老和TAC +集团( 单位/分钟/ mg vs。 单位/分钟/毫克; )。NADPH氧化酶活性较低的TAC + BRL组相比TAC组( 单位/分钟/ mg vs。 单位/分钟/毫克; ,图5 (b))。同样,阿2•- - - - - -TAC + BRL组的生产较低的价格相比TAC集团( vs。 ; ;图5 (c))。SOD水平,谷胱甘肽增加TAC + BRL组相比TAC组(数字5 (d)和5 (e))。这些发现表明,β3-AR刺激减少氧化应激引起的过载压力。

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图5
β3-AR刺激减少pressure-overloaded小鼠氧化应激水平。(一)代表她和DCF染色的图像。(b) NADPH氧化酶活性。(c)的生产2 •- - - - - -在心脏组织。SOD与谷胱甘肽活动(d, e)。老鼠的数量( )。 。
3.6。BRL治疗规范NADPH氧化酶亚基的表达和激活

我们评估了细胞内的表达NADPH氧化酶亚基由西方螺栓试验。膜结合亚基的表达,p22phox NOX2, TAC组显著增加,被BRL治疗(数字6(一)- - - - - -6 (g))。然而,在所有组NOX4持平的表达。p67phox,此外,膜的表达p47phox Rac1,胞质子单元,显著调节TAC组和TAC +老组。此外,BRL治疗导致p47phox表达降低,p67phox, Rac1。

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图6
BRL治疗规范NADPH氧化酶亚基的表达和激活。(g)免疫印迹分析NOX2 NOX4第22位phox,p47phox,p67phox,Rac1表达式。 。
3.7。β3-AR刺激调节激活和NOS的表达亚型

免疫印迹分析进行评估β在所有组3-AR表达式。的减少β观察3-AR TAC和TAC +老组(数字7(一)和7 (b))。相反,的表达β3-AR BRL治疗后增加。我们进一步评估NOS的表达亚型在所有组。首先,总以挪士和磷酸化的表达以挪士Ser114没有改变。然而,TAC操作大大减少以挪士的磷酸化Thr495但增加phospho-eNOS的表达式Ser1177,它已经被废止BRL治疗。此外,我们研究了伊诺和nNOS的表达。在伊诺表达式没有区别在所有组(数字7(一)和7 (d))。相反,压力过载nNOS的心脏表现下降,增加了BRL治疗数据7(一)和7 (h))。

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图7
β3-AR刺激调节激活和NOS的表达亚型。(a)免疫印迹分析β3-AR、nNOS p-eNOSThr495,p-eNOSSer114,p-eNOSSer1177以挪士,进气阀打开。 。

4所示。讨论

心脏重塑,瑞士法郎的主要决定因素,与病理性心脏肥大(20.]。最初,心脏肥大发生作为一种适应性反应,维持正常的心脏功能改善心室壁应力和输出。然而,持续的压力负荷导致病理性心室肥大,导致心脏衰竭和恶性心律失常(20.]。我们的研究表明,持续的压力过载3周诱导心脏肥大和心肌细胞氧化应激和细胞凋亡增加,与心脏功能受损有关。但这些压力过载的影响可以废除β3-AR刺激,这是符合我们之前的研究(24]。

氧化应激参与了心肌细胞凋亡,心脏重构,心脏功能障碍和心力衰竭(25- - - - - -28]。氧化应激和相关的线粒体损伤与许多疾病的进展密切相关(29日,30.]。先前的研究表明增加NADPH氧化酶活性在晚期失败心肌(16]。和增加证据表明心肌NADPH氧化酶在心血管疾病的重要作用[31日- - - - - -33]。NADPH氧化酶活动参与充血性心力衰竭的病理生理学。在我们的研究中,β3-AR刺激减轻氧化应激通过抑制NADPH氧化酶类。此外,强的心脏保护作用是通过没有通过nNOS生成途径介导的。

氮亚基与p22phox单元形成一个稳定的异质二聚体。在所有氮氧化物提交,NOX2 NOX4主要富集在心肌细胞。先前的研究显示,NOX2缺乏抑制心脏肥大(17]。有趣的是,最近的一项研究表明,心脏功能障碍在NOX4-null夸张的老鼠。此外,NOX4淘汰赛夸张的心脏功能障碍当暴露于慢性过载,指示NOX4协调保护压力(34]。在目前的研究中,TAC治疗增加了NOX2表达,而表达的NOX4持平在所有组。因此,我们的结果表明,NOX2压力overload-induced装修期间是有害的。此外,胞质亚基的表达,包括p47phox p67phox,和Rac1显著调节TAC小鼠。综上所述,我们发现的组合NOX2一系列的子单元直接激活NADPH氧化酶类并生成过氧化物,随后导致压力overload-induced心脏损伤。

它已经表明,3亚型βars可能调节心脏功能。其中,β1-AR和β2-ARs调解积极变时性和变力作用20.,21]。β据报道,3-AR调解脂类分解和脂肪细胞的生热作用35]。然而,β3-AR还参与心血管系统的监管,这可能对抗的影响β1/2-ARs。此外,β3-AR增加在失败的心24]。与此同时,β心脏肥大(3-AR过度减毒36]。此外,β3淘汰加剧压力超负荷引起的心肌肥大(24]。在当前的研究中,β3-AR刺激减少肥大、阻止纤维化和保存压力超负荷引起的心脏功能。此外,β3-AR刺激减少了TAC小鼠超氧化物的一代。与此同时,NADPH氧化酶活性也降低β3-AR刺激,表明的保护作用β3-AR介导,至少部分,通过抑制NADPH氧化酶类,导致心脏引起的氧化应激压力过载(图8)。

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图8
原理图描述参与保护作用的可能机制β3-AR受体激动剂在心脏肥大。

β3-AR刺激可能没有释放增加NOS活性(36]。此外,我们先前的研究已经表明β3-AR淘汰赛加剧NOS解偶联,表明β3-AR调节心脏氧化酶压力通过调节没有代NOS活性(24]。三号亚型都没有释放有关。然而,NOS同种型调节心脏功能β3-AR信号仍然不清楚。以挪士的活动主要是受eNOS-PSer1177, eNOS-PThr495, eNOS-PSer114。在Ser1177磷酸化激活以挪士,而磷酸化在Ser114 Thr497抑制以挪士活动(37]。在目前的研究中,p-eNOS下降Thr495和增加p-eNOSSer1177观察慢性压力超负荷BRL治疗后。因此,β3-AR刺激导致以挪士失活而不是激活。相反,β3-AR刺激nNOS的表达增加。此外,nNOS表达式和nNOS-derived没有生产调节心脏功能(30.]。的心血管效应β在nNOS 3-AR实际上废除了- / -老鼠(24]。基于这些结果,nNOS可能的主要下游β3-AR(图8)。

总之,我们提供证据证明β3-AR刺激调节氧化应激通过抑制NADPH氧化酶类,心脏功能受损。此外,这些心血管效应β3-AR在很大程度上归因于nNOS激活。这些鼓舞人心的观测提供了新颖的见解β心脏肥大3-AR作为治疗的新目标。

数据可用性

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章;进一步询问可以针对相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

明明张、徐Yuerong Jianghong陈,Chaoshi秦贡献同样这项工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81570227,81900338),科学技术发展基金(2021 xb030),和陕西省科技新星项目(2015 kjkk-52)。