女性Sprague-Dawley老鼠(21 ~ 23天左右)从乌石购买实验动物供应有限公司(福州,中国)。动物们保持在14 h: 10 h明暗时间表的连续供应食物和水。这些老鼠被i.p超数排卵。30 IU孕马血清促性腺激素(PMSG);宁波第二激素厂、江苏)。48小时后,这些老鼠那么对待人类绒毛膜促性腺激素(hCG;i.p。30 IU,宁波第二激素厂、江苏)诱发假孕。老鼠被处决,卵巢切除对进一步分析天7、14和21 hCG治疗后。实验协议是机构批准的动物保健和使用委员会和动物实验伦理委员会,福建师范大学。所有的努力都是减少动物不适和减少实验用动物的数量。

卵巢在4%多聚甲醛固定。固定后,卵巢是嵌入在石蜡,5 μ米部分被切割和安装在幻灯片。干燥后,部分之前脱蜡、水化抗原检索。免疫组织化学分析的部分被加工anti-LC-3抗体(1:500稀释,ab48394 Abcam), anti-Beclin1抗体(11306 - 1 - 1:200稀释,美联社,Proteintech),和anti-p62抗体(1:200稀释,18420 - 1 - ap)。消极的控制使用血清(武汉博士德生物技术)而不是主要抗体。一夜之间的部分在4°C孵化主要抗体。特定的免疫反应性蛋白被精英ABC可视化工具包(美国BioGenex,圣拉蒙,CA)。然后,部分与苏木精复染色和安装带盖滑。

CLs是卵巢解剖显微镜下分离。之后,CLs被用冰冷的缓冲区里帕均质补充蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂鸡尾酒,Beyotime生物技术研究所、海门、中国)对蛋白质提取。蛋白质浓度测定Bio-Rad蛋白质化验(Bio-Rad、大力神、钙、美国)与牛血清白蛋白标准。20 μg蛋白样本进行sds - page凝胶电泳。非特异性结合被5%脱脂奶,和膜之后孵化一夜之间主要存在的抗体(补充表 1)。孵化后,膜与TBST洗然后孵化辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit或鼠标免疫球蛋白g(1: 1000稀释,Beyotime生物技术研究所、海门、中国)在室温下1 h。最终,乐队被使用可视化增强化学发光恒星(ECL, Beyotime生物技术研究所、海门、中国)。乐队是量化使用ImageJ 1.49软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

黄体样本的总RNA提取试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)然后reverse-transcribed cDNA使用商业套装(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。实时PCR进行SYBR超级混合(Bio-Rad、大力神、钙、美国)的反应体积20 μl,反应是ABI StepOne处理系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。引物序列包括BNIP3 (F: 5 ′ ctc TGC TGA GTG亚美大陆煤层气有限公司TTC TAC三大 ′ R: 5 ′ aac ACA AGT GCT GGA TAC TGA TT-3 ′ ),无(F: 5 ′ gca GTG CCA TTG AAC TGT GG-3 ′ R: 5 ′ 甘氨胆酸gga ACC AAT注册会计师猫CG-3 ′ )和GAPDH (F: 5 ′ 注册会计师CCC CTT猫TGA有条件现金援助CAA颈- 3 ′ R: 5 ′ 亚美大陆煤层气有限公司ACG CCA GTA广汽苑ACG AC-3 ′ )引物。表达数据规范化GAPDH的表达水平。

测试HIF-1的效果 αROS生源论,我们孤立的黄体细胞CL 7天的假孕根据之前提供的方法 18]。模仿黄体回归,黄体细胞在OptiMEM孵化(Gibco)介质PGF的存在_{2 α}(100 μ米,σ)或PGF_{2 α}和3-MA(2毫米,σ)24 h。

对于组织的检测,相同体积的CLs从卵巢解剖和均质在裂解缓冲(250毫米蔗糖,20毫米HEPES-NaOH, pH值7.5,10毫米氯化钾,1.5毫米MgCl₂1毫米EDTA 1毫米EGTA,鸡尾酒和蛋白酶抑制剂) 19)收集上层的10000 g, 4°C为5分钟。DCFH-DA和上层清液的混合准备根据制造商提供的方法(南京建成生物技术研究所,中国)。之后,混合在37°C在黑暗中孵化了30分钟。DCF荧光是由一个微型板块阅读器的激发波长488 nm和发射波长535 nm)。

细胞内ROS水平是衡量使用商业套装(Beyotime,生物技术研究所、海门、中国)。简单地说,细胞被洗冷PBS。之后,培养细胞与DCFH-DA 37°C为20分钟。细胞被洗前和PBS测量;20000年的DCF荧光细胞是由一个微型板块读者的激发波长488 nm和发射波长535 nm (BioTek协同HT)。

所有的数据提出的 的意思是 ± SE 。内显著差异或团体之间被单向方差分析评价,其次是图基的多个范围测试。使用SPSS统计分析进行了20个软件版本,和 P < 0.05 被认为是一个统计上的显著差异。

为了阐明诱导自噬在黄体回归,我们发现autophagy-related蛋白质的表达变化,包括标记蛋白(LC-3II,图 1自噬的诱导,标记蛋白(p62,图 1)自噬小体的退化和支架蛋白(Beclin1,图 2(一个)参与自噬调控免疫组织化学染色分析。这些结果表明,LC-3II和p62期间黄体细胞中表达,与此同时增加黄体回归(图 1),而Beclin1降低14天、21天的假孕(图 2(一个))。免疫印迹结果也验证了增加LC-3II和p62(图 2 (b))和减少Beclin1 14天、21天的假孕(图 2 (b))。这些结果表明在黄体细胞自噬流量的减少CL回归,并Beclin1-independent调控自噬。

正如我们所知道,细胞凋亡在黄体细胞诱导回归,因此本研究apoptosis-related蛋白质的表达进行了检查,发现显著增加的裂解caspase-3和伯灵顿在21天(数字 3(一个)和 3 (b))和一个明显减少bcl - 2在21天的假孕(数字 3(一个)和 3 (b))。此外,我们还发现CLs ROS水平显著增加,表明氧化应激的发生(图 3 (c))。

ROS的海拔内容涉及线粒体内稳态的破坏。在紧张的情况下,动员mitophagy降低线粒体,以维持体内平衡( 20.]。因此,我们发现PINK1的表达式(数字 4(一)和 4 (b)mitophagy感应),一个监管机构,VDAC1(数字 4(一)和 4 (b)),线粒体标记蛋白质。结果表明PINK1和VDAC1明显减少14天、21天的假孕(数字 4(一)和 4 (b)),表明线粒体数量的缩减,这种效应在luteolysis PINK1-independent方式为主。

先前的研究已经表明缺氧黄体细胞的凋亡 在体外( 9),这意味着HIF-1 α可能参与细胞凋亡在黄体回归 在活的有机体内。因此,我们发现HIF-1的表达变化 αHIF-1的信号,然后发现一个明显的增加 α在21天的假孕(数字 5(一个)和 5 (b)),这表明HIF-1 α在luteolysis信号被激活。此外,我们研究了BNIP3的表达式和拒绝,HIF-1下游两个主要因素 α参与自噬诱导( 21),在黄体回归。结果表明,BNIP3的表达和拒绝(数字 5(一个)和 5 (b))是在mRNA和蛋白水平增加(图 5 (c))在21天的假孕,这与HIF-1是相一致的 α表达的变化。有趣的是,HIF-1治疗 α抑制剂echinomycin(决定)显著延迟期间黄体萎缩luteolysis(图 5 (d)),进一步表明HIF-1 α在黄体回归信号可能发挥重要作用。

考虑到电解珩磨阻碍黄体回归,我们之后发现apoptosis-related蛋白(数据的表达 6(一)和 6 (b)),发现电解珩磨治疗明显抑制upregulation伯灵顿(数字 6(一)和 6 (b)),bcl - 2(数据的减少 6(一)和 6 (b)),激活caspase-3(数字 6(一)和 6 (b))在21天的假孕。此外,我们还观察到一个减少ROS水平Ech-treated老鼠,指示HIF-1的积极作用 αROS生产(图 6 (c))。结果表明,抑制HIF-1 α信号可以明显减少ROS的产生和caspase-3的激活。

来验证HIF-1的参与 α在自噬诱导信号,我们抑制HIF-1 α信号通过决定,然后检查autophagy-related蛋白(数据的表达式 7和 8)和HIF-1 α下游蛋白质(图 7)。结果表明,抑制HIF-1 α活动明显受损BNIP3的表达式和NIX(数字 7(一)和 7 (b)),也减少LC-3II的水平(数据 7(一)和 7 (b)HIF-1),进一步巩固 α参与自噬信号在luteolysis感应。除此之外,我们还观察到p62积累的抑制和减少线粒体聚集在CLs决定治疗后(数字 8(一个)和 8 (b))。总的来说,这些发现表明HIF-1 α信号是由中介参与线粒体退化BNIP3的upregulation NIX中黄体回归。

测试是否失调自噬是ROS的致病因素的生产,我们对与PGF细胞_{2 α}模仿黄体回归。后面,我们观察到在PGF活性氧的增加_{2 α}治疗。然而,抑制自噬的3-MA显然废除活性氧的增加(图 9(一个))。这一结果表明,增加自我吞噬的,至少在某种程度上,在黄体回归ROS生成的上游。此外,我们还检测了自噬抑制对细胞凋亡的影响通过检测酶切caspase-3的表达。结果表明,caspase-3激活减弱3-MA治疗后(图 9 (b)),这是与ROS生成的趋势一致。这些发现表明,自噬可以促进黄体细胞凋亡部分ROS-dependent地。