单胚胎移植后极早产儿单绒毛膜三胞胎CALCA和CALCB的DNA甲基化模式

抽象的

与足月同辈婴儿相比，早产儿更容易患新生儿疾病和死亡。DNA甲基化的变化可能影响这些病理过程。降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide, CGRP)在生殖和慢性炎症中发挥复杂多样的作用，并参与妊娠期血管适应和滋养细胞的功能维护。本研究以单胚胎移植后单绒毛膜三联胚胎早产婴儿为研究对象，以足月双胚胎和双绒毛膜双胞胎为对照。从脐带组织中提取DNA进行焦磷酸测序，检测CGRP启动子区CpG岛甲基化水平。从数据库中获得的极早产儿脐带组织中CGRP甲基化的平均值高于正常对照组。免疫荧光结果显示α单合子三胞胎脐带血管壁CGRP降低，死亡病例尤为明显βCGRP具有代偿性表达。总之，我们的研究结果表明，CGRP的高甲基化可能被认为是严重的新生儿疾病的一个重要原因。

1.介绍

脐带或胎盘中的血液循环受损可能导致宫内生长限制和过早的递送，并且被认为是怀孕期间的重要并发症[1］．降钙素基因相关肽(CGRP)被认为是最有效的血管扩张剂，在慢性低级别炎症中起着复杂多样的作用[2］．它与妊娠期间血管适应和滋养细胞的功能性维持密切相关[3.］．它包括两个子类CALCA (αcgrp）和compb（βCGRP)，这些与蜕膜、胎盘形成和胎儿生长的分子信号网络协调，促进成功的妊娠结局[3.，4］．但它在早产过程中分子和细胞事件的精细同步中的作用仍是未知的。

我们之前的研究表明，异常分泌βCGRP是由CALCB突变引起的，失去了对炎症细胞的抑制作用，导致闭塞性血管炎和神经周炎[5］．白细胞介素- (IL-) 6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α）在CGRP-KO大鼠中表达，这可能参与胎儿炎症的发生[6］．CGRP可以抑制炎症因素的合成和/或释放，如TNF-α通过cAMP/PKA信号通路调节巨噬细胞细胞因子表达，抑制Th1淋巴细胞分化。CGRP还可以调节Th1/Th2细胞之间的平衡，促进巨噬细胞和Th2淋巴细胞释放IL-10和IL-4，抑制Th1细胞抗原提呈，从而抑制Th1细胞介导的细胞免疫[7，8］．因此，我们推测CGRP可能参与妊娠期间炎症的免疫调节和抑制，从而影响胎儿发育和劳动力进展。

除了神经因素的影响外，CGRP的表达对其自身的基因结构和甲基化修饰也起着重要的调控作用。有一个很大的CpG岛在5CALA的侧翼启动子区域并含有微生物感染特异性响应元素，其在细菌感染期间调节proCalcitonin（PCT）的转录[9］．CALCB的结构与CALCA相似，由两个不同的富含cpg的区域组成，其中一个位于外显子1附近，另一个位于上游约1.5 kb [10］．单卵多胎可能是由于胚胎发育过程中甲基化模式的不同而发生的，这可能是胎儿发育差异的一个原因[11］．单绒毛膜三胞胎(MCTA)遗传背景是研究CGRP在妊娠维持中的作用的一个常见、可靠和极好的样本。因此，本研究检测了单绒毛膜三个羊膜囊脐带组织中CALCA和CALCB的甲基化水平和表达位置，并评估其与早产的关系。

2.材料和方法

2．1．研究课题

在20月2020年4月收集了单胚性移植后三个男孩的单种式三胞胎的病例和三个男孩的过早产卵作为研究科目，该研究受试者于2020年4月福建医科大学第一届医科大学的生殖医学中心。此外，那些正在进行双胚泡移植的人选择了同一时期。绒毛膜双胞胎和两个全术期产卵用作对照。收集包括年龄，基本激素水平，胎儿开发过程和家族史的一般信息。获得其同意后，剩余的脐带和胎盘组织样本在体外病理诊断收集甲基化和免疫组化检测。

2.2。数据库检索和预测

为了研究脐带血或脐带血基因甲基化与早产之间的关系，我们找到了两个匹配的数据库。152份来自CCCEH出生队列的脐带血样本的全基因组DNA甲基化分析Illumina Infinium 450k人类DNA甲基化珠片用于获取脐带血样本中大约45万个cpg的DNA甲基化图谱。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69176．

以6个CpGs为基础的表观遗传衰老特征，通过焦磷酸测序或亚硫酸氢盐扩增子条形码测序进行分析。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE82234．

2．3.焦磷酸测序

从脐带组织中提取的DNA从胎盘附件(约5厘米)的三个单绒毛膜三胞胎和早产婴儿出生后单胚泡移植和双胚泡移植双绒毛膜双胞胎和两个足月的婴儿安全出生使用Tiangen DNA提取工具包(Tiangen、北京、中国)根据制造商的说明。将DNA直接送到基因技术(上海)有限公司(Gene Tech, Shanghai, China)进行焦磷酸测序，检测CGRP启动子区CpG岛的甲基化水平。测序引物、条件、测序序列如图所示1．

2．4．免疫荧光

免疫荧光测量如前所述[12］．简要描述的步骤如下：将脐带组织和胎盘组织固定在4％福尔马林中，过夜，嵌入在石蜡中，在4mm下段。还进行了免疫荧光共聚焦显微镜以确定CALCA的相关性（αcgrp）和compb（βCGRP）。用兔抗人和1：50稀释; a11804，acclonal，cn）检测计算计算，并用兔抗人和稀释型多克隆抗体（1：200稀释; a5523，阿接属，cn）检测Calcb。二次抗体是罗丹明 - （三-TC-）共轭山羊抗兔IgG或FITC标记的山羊抗兔IgG。用DAPI溶液染色核。

3.结果

3．1.三胎妊娠的临床资料

在体外施肥（IVF）治疗一名29岁的女性患者，并在第5天移植一个胚泡（4Ab）的新鲜循环，这是一种单色三重羊膜妊娠，如妊娠超声所示。这种胚泡过早破裂的膜 ，三个男孩过早出生。新生儿具有4％的APGAR得分为4和800克。其中一种新生儿身高高，营救后营养不良，并在抢救后死亡（表1)．一般临床资料显示，与现任丈夫生活6年，结婚5年，平均性生活3-4个月。丈夫已经射精，还没有怀孕。患者于2015年被诊断为“多囊卵巢综合征”。2016年患者行腹腔镜卵巢穿孔、宫腔镜、双侧输卵管切除术等一系列手术。手术期间病人输液正常。术后病理显示子宫内膜息肉。基础内分泌检查:FSH 1.11 IU/L, LH 6.4 IU/L, E2 35.2 miu/L, t57.6 nmol/L, AMH 5.95 ng/mL。出生的历史:0-0-0-0。6年未怀孕且未采取避孕措施。 The semen of the man is normal, the chromosomes of both men and women are normal, and the close relatives of both men and women do not have multiple births. All human studies were approved by the Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University (MTCA, ECFAH of FMU [2019] 001) and (MTCA, ECFAH of FMU [2015] 084-1).

2019.8.23超声波显示左侧卵巢的5个Antral卵泡， 右侧卵巢有3-4个腔内卵泡，Em: 13.0 cm, C型。采用GnRH-a超长方案，与患者沟通后将亮丙雷降至3.75 mg/d。2019.9.10降效27天，血激素:E2: 33.19 pmol/l, FSH: 2.42 IU/ l, LH: 0.51 IU/ l。 ：0.64 nmol / L。阴道b超示:左侧卵巢可见8-9个窦性卵泡，右侧卵巢可见4个窦性卵泡，Em: 2.0 mm, C型。与患者沟通后给予LH 150iu /d，开始给予hmg225iu /d生长激素4iu /d。2019-9-30 gn11天，阴道b超:双侧卵巢有22个卵泡，其中6个为> . 8cm卵泡。血激素:E2: 7678 pmol/L1.11 nmol/L, LH: 1.25 IU/L。停止Gn, Azer 200ug触发器，OPU操作38小时。12个卵被检测，其中10个成熟。体外受精短期内，7个出现2PN, D3高质量3个胚胎。转移一个新鲜周期胚胎并给予地屈孕酮20 mg bid po10 d;黄体酮栓剂2片10 d。

冷冻胚胎:D5 (4AB, 4BB)， D6 (4CC+)。

新鲜循环胚胎转移：单胚泡移植（2PN-4CII-8CII-4BA）（图2(一个))，移植过程进展顺利。第11天，血液HCG 194.7 mIu/mL，第14天，血液HCG 595.1 mIu/mL， 超声波显示妊娠囊尺寸： (厘米)。大体病理显示单个胎盘、三个羊膜囊和三个脐带(图)2 (b)和2 (c))．组织病理学显示急性胆小炎和绒毛膜梭菌性血管炎（图2 (d))．没有发现三重态输血综合征。

３．２．超声监测结果

图中为三个独立胎儿(a、b、c)、单个胎盘和三个独立羊膜囊的早期超声(12w)3(一个)．彩色多普勒超声NT检查示子宫腔内有3个胎儿和1个胎盘回声，3个胎儿排列在右上(a)、左上(b)、右下(c)象限。三个胎儿之间可见膈肌回声，三个膈肌与胎盘呈T征。胎盘位于后壁，由下缘覆盖子宫颈。成熟度级别为0(图3 (b))．二孕中期超声检查（20周）显示胎盘成熟水平的I和厚度约为3.23厘米（图3 (c))．

3．3．数据库搜索结果

采集脐静脉(6份)和脐带血(152份)。CALCA的甲基化率分别为10.08%和9.50%，CALCB的甲基化率分别为5.31%和7.71%。

3.4。甲基化测序结果

胎儿A，B和C脐带组织中CPG岛甲基化的CPG岛甲基化的平均值分别为12.125％，15.5％和18.625％，并且这些均高于正常对照的影响。D和E脐带组织的CAPA启动子区的平均甲基化率仅为6.125％和4.375％。基于这一点，显然，早产儿脐带组织中的计算甲基化百分比高于全初级出生，以及在救援后死亡的胎儿脐带组织中的计算甲基化百分比最高。

早产儿A、B、C脐带组织中CALCB甲基化的平均值分别为15.889%、11.222%、16.667%，均高于正常对照组。然而，足月胎儿D和E脐带组织中CALCB启动子区CpG岛甲基化率平均仅为2.778%和7.0%。此外，早产儿脐带组织中CALCB的甲基化百分比高于足月产儿，抢救后死亡胎儿C脐带组织中CALCB启动子区甲基化百分比仍然最高(图)4)．

其中，同卵三胞胎分别是三胞胎A，三胞胎B，三胞胎C，三胞胎D，三胞胎E。pyrophosphorylation测序的结果表明,甲基化水平的CALCA和CALCB脐带组织三个早产与单绒毛膜囊高于足月双胞胎双绒毛膜囊,救援后,甲基化水平的死亡病例相比,较高的。

3.5。组织免疫组织化学测试结果

免疫荧光结果表明表达了α双胞胎兄弟(A、B、C三胞胎)脐带中的CGRP低于正常对照组(D、E三胞胎)，尤其是死亡病例(C三胞胎)(图)5)．免疫荧光结果表明水平βCGRP显示双胞胎和正常人脐带的血管内皮和血管壁无明显差异，包括无抢救死亡病例(图)6)．

4。讨论

由于免疫功能受损、炎症和血管调节，早产儿易患多种并发症[13，14］．关于Calcitonin / Calcitonin基因相关肽（CT / CGRP）与妊娠的关系的发现强调了各种生理过程中的新信号传播介质，包括繁殖[15，16］．除了调节血管外，CGRP还具有调节免疫和炎症反应的多种功能[17- - - - - -19］．它整合了局部微环境中的炎症和免疫反应[5，6，15］．CGRP可改变淋巴细胞增殖、抗原呈递、细胞因子产生、B淋巴细胞分化和粘附分子表达[5，6］．研究神经肽对炎症和血管调节的影响可以帮助我们揭示早产儿的可能机制。

我们之前的研究表明，CGRP基因的突变或异常剪接可能导致细胞中CGRP的异常定位和合成，导致神经周炎和血管炎[5］．与血管内皮细胞和平滑肌细胞相似，滋养细胞也表达CRLR和RAMP1等受体蛋白，提示CGRP可能参与了滋养细胞功能的调控[20.］．长期服用CGRP受体拮抗剂CGRP_8-37注入怀孕大鼠后，幼鼠体重显著降低，收缩压升高，胎儿死亡率呈剂量依赖性[21，22］．这种现象表明CGRP表达与早产的表达之间的关系。

早产与几个不同组织的DNA甲基化有关，包括胎盘、新生儿血液和新生儿唾液[23，24］．在这些之前的研究中，许多与早产相关的CpG位点位于与神经元发育和/或神经退行性疾病相关的基因中[25，26］．这可能是相同胎儿发展差异的原因之一[27，28］．在本研究中，焦磷酸测序证实单绒毛膜三羊膜囊早产脐带组织的CALCA和CALCB甲基化水平高于数据库中双绒毛膜双胞胎和正常对照组。此外，与其他双胞胎兄弟相比，抢救后死亡病例的甲基化水平更高。免疫荧光结果显示α单合子三胞胎脐带血管壁CGRP降低，死亡病例尤为明显βCGRP是否具有代偿性还需要进一步深入研究。

CGRP高甲基化可能影响妊娠期间脐带脐带和滋养细胞功能的血管适应[29］．因此，我们假设Cpg岛在脐带组织中CGRP基因启动子区的高甲基化导致CGRP的低表达，促进早产的发育。两个亚型αCGRP怎样和βCGRP具有极高的相似之处，仅在三个氨基酸中不同，其中一个是缺乏其中一种的，而另一个变化积极或负面30.，31］．与野生型控制相比，βCGRP mRNA水平在背根神经节和脊髓αCGRP敲除小鼠没有变化，但肠道内的水平降低了两倍[32］．在老鼠的肠子里βcgrp，表达αCGRP信使RNA增加，表示补偿缺乏的自适应机制βCGRP怎样。

总之，本研究重点关注单胚胎转移后三绒毛膜三胞苷的早产。焦塞法用于检测脐带中的计算和计算的甲基化，并分析数据库搜索的正常控制结果。这表明通过调节CGRP的表达，CAPA和COPB高甲基化可能影响妊娠血管适应和滋养细胞功能。它被认为是早产和血管炎的一个极其重要的原因。

数据可用性

所有的数据和材料产生和/或分析在当前的研究期间可从通信作者的合理要求。

伦理批准

动物工作中的所有实验程序都是由福建医科大学的伦理委员会批准。本研究按照福建医科大学第一次附属医院的医疗伦理委员会的建议进行。该议定书由福建医科大学第一次附属医院医学伦理委员会批准[036]和2018 [049]。

披露

资金来源对样本采集、患者样本分子分析和生物信息学分析起到了关键的支持作用。

利益冲突

作者没有竞争利益才能宣布。

作者的贡献

q - c.l.， f.g.和y - j.g.策划了这个项目。Q.-C。L.和F.G.构思和设计了这项研究。x - t.c.， K.Z.， q - y.g .， F.G.和Q.-C.L.进行样本采集。S.-R。H.、Q.-Q.C.、H.- l .、y. - l .和q .- c .进行免疫组化。Q.-C.L.， F.G.和h.l . z进行表达分析。q - c.l, x.m.x.和q - y.g分析了数据并起草了手稿。所有作者审查了手稿并批准了最终版本。高峰、郭玉佳、陈星婷、顾秋阳等人对这部作品贡献良多。

致谢

我们要感谢博士。厦门大学第一附属医院生殖医学中心李友柱，感谢他在胚胎学解释方面的支持;博士学位。福建医科大学第一附属医院妇产科何新琴，感谢他在组织标本定位方面的支持;感谢福建医科大学医学检验学院学生刘玉欣、罗悦、罗晓霞、赖俊杰在语言处理方面的支持。作者真诚地感谢参与者的帮助和参与本研究的意愿。基金资助:国家自然科学基金项目(no . 82172953, no . 81871293);福建省医学创新基金项目(no . 2019-CX-27, no . 2020CXA030);福建医科大学帆船基金项目(no . 2018QH1078);福建省卫生厅青年基金(2019-1-41、2019-1-46)。

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