HIF-1α激活促进Luteolysis提高ROS水平Pseudopregnant黄体的老鼠

文摘

氧化应激的增加是哺乳动物黄体回归的重要特征之一。以前的调查揭示了重要作用的活性氧(ROS)在luteolysis黄体细胞死亡,虽然是未知的ROS是如何在这一过程中监管。考虑到减少血流量,增加的PGF_2αHIF-1 luteolysis期间,我们假设α途径可能参与调节的黄体细胞ROS黄体后期(CL)。在这里,通过使用一个pseudopregnant鼠模型,我们表明HIF-1的水平α及其下游BNIP3期间增加黄体回归。始终如一,我们观察到自噬水平的增加luteolysis期间,Beclin1-independent调控。假孕的比较早期(7天)和中间CL(14天),ROS水平在CL后期显著增加,表明在luteolysis氧化应激的贡献。抑制HIF-1α强有力的HIF-1 echinomycin(决定)α抑制剂,BNIP3的upregulation NIX改善,以及自噬的诱导和黄体细胞中活性氧的积累在21天的假孕。形态,决定治疗延迟黄体萎缩的结构在late-luteal阶段。体外研究表明,抑制HIF-1α也可以减弱PGF_2α全身的ROS和黄体细胞的凋亡。此外,还可以观察到细胞凋亡的减少ROS PGF下抑制_2α治疗。综上所述,我们的研究结果表明HIF-1α信号参与CL的回归通过编排自噬调节活性氧的生产。抑制HIF-1α可以明显阻碍黄体细胞的凋亡和黄体回归的过程。

1。介绍

黄体(CL)是一个短暂的腺在哺乳动物卵巢从排卵的卵泡,负责维护月经周期和怀孕期间激素体内平衡(1]。通常,CL的寿命主要是依赖于怀孕的存在;这一时期称为黄体期。怀孕的缺失是一个重要的指标,黄体开始回归,最终从卵巢切除CL结构年底怀孕于是允许下一个月经周期的起始2]。回归的CL牵连到细胞外基质的降解、血管,黄体细胞死亡。CL回归破坏卵巢周期的衰减,可能创建一个无序环境损害之后卵泡发育。

先前的调查表明,活性氧的增加是一个重要的前体的鼠黄体回归(1]。此外,一个体外研究表明,活性氧的水平也可以引起PGF_2αluteolytic代理(3,4]。在人类中,H₂O₂治疗是能够产生luteolytic影响granulosa-luteal细胞(5]。这些发现强调了ROS在黄体回归的重要作用。然而,问题的ROS生成仍然知之甚少。生理、血管网络的退化是发起之前,可比在luteolysis (CL结构的变化6]。此外,证据也表明PGF先例_2α作为一个HIF-1α激活脂肪细胞(7],这种效应也观察到在黄体细胞(8]。因此,它是合理的假设HIF-1α可能是ROS生成的一个重要诱因。事实上,prodeath HIF-1的角色α黄体细胞在体外模型评价(9]。HIF-1水平α下游蛋白质BNIP3,参与哺乳动物细胞的自噬调控的一个重要因素,也是明显增加黄体细胞在缺氧条件下(9]。这些发现表明,自噬的调节异常可能参与黄体细胞中活性氧的生产。,大量的证据揭示了自噬在黄体回归参与多样的物种,包括大鼠(10)和人(11),尽管自噬调控的细节仍然是难以捉摸的。

自噬是一种进化保守的降解机理在真核细胞中,细胞可以优雅的控制下的代谢体内平衡压力,抑制细胞的发生障碍。然而,自噬也可以促进细胞的凋亡self-digestions过剩,删除重要的细胞器,自噬体积累(12]。异常诱导自噬是高度参与不同细胞疾病,包括癌症(13)、糖尿病(14),和神经退化15]。哺乳动物卵巢中,自噬在原始的形成中扮演至关重要的角色池(16],oocyte-to-embryo的过渡,毛囊的发展(17)和黄体的回归10]。然而,证据仍对自噬是如何参与黄体边际回归。

在目前的研究中,我们评估HIF-1的表达变化α信号及其对氧化应激的影响在黄体回归使用pseudopregnant鼠模型。我们与echinomycin治疗大鼠,一个强有力的HIF-1α抑制剂,研究的进展黄体回归通过观察黄体形态和凋亡蛋白的表达在黄体回归,旨在阐明HIF-1的角色α在自噬和凋亡信号pseudopregnant老鼠的黄体回归。

2。材料和方法

2.1。动物

女性Sprague-Dawley老鼠(21 ~ 23天左右)从乌石购买实验动物供应有限公司(福州,中国)。动物们保持在14 h: 10 h明暗时间表的连续供应食物和水。这些老鼠被i.p超数排卵。30 IU孕马血清促性腺激素(PMSG);宁波第二激素厂、江苏)。48小时后,这些老鼠那么对待人类绒毛膜促性腺激素(hCG;i.p。30 IU,宁波第二激素厂、江苏)诱发假孕。老鼠被处决,卵巢切除对进一步分析天7、14和21 hCG治疗后。实验协议是机构批准的动物保健和使用委员会和动物实验伦理委员会,福建师范大学。所有的努力都是减少动物不适和减少实验用动物的数量。

2.2。免疫组织化学

卵巢在4%多聚甲醛固定。固定后,卵巢是嵌入在石蜡,5μ米部分被切割和安装在幻灯片。干燥后,部分之前脱蜡、水化抗原检索。免疫组织化学分析的部分被加工anti-LC-3抗体(1:500稀释,ab48394 Abcam), anti-Beclin1抗体(11306 - 1 - 1:200稀释,美联社,Proteintech),和anti-p62抗体(1:200稀释,18420 - 1 - ap)。消极的控制使用血清(武汉博士德生物技术)而不是主要抗体。一夜之间的部分在4°C孵化主要抗体。特定的免疫反应性蛋白被精英ABC可视化工具包(美国BioGenex,圣拉蒙,CA)。然后,部分与苏木精复染色和安装带盖滑。

2.3。免疫印迹分析

CLs是卵巢解剖显微镜下分离。之后,CLs被用冰冷的缓冲区里帕均质补充蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂鸡尾酒,Beyotime生物技术研究所、海门、中国)对蛋白质提取。蛋白质浓度测定Bio-Rad蛋白质化验(Bio-Rad、大力神、钙、美国)与牛血清白蛋白标准。20μg蛋白样本进行sds - page凝胶电泳。非特异性结合被5%脱脂奶,和膜之后孵化一夜之间主要存在的抗体(补充表1)。孵化后,膜与TBST洗然后孵化辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit或鼠标免疫球蛋白g(1: 1000稀释,Beyotime生物技术研究所、海门、中国)在室温下1 h。最终,乐队被使用可视化增强化学发光恒星(ECL, Beyotime生物技术研究所、海门、中国)。乐队是量化使用ImageJ 1.49软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

2.4。定量rt - pcr(存在)

黄体样本的总RNA提取试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)然后reverse-transcribed cDNA使用商业套装(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。实时PCR进行SYBR超级混合(Bio-Rad、大力神、钙、美国)的反应体积20μl,反应是ABI StepOne处理系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。引物序列包括BNIP3 (F: 5 - - - - - -CTC TGC TGA GTG亚美大陆煤层气有限公司TTC TAC三大 ,R: 5 - - - - - -AAC ACA AGT GCT GGA TAC TGA TT-3 ),无(F: 5 - - - - - -GCA GTG CCA TTG AAC TGT GG-3 ,R: 5 - - - - - -甘氨胆酸GGA ACC AAT注册会计师猫CG-3 ),和GAPDH (F: 5 - - - - - -注册会计师CCC CTT猫TGA有条件现金援助CAA颈- 3 ,R: 5 - - - - - -亚美大陆煤层气有限公司ACG CCA GTA广汽苑ACG AC-3 )引物。表达数据规范化GAPDH的表达水平。

2.5。细胞治疗

测试HIF-1的效果αROS生源论,我们孤立的黄体细胞CL 7天的假孕根据之前提供的方法18]。模仿黄体回归,黄体细胞在OptiMEM孵化(Gibco)介质PGF的存在_2α(100μ米,σ)或PGF_2α和3-MA(2毫米,σ)24 h。

2.6。活性氧的检测

对于组织的检测,相同体积的CLs从卵巢解剖和均质在裂解缓冲(250毫米蔗糖,20毫米HEPES-NaOH, pH值7.5,10毫米氯化钾,1.5毫米MgCl₂1毫米EDTA 1毫米EGTA,鸡尾酒和蛋白酶抑制剂)19)收集上层的10000 g, 4°C为5分钟。DCFH-DA和上层清液的混合准备根据制造商提供的方法(南京建成生物技术研究所,中国)。之后,混合在37°C在黑暗中孵化了30分钟。DCF荧光是由一个微型板块阅读器的激发波长488 nm和发射波长535 nm)。

细胞内ROS水平是衡量使用商业套装(Beyotime,生物技术研究所、海门、中国)。简单地说,细胞被洗冷PBS。之后,培养细胞与DCFH-DA 37°C为20分钟。细胞被洗前和PBS测量;20000年的DCF荧光细胞是由一个微型板块读者的激发波长488 nm和发射波长535 nm (BioTek协同HT)。

2.7。统计分析

所有的数据提出的 。内显著差异或团体之间被单向方差分析评价,其次是图基的多个范围测试。使用SPSS统计分析进行了20个软件版本,和 被认为是一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。自噬在黄体细胞诱导Luteolysis Beclin1-Independent的方式

为了阐明诱导自噬在黄体回归,我们发现autophagy-related蛋白质的表达变化,包括标记蛋白(LC-3II,图1自噬的诱导,标记蛋白(p62,图1)自噬小体的退化和支架蛋白(Beclin1,图2(一个)参与自噬调控免疫组织化学染色分析。这些结果表明,LC-3II和p62期间黄体细胞中表达,与此同时增加黄体回归(图1),而Beclin1降低14天、21天的假孕(图2(一个))。免疫印迹结果也验证了增加LC-3II和p62(图2 (b))和减少Beclin1 14天、21天的假孕(图2 (b))。这些结果表明在黄体细胞自噬流量的减少CL回归,并Beclin1-independent调控自噬。

3.2。细胞凋亡的增加是与氧化应激和线粒体内稳态倾斜

正如我们所知道,细胞凋亡在黄体细胞诱导回归,因此本研究apoptosis-related蛋白质的表达进行了检查,发现显著增加的裂解caspase-3和伯灵顿在21天(数字3(一个)和3 (b))和一个明显减少bcl - 2在21天的假孕(数字3(一个)和3 (b))。此外,我们还发现CLs ROS水平显著增加,表明氧化应激的发生(图3 (c))。

ROS的海拔内容涉及线粒体内稳态的破坏。在紧张的情况下,动员mitophagy降低线粒体,以维持体内平衡(20.]。因此,我们发现PINK1的表达式(数字4(一)和4 (b)mitophagy感应),一个监管机构,VDAC1(数字4(一)和4 (b)),线粒体标记蛋白质。结果表明PINK1和VDAC1明显减少14天、21天的假孕(数字4(一)和4 (b)),表明线粒体数量的缩减,这种效应在luteolysis PINK1-independent方式为主。

3.3。HIF-1α在Luteolysis / BNIP3通路被激活

先前的研究已经表明缺氧黄体细胞的凋亡在体外(9),这意味着HIF-1α可能参与细胞凋亡在黄体回归在活的有机体内。因此,我们发现HIF-1的表达变化αHIF-1的信号,然后发现一个明显的增加α在21天的假孕(数字5(一个)和5 (b)),这表明HIF-1α在luteolysis信号被激活。此外,我们研究了BNIP3的表达式和拒绝,HIF-1下游两个主要因素α参与自噬诱导(21),在黄体回归。结果表明,BNIP3的表达和拒绝(数字5(一个)和5 (b))是在mRNA和蛋白水平增加(图5 (c))在21天的假孕,这与HIF-1是相一致的α表达的变化。有趣的是,HIF-1治疗α抑制剂echinomycin(决定)显著延迟期间黄体萎缩luteolysis(图5 (d)),进一步表明HIF-1α在黄体回归信号可能发挥重要作用。

3.4。抑制HIF-1α在Luteolysis信号减轻活性氧的生产和细胞凋亡

考虑到电解珩磨阻碍黄体回归,我们之后发现apoptosis-related蛋白(数据的表达6(一)和6 (b)),发现电解珩磨治疗明显抑制upregulation伯灵顿(数字6(一)和6 (b)),bcl - 2(数据的减少6(一)和6 (b)),激活caspase-3(数字6(一)和6 (b))在21天的假孕。此外,我们还观察到一个减少ROS水平Ech-treated老鼠,指示HIF-1的积极作用αROS生产(图6 (c))。结果表明,抑制HIF-1α信号可以明显减少ROS的产生和caspase-3的激活。

3.5。抑制HIF-1α信号改善自噬小体积累

来验证HIF-1的参与α在自噬诱导信号,我们抑制HIF-1α信号通过决定,然后检查autophagy-related蛋白(数据的表达式7和8)和HIF-1α下游蛋白质(图7)。结果表明,抑制HIF-1α活动明显受损BNIP3的表达式和NIX(数字7(一)和7 (b)),也减少LC-3II的水平(数据7(一)和7 (b)HIF-1),进一步巩固α参与自噬信号在luteolysis感应。除此之外,我们还观察到p62积累的抑制和减少线粒体聚集在CLs决定治疗后(数字8(一个)和8 (b))。总的来说,这些发现表明HIF-1α信号是由中介参与线粒体退化BNIP3的upregulation NIX中黄体回归。

3.6。自噬参与PGF_2α全身的活性氧产量和黄体细胞死亡

测试是否失调自噬是ROS的致病因素的生产,我们对与PGF细胞_2α模仿黄体回归。后面,我们观察到在PGF活性氧的增加_2α治疗。然而,抑制自噬的3-MA显然废除活性氧的增加(图9(一个))。这一结果表明,增加自我吞噬的,至少在某种程度上,在黄体回归ROS生成的上游。此外,我们还检测了自噬抑制对细胞凋亡的影响通过检测酶切caspase-3的表达。结果表明,caspase-3激活减弱3-MA治疗后(图9 (b)),这是与ROS生成的趋势一致。这些发现表明,自噬可以促进黄体细胞凋亡部分ROS-dependent地。

4所示。讨论

黄体素是一种重要的临时腺在哺乳动物卵巢的主要功能是负责生产的孕激素和荷尔蒙的体内平衡的维护在月经期和怀孕期间(1]。在月经期或没有怀孕的情况下,CLs停止产生孕激素,此后开始回归,最终消除卵巢的黄体结构。了多方面的证据已经证实氧化应激从事黄体回归在老鼠4和人类5]。此外,这些发现表明PGF_2α黄体回归诱导物,黄体细胞活性氧产量的关键启动子(1]。特别是PGF_2α也可以通过增加自噬促进黄体细胞死亡(10]。自噬水平的同时增加和活性氧产量上升的可能性,自噬的调节异常是一个重要的贡献者ROS生产和黄体的回归。在目前的研究中,我们表明,HIF-1α使upregulation黄体细胞的自噬水平促进黄体细胞死亡和CL回归诱导线粒体失调和活性氧的生产。

CL的回归是一个多步生物进展,包括功能性回归和结构回归(10]。以前,广泛的证据表明,细胞凋亡是主要的机制,有助于CLs的萎缩11,22]。最近的调查也表明,自噬被广泛参与黄体细胞死亡的规定在牛(黄体回归23,人类11),和老鼠10]。在哺乳动物细胞,诱导自噬在细胞的生存中扮演双重角色。所需的容忍程度的自噬是细胞死亡的阻力,而过度自噬是有害的对细胞的生存。自噬体的积累是一个负面因素诱导的自噬可能干扰细胞的正常生理机能。我们这里发现p62的表达,一个标记蛋白质表明自噬小体退化,Beclin1,自噬小体的一个重要支架蛋白启动(24),LC-3II自噬诱导的标记蛋白。p62水平的结果显示,与此同时增加的upregulation LC-3II,说明黄体细胞中自噬小体的积累黄体晚期的回归。然而,我们没有观察到的upregulation Beclin1 14天或21日假孕,表明自噬的经典之中监管老鼠CL。同样,Gaytan等人还透露的缩减Beclin1水平后期黄体期的人类CL (25),这与我们现在的发现是一致的。事实上,Beclin1-independent诱导自噬也观察到在某些癌症细胞系(26- - - - - -28]。的多数不在经典里的自噬调节了发挥负面作用在细胞的生存。

在哺乳动物中,回归的CLs毛细管网的退化,导致的缺氧利基CLs [1]。在压力条件下,细胞动员线粒体自噬的机制来降低冗余,以维持细胞内稳态的耗氧量下缺氧(29日]。机械、PINK1 BNIP3及其同源NIX是公认的主要介质参与mitophagy在哺乳动物细胞的诱导。其中,BNIP3主要进行监管的角色一个缺氧的环境下(30.- - - - - -32]。黄体细胞,BNIP3的表达显著调节伴随着缺氧下增强细胞凋亡,表明积极的黄体细胞凋亡作用[9]。因此,我们研究了线粒体数量的变化在黄体回归,发现线粒体的数量下降14,尤其是天21天的假孕伴随着HIF-1的增加α、BNIP3和拒绝。然而,我们观察到减少PINK1在回归。这些发现表明,HIF-1α参与线粒体损失通过诱导BNIP3 CLs年末。

线粒体内稳态失调的细胞凋亡是一个潜在的因素,特别是初始氧化应激(33]。CLs涉及大规模的萎缩和消除黄体细胞的凋亡在黄体回归(1),而其潜在的机制仍然不太为人所知。我们这里显示apoptosis-related蛋白质的表达,caspase-3裂解,和伯灵顿luteolysis期间显著调节,这与先前的报道是一致的(34]。同时,我们验证HIF-1的角色体内α把pseudopregnant有电解珩磨的老鼠。线粒体损失最少、电解珩磨治疗明显延迟,BNIP3表达式,caspase-3激活,黄体回归的步伐相比与控制。这些发现表明HIF-1α信号发挥了积极作用在黄体细胞的凋亡和CLs luteolysis期间的萎缩。值得注意的是自噬可以由不同的机制在黄体退化和物种之间也可能存在差异23]。

在此之前,在体外研究表明,PGF_2α,哺乳动物的一个重要触发黄体功能回归,是一个至关重要的诱导的氧化应激和细胞凋亡在大鼠黄体细胞(1]。值得注意的是,它还表现出一个积极的影响自噬调节(10]。在目前的研究中,我们表明,autophagy-induced黄体细胞凋亡是部分依赖于氧化应激,抑制自噬可以改善ROS生产和细胞凋亡。

综上所述,在目前的研究中,我们发现HIF-1α/ BNIP3信号通路参与黄体细胞的凋亡诱导氧化应激和CL的回归。

数据可用性

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料;进一步询问可以针对相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

工作是由ZT型、JC ZZ, ZW;这个实验是由ZT型、JC ZZ, JB, RX,和QL;数据分析了ZT型、JC ZZ, JB, RX, QL, ZW;试剂/材料/分析工具被ZT型了,JC, ZZ, JB, RX, QL, ZW。稿件的写作是由ZT型、JC ZZ和ZW。所有作者进行审核和批准的最终版本出版的手稿。Zonghao唐,佳洁陈,经张了同样工作。

确认

这项工作是由中央政府的专项资金支持指导地方科技发展(2020 l3008),开放的基础医学电生理学四川省重点实验室,教育部(键-我- 2020 - 006),和福建省自然科学基金(2020 j01176和2021 i01010045)。

补充材料

补充表1:抗体免疫印迹的信息。(补充材料)

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