文摘

背景。破坏血脑屏障(BBB)的关键因素导致脑出血后神经功能缺损(我)受伤。脂联素受体1 (AdipoR1)有着重要的影响导致BBB的完整性。脂联素的同系物,重组C1q / TNF-related蛋白9 (rCTRP9)在脑血管疾病神经保护作用。本研究的目的是调查的保护作用与rCTRP9 AdipoR1激活BBB我受伤后的完整性和潜在的机制。方法。177年本研究雄性老鼠受到。我被注入胶原酶诱导合适的基底神经节。在1小时之后我rCTRP9治疗鼻内。我之前选择性核管理。免疫印迹、免疫荧光染色技术、神经行为测试,BBB通透性进行评估。结果。我增加内源性AdipoR1和CTRP9的表达。管理rCTRP9改善神经赤字和减少了BBB通透性在我24小时老鼠。此外,rCTRP9提升AdipoR1的表达,APPL1, p-AMPK, Nrf2,紧联接的蛋白质。AdipoR1特定核的干预,APPL1和p-AMPK逆转rCTRP9的保护作用。结论。激活的AdipoR1 rCTRP9改善神经功能和保护BBB完整性通过APPL1 / AMPK / Nrf2信号通路在我的老鼠。因此,CTRP9可以作为一种很有前途的治疗方法以缓解BBB受伤后我的病人。

1。介绍

脑出血(我)是最致命的子类型的中风死亡率和发病率高(1),往往导致神经损伤的幸存者。脑水肿造成的破坏血脑屏障(BBB)是最致命的事件在我的早期急性期。此外,BBB的破坏被认为是一个可怜的我的患者的预后因素。因此,减少BBB的损害的治疗策略将有助于减弱早期脑损伤和改善我的神经损伤患者。

脂联素是由脂肪细胞分泌的一种激素以及通过其受体激活有益的生理功能,如调节新陈代谢,antiatherosclerosis,抗炎(2- - - - - -5]。脂联素还参与调节冠心病的发展在人类6]。大量的证据表明,在大脑中脂联素受体广泛了。脂联素受体1 (AdipoR1)是主要的脂联素受体亚型。已经证实,脂联素调节细胞凋亡和紧密连接蛋白的表达内皮细胞在大脑中通过激活AdipoR1 [7]。报道,脂联素对脑的保护作用介导的内皮一氧化氮合成酶(以挪士)信号通路8]。他们发现adiponectin-KO老鼠显示更大的脑梗塞大小和更严重的脑缺血再灌注后神经损伤。C1q / TNF-related蛋白(最大)家庭是一种新形式的脂联素类似物。在所有的最大的家庭成员,CTRP1-15有脂联素类似的结构和生化特征9- - - - - -11]。球形c端C1q球状域CTRP9股票与脂联素同源性最高。CTRP9表达的增加可以减少心肌梗死缺血/再灌注损伤和氧化应激引起的大小和增加食源性肥胖老鼠的心输出量12]。然而,CTRP9能否保护我受伤后早期脑损伤的BBB完整性尚未报道。

适配器蛋白质包含pleckstrin同源域,phosphotyrosine-binding域和亮氨酸拉链主题1 (APPL1)是第一个适配器直接与脂联素受体相互作用蛋白。中扮演着重要的角色在信号激活诱导的脂联素,如p38增殖蛋白激酶(MAPK)、腺苷单磷酸盐激活蛋白激酶(AMPK)和过氧物酶体proliferator-activated受体α(PPARα)的途径。其中,AMPK脂联素的主要下游信号。证据表明,AMPK信号由脂联素可能参与有益的代谢和内皮细胞保护的规定(13]。磷酸化的AMPK促进核转录因子的激活红细胞两个相关因子2 (Nrf2),一个主要的抗氧化剂调节器(14]。据报道,激活AMPK / Nrf2途径可以降低神经炎症和氧化应激损伤,从而改善MCAO大鼠的神经功能(15]。

因此,本研究的目的是探讨是否激活AdipoR1 rCTRP9可以改善神经结果通过APPL1和保护BBB的完整性/ AMPK Nrf2途径我的老鼠。

2。材料和方法

所有的实验过程符合相应协议机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)在天津泰达医院按照美国国立卫生研究院的指导的护理和使用实验室Animals.177 CD1成年雄性老鼠(八周大,体重35 - 40 g)饲料在湿度和温度控制的房间与普通光/暗周期,和足够的水和食物供应。

2.1。我的模型

我模型建立了注入胶原酶对小鼠纹状体,如前所报道(16]。简而言之,小鼠麻醉和放置在卧姿立体定位框架。1毫米的洞鼠颅骨钻,和细菌胶原酶溶解在0.5毫升无菌磷酸盐(PBS)。针被插入到合适的基底神经节(0.2毫米后,2.2毫米前囱侧硬膜下和3.5毫米)。胶原酶注射的速度0.167毫升/分钟注射泵。针注射后,一直为另一个5分钟,以防止泄漏的胶原酶,慢慢地提取1毫米/分钟的速度。骨孔是由骨蜡,头皮被缝合。虚假的组动物进行相同的协议,除了他们注射PBS。

2.2。实验设计

动物被随机分配给每个小组在以下四个实验中所示的补充文件1。动物的数量和死亡率实验组和本研究的补充文件中列出2。

实验1:内生AdipoR1的时间进程和CTRP9表情后我用免疫印迹(WB)测量。小鼠随机分为6组( );侧半球收集在虚假的,3 h, 6小时,12小时,24小时,72 h后我。双重免疫荧光染色AdipoR1与星形胶质细胞和血管内皮细胞进行24 h后我。

实验2:我在24 h后,与rCTRP9 AdipoR1激活神经行为的影响和脑含水量(公约)访问。30小鼠随机分为5组( ):骗局,我+车辆,我+ rCTRP9,我小干扰rna (i.c.v) + rCTRP9 + AdipoR1,和我+ rCTRP9 + AdipoR1 scr-siRNA (i.c.v)。

实验3:伊文思蓝(EB)外渗和EB荧光被用来评估AdipoR1激活在BBB通透性的影响我后24小时。45老鼠同样分为5组( ):骗局,我+车辆,我+ rCTRP9,我小干扰rna (i.c.v) + rCTRP9 + AdipoR1,和我+ rCTRP9 + AdipoR1 scr-siRNA (i.c.v)。

实验4:调查与rCTRP9 AdipoR1激活的潜在保护机制,神经行为测试和白平衡是我在24小时后测定。54小鼠随机分成9组:骗局,我+车辆,我+ rCTRP9,我小干扰rna (i.c.v) + rCTRP9 + AdipoR1,我+ rCTRP9 + AdipoR1scr-siRNA (i.c.v),我小干扰rna (i.c.v) + rCTRP9 + APPL1,我+ rCTRP9 + APPL1scr-siRNA (i.c.v),我+ rCTRP9 + dorsomorphin (i.c.v),和我+ rCTRP9 +二甲亚砜(DMSO) (i.c.v)。AdipoR1核或APPL1 siRNA注入侧脑室在48小时前我归纳,分别。Dorsomorphin或DMSO溶液治疗ICV注射在我手术前30分钟。

2.3。鼻内rCTRP9管理局

如前所述,鼻内政府执行在我受伤后1小时17]。简而言之,rCTRP9稀释剂量的0.1μ与PBS g / g。rCTRP9被交付到双边鼻孔交替麻醉小鼠,2μl每2分钟,总额的20倍μl

2.4。双重免疫荧光染色

根据之前的报道,大脑半球双重免疫荧光染色的样品准备。短暂,24小时我后,小鼠灌注intracardially 100毫升冷深麻醉下PBS。大脑半球被移除后,样本与10%福尔马林固定24小时,然后用30%蔗糖固定为72小时。冷冻的大脑标本切成8μ米厚的冠状切片低温恒温器。5%的部分被封锁驴血清1 h和孵化在4°C一夜之间主要抗体:anti-GFAP(1: 500年,ab53554)和anti-VWF (1: 390774, Santa Cruz)。然后洗了PBS的部分,其次是孵化与相应的二次抗体在室温下2小时。部分可视化,用荧光显微镜拍照。

2.5。Intracerebroventricular注入

AdipoR1、APPL1和AMPK体内击倒,选择性可以阻止或负控制争夺核是由ICV注入在48小时我根据制造商的指示18]。AdipoR1核、APPL1 siRNA或负控制scr-siRNA (100 pmol /鼠标)是溶解在转染试剂。药物注入左心室通过头骨孔和微喷射泵的速度0.667μl / min。注射位置的坐标如下:后0.22毫米,侧1.0毫米,深度2.25毫米。针保持额外的5分钟和移除慢慢超过5分钟。最后,颅孔和切口缝合。

2.6。短期的神经行为功能评估

短期的神经行为功能是由一个独立的调查员盲实验评估小组。加西亚在我感应后24小时,修改后的分数,前肢位置,和角落进行了测试,之前报道(19,20.]。

2.7。脑含水量(公约)的评估

公约与干/湿访问在24小时后我称重法,如前所述[21]。深麻醉下,整个大脑样本快速隔离和删除。然后,大脑样本分为5个部分:身体的同侧的皮层,侧皮层,侧基底神经节,侧基底神经节和小脑。每个样本的一部分大脑迅速承压电动分析微量天平获取湿重(WW),然后在烤箱干100°C 48 h得到干重(DW)。实现公约的最终结果,使用下面的公式: 。

2.8。BBB通透性评价

BBB通透性是评估通过EB染色外渗和EB荧光在我手术后24小时,如前所报道(22]。4% EB染料溶液腹腔注射,使染料为至少3 h体内循环。100毫升的冰冷的PBS灌注intracardially深麻醉小鼠;大脑组织被移除,然后分为左右两个半球。PBS是添加到组织(1毫升PBS为每个300毫克的组织),由微波超声波均质,分别离心机。离心后,500μl上层清液与同等体积的三氯乙酸混合文化在一夜之间在4°C。EB染料吸光度与分光光度法检测和分析波长610纳米。EB荧光的染料被允许循环至少3个小时。深麻醉下,老鼠接受心脏内的灌注冷PBS和随后与多聚甲醛。冰冻的日冕部分(厚度8μ米)收集使用低温恒温器。红色的自体荧光可视化,用荧光显微镜拍照。5 EB荧光强度的随机位置每侧皮质部分中进行了分析。

2.9。免疫印迹

免疫印迹分析进行24 h后我如前所述[23]。样品制备后,等量的蛋白质样本添加到每个通道的sds - page凝胶。样本的蛋白质电泳转移到硝酸纤维素和阻塞2小时。细胞膜在4°C主要抗体孵育过夜如下:AdipoR1 (1: 500), CTRP9 (1: 1000), p-AMPK APPL1 (1: 2000)α(1:500),Nrf2 (1: 2000), occludin (1: 50000), claudin 5 (1: 400),β肌动蛋白(1:2500)。清洗后膜与PBS 3次,使用适当的二次抗体和孵化膜在室温下2小时。发射极耦合逻辑的探讨了膜+工具包和可视化图像系统在一个黑暗的房间。每个乐队的密度被ImageJ量化软件。

2.10。统计分析

GraphPad棱镜6用于统计分析。所有数据了 。组间的差异,单向方差分析(方差分析)与事后图基的测试使用。统计学意义的定义 。

3所示。结果

3.1。小鼠死亡率

有177只老鼠用在这项研究中,149只老鼠我手术和28个老鼠虚假的组。9老鼠死后我操作,所以我老鼠的总死亡率为6.04% (9/149)。一个鼠标是排除因为mio-hemorrhage(补充文件2)。

3.2。表达的内源性AdipoR1和CTRP9升高我后与时间相关的方式

内生的表达AdipoR1和CTRP9正确的/侧半球与世行评估。这两个蛋白的表达水平增加我和达到顶峰后24 h,但减少了72 h后我(数据1(一)和1 (b))。双重免疫荧光染色证明AdipoR1可以表示在星形胶质细胞(GFAP)和血管内皮细胞(VWF我受伤后(图)1 (c))。

3.3。激活AdipoR1改善神经行为缺陷和减少公约在我之后

我损伤明显加重神经行为表现加西亚修改分数,前肢位置和角落将测试在24小时车辆组相比,虚假的组。rCTRP9治疗改善神经功能和减少脑水肿在侧基底神经节和皮层(数字2(一个)- - - - - -2 (d))。

3.4。激活AdipoR1保护BBB完整性在我后24小时

如图3,在同侧大脑半球的老鼠在我组,EB染料渗出物中可以看到右半球在我组小鼠在24 h后我感应。激活的AdipoR1 rCTRP9显著降低染料因我受伤的积累。然而,小干扰rna干预AdipoR1逆转(图的结果3(一个))。EB荧光强度的测定结果符合EB溢出的结果在同侧皮层(图3 (b))。

3.5。击倒的AdipoR1对表达的影响AdipoR1 / APPL1 / AMPK / Nrf2我后信号通路

如图4与scr-siRNA组相比,AdipoR1和下游信号分子的表达显著地抑制了AdipoR1-siRNA干预我在24小时后。相反,AdipoR1-siRNA预处理降低了下游分子Nrf2和内皮细胞连接蛋白的表达(occludin和claudin 5) AdipoR1-siRNA组相比,发现scr-siRNA组。

3.6。淘汰赛的APPL1和p-AMPK消除AdipoR1激活Post-ICH的BBB的保护作用

证实了的可拆卸的疗效APPL1和p-AMPK WB(图5)。APPL1 siRNA取消AdipoR1保护作用的神经赤字和抑制APPL1的表达,p-AMPK, Nrf2, zonula occludens蛋白质明显我在24小时后。同样,dorsomorphin干预完全消失的保护影响neurobehavior AdipoR1激活和减少下游信号的表达式在24小时后我。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们表明,激活的AdipoR1 rCTRP9可以保护BBB的完整性后我在老鼠身上这部分是由APPL1 / AMPK / Nrf2信号通路。我们的研究结果表明,内生AdipoR1和CTRP9的表达增加,达到峰值后在24小时内我受伤。管理rCTRP9缓解BBB通透性和改进我的神经赤字老鼠的言论upregulation APPL1, AMPK磷酸化,内皮连接蛋白质。相反,小干扰rna沉默的特定AdipoR1加重神经损伤,脑肿胀,BBB破坏。此外,淘汰赛的APPL1 APPL1核与dorsomorphin消除和抑制p-AMPK活动AdipoR1激活的神经保护效应在BBB完整性损伤和脑水肿,伴有Nrf2活动的减少和内皮细胞连接蛋白的降解在24小时后我。总的来说,这些发现表明,激活的AdipoR1 rCTRP9保护BBB完整性部分通过APPL1 / AMPK / Nrf2机制后我在老鼠身上。信号途径的原理图显示在图中6。

脂联素是一个collagen-like专门由脂肪组织分泌的细胞因子,由一个信号序列在氨基端,nonhomologous序列,胶原域和球形领域carboxy1一端和股票相同的亚基C1q补充因素。脂联素是已知的参与与肥胖相关的疾病,如代谢综合征和动脉粥样硬化。此外,循环脂联素浓度的差异在身体有关病理学观察,如癌症和风湿性关节炎。它已经证实脂联素通过增加胰岛素敏感性有很大好处,保持血糖浓度和脂质分布,减少动脉粥样硬化和炎症(24]。最近的研究表明,脂联素可以降低脑出血后的脑损伤减少NLRP3 inflammasome表达式(25]。证据表明,脂联素促进神经生存在糖尿病设置(我受伤后26]。

脂联素效应是由脂联素受体(27]。脂联素受体的表达水平直接决定了脂联素的作用强度。然而,由于不同的具体影响脂联素低聚物在多个受体不同亚型亲和力和组织网站的脂联素,它变得复杂,脂联素及其受体作为治疗目标。虽然发现脂联素受体在下丘脑,脑干、大脑皮层神经元,垂体,内皮细胞,和整个大脑的老鼠,其大脑中明确的效果还不清楚。脂联素的主要受体AdipoR1和AdipoR2已确定。最近的研究表明,AdipoR1和AdipoR2都表达了在小鼠皮层神经元,但比AdipoR2 AdipoR1更丰富。此外,AdipoR1高亲和力与脂联素球状域,而AdipoR2只有温和的亲和力。所以我们相信与AdipoR2相比,AdipoR1有更多重要的神经保护作用。

最大的家庭是一个新的和高度保守的paralogue脂联素。每一个最大成员由四个独立的领域包括氨基端信号肽,collagen-like域中,短可变域,c端C1q-like球状域(28]。CTRP1-15家族的所有成员,CTRP9股票最大的氨基酸重叠(54%)与脂联素在其球形C1q领域,及其生化特征最相似的脂联素,所以越来越受到关注CTRP9 [9]。动物研究发现,等离子体水平的CTRP9在肥胖和糖尿病小鼠模型显著下降(29日]。与外生CTRP9然而,治疗后,血糖水平和胰岛素抵抗是减少,和胰岛素水平增加。相反,在CTRP9基因敲除小鼠模型中,血清胰岛素水平升高,胰岛素抵抗增加,这提供了实验证据,CTRP9可以增加胰岛素敏感性。这是推测CTRP9可能是减肥的一个重要目标和血糖调节。此外,CTRP9治疗可以减少心肌缺血性大小和心肌细胞凋亡与急性心肌梗死缺血再灌注后通过AdipoR1 / AMPK信号通路在老鼠30.]。利用免疫沉淀反应技术,发现CTRP9增加的生产没有通过AdipoR1 / AMPK / Akt /以挪士途径而不是AdipoR2发挥血管扩张的作用。它已经表明,CTRP9可以减少冠状动脉粥样硬化性斑块的炎症反应在载脂蛋白E基因敲除小鼠,增加斑块的稳定性。竹内等人报道,CTRP9可以增加AdipoR1的表达,这可能增加颈动脉斑块的稳定性灭活巨噬细胞(31日]。

我们的实验结果表现出的表达内源性AdipoR1 CTRP9达到峰值在我受伤后24小时,然后减少72小时。合理的解释这个结果可能造成的急性应激反应我受伤。AdipoR1是球状脂联素的高亲和性受体。AdipoR1表达增加可能是必要的来执行其功能的增加表达式给出的球状域CTRP9我之后。CTRP9表达式的增加引起我受伤导致球状域的增加,尽管AdipoR1高亲和力与球状域。此外,我们的结果表明,对应于CTRP9 AdipoR1的变化趋势是在我的早期阶段,表明主要通过激活AdipoR1 CTRP9可能扮演一个角色。双重免疫荧光染色法显示,脂联素在星形胶质细胞和血管内皮细胞表达。这可能是一个可能的解释的激活AdipoR1可显著降低脑含水量和我后维护BBB的完整性,从而提高神经障碍。此外,我们的研究进一步证实了淘汰赛AdipoR1显著加剧BBB破坏和神经赤字在我之后。这些结果表明,AdipoR1扮演至关重要的角色我的急性期。

尽管据BBB脂联素的保护作用在我的模型中,它的底层机制不清楚5,7,32]。在这项研究中,我们证实了下游信号通路介导的激活AdipoR1 [33]。APPL1是必要结蛋白适配器交互的传播脂联素受体下游信号分子,它直接与细胞内的脂联素受体的氨基末端转移信号从脂联素受体下游目标(34,35]。我们的发现在这个研究表明APPL1 CTRP9治疗后显著增加的表达。AMPK是主要由APPL1激活下游信号分子。直接下游中介,AMPK后的信号通路中发挥着关键作用的组合CTRP9 AdipoR1。AMPK活化诱发信号级联,促进脂质氧化,增加防御和自噬细胞压力,减少炎症,调节能量代谢的动态平衡。最近,一项研究调查,bakkenolide B可以抑制的增加lipopolysaccharide-induced促炎细胞因子通过激活AMPK在小胶质细胞(36]。在目前的研究中,我们发现我受伤轻微APPL1和p-AMPK的表达增加,尽管CTRP9政府进一步的表达增加,由世行如图所示。这些发现与之前的研究相一致,CTRP9改善缺血再灌注后心肌损伤通过激活AMPK磷酸化(37]。此外,击倒APPL1与选定siRNA导致显著减少p-AMPK表达和紧随其后的是减少Nrf2表达式。它证实了APPL1是一个潜在的适配器蛋白质AdipoR1和AMPK之间。

AMPK磷酸化能激活主抗氧化剂的监管机构Nrf2。Nrf2内源性抗氧化防御的主要监管机构,AMPK的磷酸化可以增加其活动(14]。Nrf2能促进氧化应激条件下各种抗氧化基因。新出现的证据表明,增加Nrf2活动可以减少stroke-induced脑损伤通过抑制氧化应激。它已经表明,Nrf2活性的抑制增加了脑梗塞大小和改善缺血性中风后神经赤字的程度(38,39]。的激活Nrf2变弱氧化应激和我受伤后神经细胞凋亡40]。我们的研究结果表明,rCTRP9 Nrf2的表达明显增加,其次是海拔occludin和claudin 5。同样的,当推倒APPL1或p-AMPK rCTRP9的保护作用是消除,干预加重神经行为障碍和降低Nrf2的激活。综上所述,我们得出的结论是,rCTRP9施加保护BBB效应通过APPL1 / AMPK / Nrf2信号通路。

本研究存在的一些局限性。首先,我们只估计我手术后24小时的观察时间点rCTRP9治疗效果。其次,BBB的破坏之后我是许多病理因素的结果;CTRP9扮演着各种各样的保护作用在脑损伤后我通过不同的机制,如抗炎、血管内皮保护,antiapoptosis, antiatherosclerosis,抗氧化压力41]。然而,在这项研究中,我们只专注于BBB完整性的保护作用。我们以前报道,CTRP9可以减少神经炎症,我们无法排除其他途径的可能性。还需要进一步的研究来探索其他可能的信号通路激活AdipoR1造成的。第三,长期的神经的好处CTRP9需要进一步研究。

总之,我们的研究结果显示激活的AdipoR1 rCTRP9 upregulation的BBB完整性维护大脑内皮连接蛋白质。因此,神经赤字减毒后我在老鼠身上。CTRP9的神经保护作用,保护BBB的完整性通过激活介导AdipoR1 / APPL1 / AMPK / Nrf2途径。本研究支持CTRP9作为一个有前途的战略BBB保护患者的我。

数据可用性

所有的数据是可用的。

伦理批准

本研究的所有实验协议和程序批准的动物保健和使用委员会天津泰达医院(中国)据中国动物保护协会的指导方针。手稿坚持到达(体内实验动物研究:报告)动物实验报告指南。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

WZ、FPK XG构思和设计研究。WZ LHZ进行实验,分析数据,并起草了手稿。WZ ZYG, SW手稿的修改工作。所有作者阅读和批准最终的手稿。魏赵,Fanping香港和秀锣co-first作者论文的。

补充材料

补充文件1:实验设计。评估的影响与rCTRP9 AdipoR1 BBB的激活我的老鼠,这个实验设计包括四个部分。老鼠被我鼻内接种了rCTRP9我后1小时。免疫印迹、免疫荧光染色技术、神经行为测试,BBB通透性进行评估。补充文件2:动物的数量和死亡率和实验组织列出了本研究。(补充材料)