文摘

缺血性中风是一种严重的急性神经障碍和目前有限的治疗策略。氧化应激是缺血/再灌注损伤的重要病理因素,和高水平的活性氧(ROS)可能驱动神经细胞凋亡。拯救半影神经元是一个潜在的方法从缺血性中风中恢复过来。内生的强有力的ROS水平弄熄的谷胱甘肽(GSH)脑缺血后显著降低。在这里,我们旨在调查的神经保护作用γ-glutamylcysteine (γgc),立即谷胱甘肽的前体,在神经元细胞凋亡在缺血性中风和脑损伤。大脑中动脉闭塞(MCAO)和oxygen-glucose剥夺/复氧(OGD / R)被用来模拟脑缺血小鼠,神经细胞系和主神经元。我们的数据表明,外生γgc治疗减轻氧化应激的调节谷胱甘肽和减少ROS水平。此外,γgc的缺血/ reperfusion-induced神经元细胞凋亡和脑损伤体内和体外。此外,转录组方法和后续验证研究表明γgc的半影神经元细胞凋亡的抑制蛋白激酶的激活类似内质网激酶(活跃)和inositol-requiring酶1α(IRE1α在内质网(ER)应力信号通路OGD / R-treated细胞和缺血性脑组织。我们所知,本研究是第一个报告γgc变弱ischemia-induced神经元细胞凋亡抑制ROS-mediated ER应激。γgc可能是一种有前途的治疗缺血性中风的代理。

1。介绍

中风已经成为全球第二大死亡原因,严重影响公共卫生。据统计,缺血性中风占大约80%的中风(1]。虽然血管再通治疗重组组织纤溶酶原激活物(Rt-PA)是有效的,受益人口不到10%的时间窗口问题2]。事实上,经常出现再灌注损伤由血管再通。因此,迫切需要发展新的治疗策略来预防缺血性脑损伤。

大多数研究人员现在认为,神经元的缺血半影的电气故障;虽然神经功能异常,这些细胞仍然是可行的。改善缺血半影神经状态和功能直接影响中风的结果(3,4]。尽管再灌注损伤的病理生理机制是复杂的,它已经表明,过度生成活性氧(ROS)是再灌注损伤的一个特点5,6]。在急性期的脑缺血,血管封锁导致神经细胞钙超载和能源消耗,从而诱导活性氧的积累和随后的脑损伤后氧气和营养的补给。过度形成活性氧引起的缺血性中风了内源性抗氧化系统和诱发神经元死亡通过多种途径,包括内质网(ER)压力诱导细胞凋亡和ferroptosis [7,8]。因此,衰减过多的活性氧的生产可以减少模糊神经元的凋亡,预防缺血性脑损伤。

越来越多的证据表明,ROS不能容易回收的活动和低水平的抗氧化剂在缺血性脑9,10]。药物不良反应是目前上市的药物用于治疗缺血性中风的临床部分通过捕获和减少过多的活性氧(10,11]。然而,肾脏疾病,治疗期间或之后发生药物不良反应有注意12,13]。除了药物,一些内源性物质还可以清除ROS。其中,谷胱甘肽(GSH)是一种强有力的冷却器ROS (14]。有人建议,谷胱甘肽水平大大降低皮层和纹状体的梗塞的半球。口服的外源谷胱甘肽产生一种保护作用对大鼠缺血性中风(15]。防治(NAC)是一个谷胱甘肽前体,据报道,增加神经元生存和减少大鼠缺血梗死体积的大脑中动脉阻塞(MCAO)模型16]。虽然动物模型研究表明,外源谷胱甘肽和NAC治疗对脑缺血的影响,这些代理仍然远离适合临床应用。血液中的外源谷胱甘肽可以迅速代谢,和交付的谷胱甘肽对中枢神经系统受到的存在血脑屏障(BBB) [17]。南汽、三酶是参与谷胱甘肽的合成从南京,和γ-glutamylcysteine连接酶(GCL)是一种病原这个过程的酶(18]。此外,南汽的口腔生物利用度也妨碍了其临床使用(19]。

γ-Glutamylcysteine (γgc)是一种直接的谷胱甘肽的前体。与南京汽车不同的是,γgc提出促进谷胱甘肽合成,只需要催化谷胱甘肽合成酶(GSS)和合成谷胱甘肽的这种方式是容易和简单20.,21]。此外,外源γgc容易穿过BBB,可以由许多细胞类型。刘等人发现,膳食补充剂γgc的空间记忆改善阿尔茨海默病(AD)老鼠通过增加总谷胱甘肽和减少氧化应激和神经细胞凋亡的水平22]。最近的一项研究表明,γgc施加对低聚物的抗氧化和抗炎作用β₄₀全身的星形胶质细胞损伤(23]。此外,γgc可以抑制氧化损伤内皮细胞(24]。尽管有这些发现,所知更少的影响γgc在ROS-mediated缺血性中风后神经细胞凋亡。

在这项研究中,我们审查的神经保护作用γgc的HT22神经细胞系和初级皮层神经元接触oxygen-glucose剥夺/复氧(OGD / R)损伤和老鼠受到MCAO-induced缺血再灌注损伤。此外,我们进行转录组分析,探索潜在的分子和细胞通路潜在的保护作用γgc。这些结果提供了一个新颖的治疗脑缺血的治疗策略。

2。方法

2.1。试剂和抗体

γgc的纯度超过95% (CAS no。636-58-8)是购自上海原液生物技术有限公司(上海,中国)。抗体78 kDa glucose-regulated蛋白质(GRP78),蛋白激酶类似内质网激酶(活跃),inositol-requiring酶1α(IRE1α),TNF receptor-associated因子2 (TRAF2)真核起始因子2 (eIF2α),磷酸化eIF2α(p-eIF2α),C / EBP同源蛋白质(切),c-Jun NH 2-terminal激酶(物),和磷酸化物(p-JNK)从细胞信号技术(麻萨诸塞州,美国)。bcl - 2抗体伯灵顿,GAPDH买来Bioworld技术(圣路易斯,密苏里州,美国)。抗体caspase-3买来Proteintech集团(武汉,中国)。抗体对p-PERK获得Signalway抗体LLC(美国马里兰州),并针对p-IRE1抗体α是获得亲和力生物科学(江苏,中国)。细胞计数Kit-8 (CCK-8)和calcein-AM / propidium碘(π)从Dojindo购买分子技术(日本东京)。一个膜联蛋白V-PE / 7-AAD凋亡检测装备和TUNEL试剂盒获得Vazyme生物技术有限公司(南京,中国)。ROS,丙二醛(MDA)、谷胱甘肽测定包被从Beyotime获得生物技术(上海,中国)。

2.2。细胞培养和动物

HT22神经元细胞在DMEM补充维持10%的边后卫,青霉素,链霉素和37°C下5%孵化有限公司₂。细胞被亚文化的间隔2天。初级皮层神经元从E15-17分离C57 / BL6J小鼠胚胎如前所述[25]。孤立的皮质神经元被播种在neurobasal-A poly-D-lysine-coated盘子和培养媒体包含B27和谷氨酰胺。实验启动文化天7 - 8。

七到八周大的男性C57 / BL6J小鼠购自南京医科大学的动物模型中心(南京、江苏、中国)。所有的老鼠被安置在特定的无菌(SPF)条件和允许随意获取食物和水。对老鼠进行实验操作根据指南的动物保健和使用委员会的南京大学。

2.3。OGD / R的侮辱

OGD / R进行HT22细胞和初级皮层神经元与少量修改(如前所述25]。细胞被放置在/ glucose-free血清培养基,然后转移到一个厌氧室刷新的5%股份₂和95% N₂在37°C。然后,文化转向原始条件,这些细胞被返回一个有氧环境。曝光时间HT22细胞和初级皮层神经元OGD侮辱40分钟和12 h,分别。在不同的实验再氧化时间修改。

2.4。局灶性脑缺血和激光散斑对比度成像(LSCI)

老鼠被随机分配到五组:骗局,MCAO +溶剂,MCAO + 300毫克/公斤γgc, MCAO + 600毫克/公斤γgc, MCAO + 900毫克/公斤γgc。除了虚假的组的老鼠,老鼠受到MCAO建立瞬态局部脑缺血模型。总之,老鼠与戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。接下来,解剖后右颈总动脉,颈外动脉、颈内动脉,缝合(美国马Doccol公司)通过颈外动脉插入颈内动脉,直到在地区观察脑流急剧下降。1小时后,缝合被建立再灌注。开始的15分钟再灌注,老鼠intragastrically管理γgc或盐水。在手术期间,体温维持在 加热垫。Sham-operated老鼠受到所有程序除了插入的缝合。

为了确保MCAO模型的成功,LSCI用于可视化脑血流量。鼠标头骨被暴露在表面的激光(Perimed公司,斯德哥尔摩,瑞典),和地区的利益被选定评估散斑对比度。捕获图像进一步分析脑血流量的变化。

2.5。细胞生存能力分析

CCK-8分析是用来确定HT22细胞的生存能力和初级皮层神经元。细胞被镀在96 -孔板和受到OGD / R。年底再氧化,10μl CCK-8添加每口井和孵化37°C。最后,光密度(OD)测定在450 nm标(Tecan交易AG)、瑞士)。

2.6。流仪细胞凋亡检测

HT22细胞染色膜联蛋白V和7-AAD然后通过流式细胞术定量分析细胞凋亡。短暂,OGD / R的侮辱后,暂停和附着HT22细胞收获和洗冷磷酸盐(PBS)。接下来,工作解决方案包含膜联蛋白的细胞被resuspended V-PE 7-AAD和孵化在黑暗中在室温下15分钟。HT22细胞立即通过流式细胞术分析。超过 细胞被记录在每个样本,实验重复3次。

2.7。钙黄绿素和π双重标签

初级皮层神经元凋亡与荧光染料进行钙黄绿素和π。calcein-labeled神经元表现出绿色荧光是可行的,而PI-labeled神经元凋亡红色荧光。OGD / R的侮辱后,初级皮层神经元与calcein-AM孵化和π为15分钟37°C在黑暗中。洗后,分析了神经元通过使用荧光相机,捕获和图像识别生活/凋亡神经元(奥林巴斯BX51,日本)。

2.8。TUNEL分析

原位细胞凋亡被TUNEL分析评估根据制造商的指示。短暂,MCAO后24小时操作,老鼠受到transcardial与0.9%生理盐水和4%多聚甲醛灌注深麻醉下(PFA)序列。被固定,脱水后,冷冻的大脑被切成20μ为后续实验部分。固定和透化作用后,大脑切片与TUNEL分析混合物孵化2 h。细胞核与DAPI染色。用荧光显微镜TUNEL-labeled细胞可视化。

2.9。活性氧的检测

ROS的生成是通过使用细胞渗透的试剂2来衡量的 ,7 - - - - - -二乙酸dichlorofluorescin (DCFH-DA)。在受到OGD / R和MCAO,贴壁细胞和脑片,分别被洗,然后沾DCFH-DA在黑暗中。接下来,样本将细胞外DCFH-DA清洗三次。最后,细胞内DCFH被活性氧氧化成2 ,7 - - - - - -二氯荧光素(DCF),检测到的荧光光谱在激发/发射波长488 nm / 525 nm,表明活性氧的水平。

2.10。MDA的检测

MDA是脂质过氧化作用的生物标志物,这是氧化应激的重要组成部分。MDA的水平测量根据制造商的指示。短暂,收获脑组织均质在寒冷的PBS和离心机12000 g 10分钟收集上层的。MDA检测工作的解决方案是添加后,所有标准和样本在100°C的环境,持续15分钟。吸光度是立即测量波长532纳米。

2.11。总谷胱甘肽的测定

总谷胱甘肽的水平是决定使用一个商业工具根据制造商的指示。收集标本准备根据协议,然后孵化与准备工作的解决方案。吸光度测量在412 nm标。

2.12。RNA序列和差异表达基因(度)分析

从HT22细胞总RNA提取使用试剂盒试剂。质量评估是由使用NanoDrop 2000(美国热科学)和安捷伦2100生物分析仪(美国安捷伦,圣克拉拉,CA)。转录组测序和分析进行了OE生物技术有限公司(上海,中国)。度的层次聚类分析进行了识别基因在不同组织的表达模式。浓缩和KEGG通路富集分析,进一步分析度。

2.13。行为测试

MCAO老鼠的神经赤字被行为测试评估术后24 h,包括修改后的神经严重程度评分(mns),握力,rotarod测试。mns是用来评估运动、感觉、反射,平衡赤字。分数范围从0到18岁,和更高的分数表明更严重的赤字。握力与握力测量仪(GS3、Bioseb、法国)。老鼠被允许前脚掌掌握平台的强度计五次,并记录最大值。MCAO之前,3天的老鼠训练rotarods (RWD生命科学,深圳,中国)。MCAO后24小时,的老鼠放在rotarod线性加速从0到40转/分钟。时间上的老鼠挣扎rotarod记录,最长时间是300年代。

2.14。梗死体积评价

梗塞体积是衡量染色为2% 2、3,去除氯(TTC Sigma-Aldrich)。行为测试后,小鼠安乐死,大脑被切成2毫米部分。然后,大脑切片孵化与2% 20分钟温度记录在37°C。梗塞区仍然是清白的,而正常的地区被染成红色。随后的分析是由使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院ImageJ 1.5),和半球梗死体积的百分比计算如下:

2.15。免疫印迹分析

样本均质里帕缓冲区中含有一种蛋白酶抑制剂混合物中提取总蛋白。蛋白质是由sds - page分离,然后转移到PVDF膜。然后,阻断缓冲区的PVDF膜被封锁了60分钟在室温和表示主要抗体孵育过夜在4°C。随后,膜与HRP-conjugated孵化二级抗体。蛋白质带被使用ECL可视化检测设备,由Gel-Pro系统和图像捕获(Tanon技术,中国上海)。乐队强度量化使用ImageJ软件。

2.16。免疫沉淀反应

后OGD / R, HT22细胞细胞溶解在缓冲区里帕蛋白酶抑制剂的存在。离心后,上清液与抗体对IRE1孵化α一夜之间在4°C。随后,事先批准蛋白质A / G PLUS-agarose珠子(美国Billerica的微孔,MA)被添加到混合结合免疫复合物在4°C 3 h。最后,筛选了抗原进行sds - page。

2.17。免疫荧光染色

在虚假的大脑切片,MCAO +溶剂,MCAO +γgc组脱水在37°C为30分钟。接下来,部分是permeabilized 0.2% Triton x - 100和屏蔽2%牛血清白蛋白(BSA)。大脑切片与初级p-IRE1抗体孵化α,p-eIF2α一夜之间,NEUN在4°C。第二天,大脑部分与相应的二次抗体,孵化和细胞核与DAPI染色。图像捕获使用共焦荧光显微镜(日本奥林巴斯FV3000)。

2.18。统计分析

本研究中的数据是正态分布,提出了 (SEM)。对比组由单向方差分析之后,图基的多重比较测试,并通过双向方差分析脑血流量进行了分析。一个值小于0.05被认为是明显不同的。所有数据用SPSS 18.0软件进行了分析。

3所示。结果

3.1。γgc保护对抗OGD / R-Induced HT22神经元死亡

以确定是否γgc可以减轻缺血/再灌注引起的神经元损伤,我们第一次的影响进行了探讨γgc治疗HT22细胞暴露于OGD / R。细胞生存能力CCK-8试验检测到的百分比显著下降 由OGD / R,增加2毫米和4毫米γgc增加细胞生存能力 和 ,分别(图1(一))。这些结果也表明了,4毫米γgc没有表露出任何对HT22细胞细胞毒性的影响。此外,HT22细胞治疗γgc显示降低细胞凋亡率(图1 (b))。OGD / R的侮辱后,增加的百分比与膜联蛋白V和7-AAD HT22细胞被标记;2毫米和4毫米γgc逆转这一增长在某种程度上,4毫米γgc有卓越的效果。为了进一步确定凋亡的影响γgc HT22 OGD / R模型,伯灵顿、bcl - 2,和裂解caspase-3被免疫印迹分析测量。如数据所示1 (c)- - - - - -1 (e),OGD / R的比率增加伯灵顿/ bcl - 2和水平caspase-3分开。HT22细胞治疗γgc表现出显著减少的水平裂解caspase-3和伯灵顿的比例/ bcl - 2。基于这些结果,4毫米γgc被选为一个适当的浓度对后续实验。给定的角色γgc在谷胱甘肽合成的过程中,我们进一步测量总谷胱甘肽水平和细胞内ROS水平,发现OGD / R组相比,4毫米γgc组表现出总谷胱甘肽水平的提高和高细胞内活性氧清除能力(数据1 (f)- - - - - -1 (h))。总的来说,γgc显示神经保护效应在HT22 OGD / R模型中,等待进一步的研究和底层机制。

3.2。HT22细胞的转录组分析后OGD / R的挑战

识别潜在的机制γgc HT22保护细胞对抗OGD / R的侮辱,我们执行RNA-seq HT22细胞在对照组,OGD / R组和OGD / R +γgc组和17731个基因被确定。基于折叠(≥1.5)和变化值(≤0.05),三组之间的度进行了比较。与对照组相比,HT22 OGD / R组有1934个细胞调节和1387度使之抑制。HT22细胞OGD / R组相比,那些在OGD / R +γgc组有1131个调节和1697度使之抑制。聚焦度中表达下调OGD / R组相对于对照组但调节OGD / R +γgc组相对于OGD / R组,以及那些被调节OGD / R组相对于对照组,但在OGD / R +表达下调γgc组相对于OGD组,我们进一步分析了基因表达的变化。如图2(一个)bcl - 2,重要度、Mapk3 caspase-12与细胞凋亡和增殖有关。此外,Oxr1 Prdx5, Mgst1抗氧化系统的成员,和Eif2ak3 Hspa5 Atf6, Ern1扮演重要的角色在ER应激。特别是Hspa5编码GRP78,必不可少的监管机构展开的蛋白质反应(UPR)途径。此外,去分析和KEGG通路分析(数据2 (b)和2 (c))表明,γgc可能发挥作用在神经保护衰减细胞凋亡,改善氧化损伤和减轻压力,这是按照热图分析。

3.3。γgc抑制ER应激在HT22细胞凋亡

根据RNA-seq分析的机理γgc神经保护可能与减轻氧化和ER应激。它已经表明,过量的活性氧是ER应激的主要贡献者和加剧ER-induced细胞凋亡26]。然后,我们是否进行验证γ通过免疫印迹分析gc抑制ER应激细胞凋亡和免疫沉淀反应。OGD / R明显增加的GRP78 HT22细胞(数字3(一个)和3 (b)),这表明一阵ER应激。γgc缓解压力,所表示的GRP78的水平下降。此外,免疫印迹分析清楚地显示γgc减少下游两因素的激活,活跃和IRE1α,激活OGD / R侮辱(数字3(一个),3 (c),3 (d))。活跃的自身磷酸化激活eIF2α切,诱发高表达,促进细胞凋亡。基于免疫印迹结果(数据3(一个),3 (e),3 (g),3 (h)),OGD / R eIF2磷酸化水平的增加α并进一步导致增加切的水平。HT22细胞的接触γgc p-eIF2的水平下降α和排骨。的IRE1α-TRAF2-JNK轴是另一种诱导ER stress-mediated细胞凋亡。IRE1之间的交互α和TRAF2原因的激活物(27]。在这里,我们进行免疫沉淀反应决定的作用γgc的IRE1α-TRAF2交互。如图3 (f)IRE1 TRAF2的绑定α增强了OGD / R但打乱了γgc。一致的效果γgc的IRE1α-TRAF2相互作用,激活引起的物OGD / R受到的抑制γgc(图3 (g)和3 (h))。总的来说,γgc对其神经保护作用通过抑制ER应激通过PERK-eIF2细胞凋亡α切和IRE1α-TRAF2-JNK轴。

3.4。γgc保护主要皮质神经元对抗OGD / R-Induced死亡

证据显示,γgc减轻ER应激细胞凋亡来拯救HT22细胞OGD / R侮辱,这促使我们确定的影响γgc在初级皮层神经元OGD / R。CCK-8化验和钙黄绿素/π标签被用来检查的神经保护作用γgc以初级神经元。CCK-8试验表明γgc抑制神经元死亡引起OGD / R(图4(一))。γgc calcein-labeled细胞的比例增加而降低的百分比PI-labeled细胞(图4 (b)),这与CCK-8化验结果是相一致的。此外,γ-GC-treated主要通过免疫印迹分析神经元进行评估确定的比例伯灵顿/ bcl - 2和裂caspase-3(数据的水平4 (c)- - - - - -4 (e))。我们发现尽管OGD / R的比率增加伯灵顿/ bcl - 2和水平caspase-3裂解,γgc废除这一增长在某种程度上在初级神经元。此后,总谷胱甘肽的水平和细胞内活性氧测定(数字4 (f)和4 (g))。正如预测的那样,OGD / R打扰谷胱甘肽和ROS在初级神经元之间的平衡。γgc增加总谷胱甘肽和回收的细胞内ROS水平。一致地,γgc缓解过度ROS生成和保护的初级神经元OGD / R的侮辱。

3.5。γgc减轻OGD / R-Induced ER应激在初级皮层神经元

已经证实,γgc是价值的改善OGD / R-induced损害主要皮质神经元,我们进行免疫印迹分析来验证是否PERK-eIF2α切和IRE1α-TRAF2-JNK通路仍抑制γ-GC-treated主要神经元。符合HT22细胞,主要神经元表现出增加后GRP78 OGD / R的水平。然而,暴露的初级神经元γgc逆转这个海拔(数字5(一个)和5 (b)),表明抑制ER应激。同样,在受到OGD / R侮辱,主要神经元增加了磷酸化水平的活跃和IRE1α,其次是eIF2的激活α(数据5(一个)和5 (c)- - - - - -5 (e))。然而,γ-GC-treated主要神经元表现出相反的结果:活跃和IRE1的激活α减少,随后,eIF2磷酸化水平α是降低了。按顺序,OGD / R诱导高水平的无常物激活在初级神经元,指示ER应激细胞凋亡(数字5 (f)- - - - - -5 (h))。治疗后,γgc,主要神经元较低水平的磷酸化无常物。类似的效果γgc HT22细胞上,γgc的保护主要神经元对抗OGD / R通过抑制ER应激细胞凋亡。

3.6。γgc预防缺血性脑损伤在MCAO老鼠

调查的神经保护作用γ在缺血性中风体内gc,我们建立了大鼠MCAO模型。LSCI表明,脑血流量减少到大约 当老鼠受到MCAO和恢复 再灌注后(数据6(一)和6 (b))。因此,鼠标MCAO模型成功地模拟了缺血-再灌注过程。mns,前爪握力测量,rotarod测试进行了观察小鼠的神经结果MCAO后(数字6 (c)- - - - - -6 (e))。管理的600或900毫克/公斤γgc显著提高神经赤字,减少反射的mns,提高握力,rotarod延长时间。符合神经复苏,脑梗塞大小(数字6 (f)和6 (g))管理后明显萎缩γgc。这些结果证实,γgc可以部分改善神经功能缺损症状引起的缺血/再灌注损伤。虽然剂量300毫克/公斤是不够有效,600和900毫克/公斤γgc所做的工作。选用剂量600毫克/公斤以下实验。

3.7。γgc保护Ischemia-Induced神经元通过抑制活性氧的生产和ER应激

自γgc缓解神经赤字,进行了进一步的实验调查的保护作用γgc体内。缺血半影被隔离为后续分析(图7(一))。Apoptosis-related蛋白质被免疫印迹分析(数据检查7 (b)- - - - - -7 (d))。正如预期的那样,缺血/再灌注的比率升高伯灵顿/ bcl - 2和水平caspase-3分开。与体外结果一致,口服γgc的比例减少了伯灵顿/ bcl - 2和caspase-3的乳沟。此外,凋亡细胞被TUNEL检测,检查显示为TUNEL-positive细胞。如数据所示7 (e)和7 (f),许多TUNEL-positive细胞存在于大脑MCAO后切片。然而,管理γgc减少凋亡细胞的数量。因此,γgc帮助抵消脑组织的缺血/再灌注损伤通过抑制细胞凋亡。自γgc的ROS水平降低,证实了体外,我们继续验证的抗氧化效果γgc体内。正如所料,缺血/再灌注损伤消耗总谷胱甘肽,增加了MDA的水平,增加脑组织中ROS的平均荧光强度。的管理γgc显著增加总谷胱甘肽的水平,因此,MDA的含量和活性氧(数字有所下降7 (g)- - - - - -7 (j))。

的保护作用γgc体内与体外,是相一致的。然而,是否γgc保护脑组织的缺血/再灌注损伤通过抑制ER应激细胞凋亡被证实,由于内部环境是非常复杂的。免疫印迹结果显示,缺血/再灌注损伤GRP78的表达水平明显增加,p-PERK p-IRE1α,p-eIF2α在半影,表明活跃和IRE1的激活α轴(图8(一个)和8 (b))。的管理γgc部分废除这个高度。此外,MCAO老鼠处理γgc较低水平的无常p-JNK仅在半影比老鼠受到MCAO,表明γgc抑制细胞凋亡引起的ER应激(数字8 (c)和8 (d))。免疫荧光染色的神经元与anti-p-IRE1半影α和anti-p-eIF2α抗体确认的保护作用γgc对ER应激。如数据所示8 (e)和8 (f),p-IRE1的荧光α和p-eIF2α在MCAO NeuN-labeled细胞显著增强小鼠大脑组织,而治疗γgc抑制IRE1 overactivationα和eIF2α。总的来说,无论是在体外和体内,γgc对缺血/再灌注损伤的保护减轻活跃/切和IRE1介导的细胞凋亡α/物通路。

4所示。讨论

过多的活性氧形成触发神经元细胞凋亡和被认为是导致再灌注损伤的关键因素之一。拯救半影神经元,在正常的地区和缺血性核心,是一个潜在的战略来提高缺血性脑损伤。在目前的研究中,我们表明,外生的管理γgc HT22减少神经细胞凋亡后OGD / R挑战通过有效地增加谷胱甘肽和减少ROS水平。转录组分析结果表明,底层机制参与了ER应激细胞凋亡。这些发现在体内主要皮质神经元和验证。在鼠标MCAO模型,γgc治疗减少梗塞体积,改善神经系统和运动功能。此外,γgc政府减轻氧化应激,建议增加谷胱甘肽和减少ROS和MDA水平。γgc的半影神经元细胞凋亡抑制活跃的激活和IRE1αER应激信号通路在缺血性脑组织。总的来说,我们的研究结果提供了重要证据γgc起神经保护作用对缺血性损伤体内和体外,这些效应是由衰减氧化应激和随后的ER应激的神经细胞凋亡。机械模型的保护作用γgc如图9。

谷胱甘肽是最丰富的硫醇存在于几乎所有的细胞和组织,它作为一个重要的抗氧化剂,可以保护细胞免受氧化损伤。低血浆谷胱甘肽水平通常出现在中风患者(28]。张等人专门设计并合成了两个独特的荧光探针观察活细胞中的谷胱甘肽水平和体内缺血和再灌注期间。研究人员发现,较低的谷胱甘肽水平与脑梗死和细胞凋亡的恶化MCAO老鼠,并与谷胱甘肽合成酶抑制剂预处理恶化缺血性脑损伤(29日]。谷胱甘肽是一种三肽由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。之前的研究已经表明,缺氧诱发细胞谷胱甘肽减少商店和伴随的抑制谷胱甘肽的生物合成,与运输受损的衬底胱氨酸(30.]。首次证实了在1983年γgc,中间二肽谷胱甘肽合成通路中的巯基,肾脏可能增加谷胱甘肽的水平(20.]。进一步的研究表明γgc及其酯化形式GCEE可以防止氧化损伤在不同的细胞类型通过GSS产生催化细胞内谷胱甘肽(23,24,31日]。最近的研究表明,与南汽和补充谷胱甘肽相比,γgc政府更有效地防止脂多糖(LPS)或盲肠的结扎和穿刺(CLP)诱导系统性炎症反应(32]。这些研究表明,增加谷胱甘肽水平是有益的许多疾病,如缺血性中风和增加细胞内谷胱甘肽的最佳方式是管理γgc。在这项研究中,我们首次展示γgc治疗减少神经元凋亡脑缺血模型的体外和体内。外生γgc的谷胱甘肽水平升高培养神经元缺血性脑组织,伴随着减少氧化损伤。

为了进一步解决如何γgc减少神经元凋亡抑制ROS之后,我们检查后细胞的转录组不同的治疗方法。转录组分析发现ER应激信号通路被显著改变OGD / R HT22细胞治疗γgc。证据表明,过量的活性氧处于病理状态可以触发ER应激体内和体外33]。治疗抗氧化剂保护老老鼠肾脏氧化应激损伤和规范化ER应激反应(34]。此外,一个活性氧清除剂降低半胱天冬酶cascade-mediated人类T细胞凋亡和减毒组织损伤肝缺血再灌注损伤通过阻断ER应激(35,36]。ER压力引发的ER展开或错误折叠蛋白质的积累。最初,UPR激活诱导的自适应程序尽可能维持体内平衡。GRP78、活跃和IRE1αUPR的重要部分。如果压力是长期,UPR将诱导细胞凋亡37]。在缺血性中风,在神经元死亡ER应激中起着作用。展开或错误折叠蛋白质的积累引发过度的和持续的ER应激。然后,活跃和IRE1α是分开GRP78和autophosphorylated激活下游通路,最终诱导细胞凋亡(38]。活跃将使磷酸化eIF2的激活α并最终导致切的表达。切ER应激细胞凋亡的一个指标,验证,切可移植比伯灵顿/ bcl - 2和乳沟caspase-3 [39,40]。李等人发现PERK-eIF2的激活α砍了缺血性中风,而毛和增强剂拆分1 (Hes1)产生了保护作用停止PERK-CHOP通路诱导细胞凋亡(41]。的IRE1α通路是细胞凋亡的另一个中介。IRE1之间的交互α和TRAF2激活物通路,最终诱发细胞凋亡。因此,磷酸二酯酶4 (PDE4)抑制剂可以抑制细胞凋亡在缺血性中风打断IRE1的绑定α和TRAF242]。这些研究是符合我们的工作。我们研究了各种体外和体内缺血/再灌注模型和确认γgc减少缺血性中风损伤通过PERK-eIF2通过抑制细胞凋亡α切和IRE1α-TRAF2-JNK轴。

在体内实验中,γ我们使用gc浓度是考虑基于以前的研究。随机人体试验证实口服2 g或4 gγgc可以有效提高淋巴细胞谷胱甘肽水平(21]。剂量转换从人类小鼠乘以1243]。因此,我们计划评估γgc的浓度300毫克/公斤和600毫克/公斤。据报道,1200毫克/公斤γgc减少败血症杀伤力和减毒老鼠系统性炎症反应没有毒性或副作用32]。因此,我们也设计了一个高γgc组接受900毫克/公斤。我们的数据表明,600毫克/公斤和900毫克/公斤γgc显著提高神经赤字。总的来说,一个γgc的浓度选择600毫克/公斤以下实验。

在我们的工作中,我们证实了这一点γgc政府增加谷胱甘肽的水平,这可能会减轻氧化应激。Quintana-Cabrera等人发现γgc回收ROS不管谷胱甘肽浓度(44对我们的工作),这是一个补充。也就是说,γgc可以减轻氧化损伤本身和通过增加谷胱甘肽的水平。然而,在缺血/再灌注损伤,是否γgc可以独立发挥其抗氧化作用的谷胱甘肽没有被调查。因此,这方面有待进一步研究在我们的后续工作。

除了ER应激,RNA-seq也建议的机制γgc减轻缺血性中风与ferroptosis和肿瘤坏死因子信号通路有关。Ferroptosis是程序性细胞死亡的一种形式,明显不同于凋亡和氧化脂质物种高度相关。此外,ferroptosis是中风的治疗目标抑制神经元死亡(45]。此外,炎症是缺血性损伤的主要因素。γgc发挥抗炎作用的广告和脓毒症23,32]。因此,在未来的研究中,我们可以进一步探讨γgc有能力对抗炎症和抑制ferroptosis。

5。结论

总之,γgc对其神经保护作用在体外和体内。作为一个谷胱甘肽的前体,γgc显著增加谷胱甘肽和回收的细胞内ROS水平。此外,转录组分析建议γgc宽慰ER应激在缺血性中风,我们确认γPERK-eIF2 gc抑制神经元凋亡介导的α切和IRE1α-TRAF2-JNK轴。因此,应用程序的γgc治疗脑缺血的一个有前途的未来。

数据可用性

所有的数据是可用的。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

夏Hui-qin李和剩男同样有助于这项工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(82171310号,82130036,81920108017,81630028),江苏的关键研究和发展项目中国没有。BE2020620)和青年人才支持计划从江苏科学技术协会和江苏省重点学科(没有。ZDXKA2016020)。我们感谢宣周从生物信息学OE生物技术援助。