文摘
阿霉素的毒性(阿霉素)限制了其临床应用。不过,目前还没有有效的药物来防止DOX-induced心脏损伤。mir - 204是一个新发现的microrna与许多保护对心血管疾病的影响。然而,目前还没有做过任何研究的影响在DOX-induced mir - 204心脏损伤。我们的研究旨在调查mir - 204对DOX-induced心肌损伤的影响。adenoassociated病毒系统用于实现心脏过度mir - 204。两周后,小鼠腹腔注射阿霉素(15毫克/公斤)诱导心脏损伤。H9c2心肌细胞用于验证mir - 204体外的作用。我们的研究表明,mir - 204表达减少DOX-treated心。mir - 204超表达改善心脏功能和减轻心脏炎症、细胞凋亡和自噬通过强力霉素诱导。 In addition, our results showed that miR-204 prevented DOX-induced injury in cardiomyocytes by directly decreasing HMGB1 expression. Moreover, the overexpression of HMGB1 could offset the protective effects of miR-204 against DOX-induced cardiac injury. In summary, our study showed that miR-204 protected against DOX-induced cardiac injury via the inhibition of HMGB1, and increasing miR-204 expression may be a new treatment option for patients with DOX-induced cardiac injury.
1。介绍
阿霉素是目前最有效和广泛使用的抗癌药物之一,但其具体毒性严重阻碍了其临床应用(1]。Doxorubicin-induced毒性往往会导致不可逆的退行性心肌病和充血性心力衰竭,这与高发病率和死亡率(2,3]。
Doxorubicin-induced毒性涉及多种机制,包括心肌细胞凋亡和自噬4,5]。然而,尽管许多研究描述的潜在机制doxorubicin-induced毒性,目前仍缺乏有效的护心方法可用。鉴于其有效性和广泛应用于癌症,重要的是要开发新的治疗策略来减轻毒性和障碍阿霉素所致。
最近,一些研究主要集中在小分子核糖核酸的参与(microrna) DOX-induced毒性的研究6]。microrna是小非编码rna调节基因表达在转录后的级别通过调节目标mrna (7]。有越来越多的证据表明,microrna在不同的生理/病理过程中起着关键作用。更重要的是,有越来越多的证据表明,microrna参与所有心脏功能,包括心肌细胞凋亡、自噬、电信号电导(8]。此外,临床和动物研究表明,microrna是潜在的监管机构DOX-induced毒性(9]。一个特定的microrna, mir - 204,最初被认为是一种肿瘤抑制在人类癌症10]。mir - 204已报道在调节细胞凋亡中发挥作用,炎症、肿瘤形成,免疫细胞的发展。最近,有研究表明,mir - 204中扮演一个重要的角色在许多心血管疾病,如肥厚性心肌病和心肌缺血再灌注损伤(11]。然而,mir - 204的功能和分子机制防止DOX-induced心脏损伤没有被报道。
在我们的研究中,我们调查的潜在功能mir - 204 DOX-induced心脏损伤。我们的研究结果表明,mir - 204的表达减少DOX-treated心。此外,我们发现,过度的mir - 204可以减弱阿霉素引起的不利影响。我们进一步发现mir - 204细胞炎症,减少细胞凋亡和自噬通过直接减少HMGB1表达。
2。材料和方法
2.1。动物实验设计
所有程序都执行根据美国国立卫生研究院的指导的护理和使用实验室动物和动物保健和使用委员会批准的郑州大学第一附属医院。中国医学科学院实验动物研究所的科学(中国,北京)提供男C57B / L6J老鼠。老鼠被分为4组:GFP-NS集团aav - mir - 204 ns组GFP-DOX组和aav - mir - 204 -阿霉素组( 在每组)。单一政府的强力霉素(15毫克/公斤腹腔内注射)被用来建立一个短期心脏损伤模型。同等体积的生理盐水是管理控制老鼠12]。老鼠给adenoassociated病毒编码鼠mir - 204 (aav - mir - 204)和控制向量(AAV-green荧光蛋白(GFP))注入体内过度表现mir - 204。简单地说,阿霉素注射前14天,老鼠服用AAV载体( 基因组拷贝/鼠标,总共50μL /鼠标)通过注入retroorbital静脉丛中描述的一项研究[13]。
2.2。重组Adenoassociated病毒(AAV) 9构造
AAV9-GFP和aav9 - mir - 204被Vigene构造和生成的生物科学(山东、中国)。短暂,小鼠mir - 204基因被克隆到p-ENTER向量AsiS我和Mlu限制性位点。p-ENTER质粒包含所需的基因和AAV载体pAV-C-GFP cotransfected到293 t细胞获取pAAV-MCS质粒。然后,重组质粒pAAV-MCS转染进aav - 293 t细胞。转染三天后,AAV9 vector-producing 293 t细胞收获了向量净化。实时PCR用于量化AAV病毒颗粒。
2.3。超声心动图和血流动力学
超声心动图和血流动力学测量进行如我们之前所述研究[14]。短暂,MyLab 30简历超声波(Esaote SpA、热那亚、意大利)使用10 MHz线性阵列超声换能器超声心动图测量参数。米勒导管传感器(spr - 839;米勒仪器,休斯顿,德克萨斯州)和PVAN数据分析软件被用来测量血流动力学参数。
2.4。生化测定
48小时阿霉素注射后,老鼠血液收集和离心收集血清。富士DRI-CHEM化学分析仪(富士胶片、东京、日本)是用来测量心肌肌钙蛋白I (cTnI)、肌酸激酶同功酶(水平)和乳酸脱氢酶(LDH)。
2.5。组织学分析,免疫组织化学和TUNEL染色
Hematoxylin-eosin())和picrosirius红染色和免疫组织化学进行了如我们之前所述研究[15]。
LV肌细胞面积从100 - 200细胞计算每组。主要抗体,包括anti-4-hydroxynonenal (4-HNE;1:100),anti-CD45 (1: 100), anti-CD68(1: 100),和anti-TNF -α(1:100),用于免疫组织化学分析。商业工具(微孔、Billerica MA)被用来染色TUNEL-positive细胞。
2.6。细胞培养和治疗
上海生命科学研究院(上海,中国)提供了H9c2细胞。细胞在DMEM培养(C11995;Gibco、大岛屿,美国纽约)补充10%的边后卫(的边后卫,10099;Gibco)、青霉素(100 U /毫升),链霉素(100毫克/毫升)(15140;Gibco)湿润孵化器(三洋18米,大阪,日本)5%的股份有限公司2在37°C。细胞转染与adenoassociated病毒载体包含整个鼠过度表现HMGB1 HMGB1 cDNA编码区域。细胞转染与adenoassociated病毒载体编码绿色荧光蛋白的控制。阿霉素治疗前,mir - 204的细胞转染模仿(50 nM)或消极的控制(数控模拟)(RiboBio,广州,中国)。细胞与强力霉素治疗(1μmol / L) [16)24 h体外诱导细胞损伤。
2.7。ELISA和乳酸脱氢酶(LDH)测定
肿瘤坏死因子-α、il - 1、il - 6在量化利用商业ELISA试剂盒(博士德生物科技有限公司,中国)。LDH水平测量使用商业配套试剂(Biotein、上海、中国)根据制造商的指示。
2.8。评价LC3 Puncta
细胞被洗的磷酸盐(PBS),固定与RCL2®(RCL2-CS24L;ALPHELYS、整容项目、法国),permeabilized在PBS Triton™x - 100年的0.1%。细胞培养与anti-LC3(美国细胞信号技术,波士顿,MA)的稀释1:100年1%的山羊血清。细胞培养的Alexa萤石488 -共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白(Ig) G (A11001;英杰公司生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)二级抗体。细胞被孵化与DAPI SlowFade黄金不变色试剂(S36939;英杰公司生命技术)。AX60客观(BX51显微镜,奥林巴斯)被用来观察图像。
2.9。实时聚合酶链反应和免疫印迹
总RNA分离和纯化如我们之前所述研究[17,18]。从冰冻的老鼠心脏组织总RNA提取或心肌细胞使用试剂盒试剂(15596 - 026;英杰公司)。RNA (2μg的每个样本)reverse-transcribed进cDNA使用益生元(DT)引物和一个Transcriptor合成第一链cDNA工具包(04896866001;罗氏公司)。480年LightCycler SYBR绿色主混合系统(罗氏)是用于量化。GAPDH基因被用作参考。
总蛋白提取描述在我们之前的研究15]。一个冰冷的radioimmunoprecipitation分析缓冲区(包含50 mM Tris-HCl, 150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,和0.1% SDS)被用来从心肌细胞和心脏组织中提取的蛋白质。10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶用于分离蛋白质。以下主要抗体被用于:伯灵顿,bcl - 2,细胞色素c, HMGB1, ATG5, ATG12, LC3, p62, 3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(1: 1000稀释,细胞信号技术,波士顿,MA,美国)。使用辣根peroxidase-conjugated二级抗体(杰克逊ImmunoResearch实验室、西树林,PA,美国)。图像实验室5.2.1软件是用于量化。GAPDH蛋白被用作参考。
2.10。荧光素酶报告实验
预测的潜在结合位点mir - 204和HMGB1,米兰达软件使用(http://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do)。pRL-CMV荧光素酶报告质粒是由克隆3 - - - - - -翻译区(3 - - - - - -UTR)包含潜在的人类HMGB1基因mir - 204结合位点。变异的控制是克隆突变序列。然后,转染293 t细胞与指定的结构。Dual-Luciferase记者分析系统(Promega,麦迪逊,WI)是用来测量Renilla和萤火虫荧光素酶的活动。
2.11。统计分析
所有数据都表示为 。单向方差分析(方差分析),后跟一个事后图基的测试是用来比较组间差异。未配对的两组之间的差异进行了分析,双面的学生的测试。一个被认为具有统计显著性值小于0.05。
3所示。结果
3.1。阿霉素降低体内和体外mir - 204水平
调查是否mir - 204与DOX-induced心脏损伤,实时PCR是用来测量mir - 204的水平。mir - 204水平的老鼠用阿霉素治疗显著降低(图1(一))。此外,mir - 204也减少了老鼠的等离子体处理阿霉素(图1 (b))。阿霉素的体外结果显示曝光可以显著减少H9c2 mir - 204的表达细胞(图1 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.2。超表达mir - 204 DOX-Induced减轻炎症反应和细胞凋亡在心肌细胞
然后,我们检查了mir - 204是否会影响DOX-induced心脏损伤。mir - 204超表达是通过使转染H9c2细胞agomir - mir - 204(图2(一个))。我们首先确定了mir - 204对DOX-impaired心肌细胞生存能力的影响,和我们的结果表明,mir - 204超表达的抑制作用可能会阻止阿霉素对细胞的生存能力。促炎细胞因子表达增加DOX-induced心肌细胞(17),而mir - 204超表达封锁了促炎细胞因子表达增加(数据2 (b)和2 (c))。以前的研究证实,细胞凋亡明显增加DOX-induced心肌细胞(17,18]。然后又介绍了细胞凋亡和评估潜在的严重程度在心肌细胞凋亡相关的信号通路。我们的研究结果表明,overexpressing mir - 204明显减少凋亡细胞的比例(图2 (d))。伯灵顿和裂解细胞色素c的表达调节在DOX-treated心与心的控制。相反,bcl - 2的表达明显低于DOX-induced心里控制心灵。然而,overexpressing mir - 204显著减毒伯灵顿表达的增加和细胞色素c和废除bcl - 2表达的减少DOX-treated心(数字2 (e)和2 (f))。这些结果表明,overexpressing mir - 204变弱DOX-induced心肌细胞炎症和细胞凋亡。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。mir - 204超表达DOX-Induced小鼠心脏功能改善
研究mir - 204的作用在阿霉素引起的心肌损伤,mir - 204在老鼠心脏是通过使用AAV超表达。我们的研究结果表明,mir - 204超表达可以减轻体重(BW)和心脏重量(HW)阿霉素引起的损失(图3(一个))。此外,我们发现肺癌的比率的增加体重(LW)胫骨长度(TL)和肺重量的比率下降(LW) TL强力霉素组;然而,这些影响是显著改善DOX-induced mir - 204超表达组(图3 (b))。此外,超声心动图试验进行评估心脏收缩功能的改变;这些测量(左心室舒张末期内径(LVEDd)和LV射血分数(EF))表示,DOX-treated老鼠表现出恶化心脏功能障碍与mir - 204超表达组(图3 (c))。显著下降的最大速度的增加(+ dP / dt)和左心室压力的最大速率降低左心室压力(−dP / dt)观察DOX-treated老鼠,而与mir - 204补充后,显著增加+ dP / dt和−dP / dt(图中被发现3 (d))。血清生化标志物的水平(水平、LDH和cTnI)是有效的临床措施来评估心脏损伤;因此,我们检测了血清生化水平DOX-treated老鼠。我们发现DOX-treated组血清生化水平高于saline-treated组,而mir - 204超表达很大程度上改善这种海拔(图3 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.4。mir - 204抑制炎症反应和细胞凋亡在DOX-Treated老鼠
DOX-treated炎症诱导的小鼠,我们评估了mir - 204对炎症的影响。我们的研究结果表明,阿霉素政府TNF的表达明显增加αCD68-labeled巨噬细胞的数量,数量的老鼠心脏CD45-labeled白细胞浸润,而mir - 204超表达显著减弱这些DOX-induced增加(数据4(一)- - - - - -4 (c))。然后又介绍了心肌细胞凋亡和潜在的严重程度与细胞凋亡相关的信号通路。mir - 204超表达显著降低DOX-induced心肌细胞凋亡,TUNEL分析证实了心脏的部分(数据4 (d)和4 (e))。
(一)
(b)
(c)
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(e)
(f)
(g)
bcl - 2的表达明显下降的老鼠心脏使用阿霉素治疗,而伯灵顿的表达和细胞色素c在DOX-treated鼠标调节心。然而,mir - 204超表达显著改善bcl - 2的表达和减毒水平的提高阿霉素引起的伯灵顿和裂解细胞色素c(数字4 (f)和4 (g))。
3.5。mir - 204超表达缓解DOX-Induced自噬
阿霉素可引起心肌细胞自噬,这是主要的机制DOX-induced毒性(19]。因此,mir - 204的影响评估。如数据所示5(一个)- - - - - -5 (d),mir - 204超表达减毒的减少p62表达阿霉素诱导的老鼠心脏和心肌细胞。此外,autophagy-related基因表达(Atg5和Atg12)和LC3II /我比显著增加DOX-induced心和DOX-stimulated心肌细胞;然而,overexpressing mir - 204逆转这些影响。心肌细胞接受了免疫荧光染色的LC3(绿色)检测mir - 204对自噬的影响。我们的研究结果表明,阿霉素治疗增加了自噬泡形成原子核,而mir - 204的超表达显著减弱DOX-induced效应(图5 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.6。mir - 204目标中HMGB1 DOX-Induced心脏损伤
接下来,我们探讨了mir - 204的确切机制防止DOX-induced心脏损伤。mir - 204的假定的目标中,我们专注于高机动组框1 (HMGB1),据报道,调节心脏损伤诱导的阿霉素(20.]。如图5(一个),RNA序列比对表明,3 - - - - - -UTR HMGB1的mRNA的种子区域包含一个互补的站点mir - 204(图6(一))。来验证这个预测,野生型或突变HMGB1在mir - 204结合位点克隆到一个荧光素酶报告质粒,然后转染成H9c2细胞。我们的研究结果表明,mir - 204超表达可以抑制HMGB1-WT的活动,而活动的HMGB1-MUT并未改变与增加mir - 204(图的表达式6 (b)),表明HMGB1的直接交互和mir - 204。然后我们评估是否HMGB1蛋白表达水平改变后心肌细胞在体内和体外阿霉素治疗。免疫印迹分析的经验显示,与对照组相比,DOX-treated集团展出HMGB1蛋白表达水平明显增加,减毒的mir - 204超表达(数字6 (c)和6 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.7。HMGB1过度废除mir - 204的抗炎和抗凋亡的影响
进一步澄清HMGB1 mir - 204的目标是否DOX-induced心脏损伤,然后我们决定是否HMGB1过度可能废除mir - 204的保护作用。与Ad-HMGB1 H9c2细胞转染诱导HMGB1的超表达(图7(一))。转导后,TNF -的信使rna表达水平α、il - 1和il - 6显示,mir - 204超表达可以抑制DOX-induced炎症体外,HMGB1和mir - 204失去了抗炎效果超表达(图7 (b))。TUNEL染色和LDH结果表明,mir - 204能够缓解DOX-induced细胞体外损失,同时高表达的HMGB1几乎完全抵消的凋亡效应mir - 204(数据7 (c)- - - - - -7 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.8。HMGB1过度废除mir - 204 -介导的自噬抑制
为了进一步验证机制,我们测量了mir - 204与Ad-HMGB1介导的自噬抑制治疗后。结果表明,overexpressing mir - 204改善p62水平下降和增加LC3II /我比阿霉素引起的,而overexpressing HMGB1几乎完全抵消mir - 204(数据的影响8(一个)和8 (b))。免疫荧光染色LC3进一步表明,HMGB1超表达几乎完全抵消mir - 204 -介导的自噬抑制H9c2细胞(图8 (c))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
在这项研究中,我们审查的影响mir - 204在DOX-induced心肌损伤小鼠毒性模型。我们发现mir - 204的超表达可以减少DOX-induced心肌损伤和改善小鼠的心脏功能。我们进一步发现mir - 204规范HMGB1通路对心肌损伤的保护。此外,我们发现mir - 204补充的保护作用,抵消了过度HMGB1的老鼠。总之,我们的研究表明,mir - 204的补充可以提供保护作用对DOX-induced毒性通过抑制HMGB1通路。
在过去的几十年里,已经有越来越多的兴趣在心血管疾病研究microrna的角色。许多microrna,包括miR-21 miR-29b, mir - 378,参与DOX-induced心脏损伤(16,21,22]。mir - 204的作用在许多疾病被广为研究;然而,现在还不知道是否参与DOX-induced mir - 204心脏损伤。首先,目前的研究表明,mir - 204的表达水平是减少DOX-treated心,和改变mir - 204表达阿霉素治疗后建议mir - 204可能DOX-induced心脏损伤中发挥重要作用。DOX-induced毒性的特点是增加血清心肌毒性的生物标记物的活动,身体减肥,左心室功能障碍(17- - - - - -19]。本研究建议阿霉素政府可以引起严重的左心室功能障碍。此外,心肌毒性的增加血清生物标记表明心肌细胞细胞膜完整性的损失,这些结果与之前的研究结果一致。有趣的是,我们发现mir - 204的超表达改善所有DOX-induced心肌毒性,就是明证心脏损害和功能障碍的改善和降低cardiotoxic生物标记。
先前的研究已经表明,心肌炎性细胞因子被激活在DOX-induced毒性和心脏功能改善的减轻炎性细胞因子(17,23]。在目前的研究中,DOX-induced心肌毒性诱导促炎细胞因子的明显增加;然而,mir - 204超表达这些炎症反应明显减轻。我们的结果似乎是一致的与李et al .,那些报道,mir - 204起到了保护作用在人类的小梁网细胞通过抑制炎症(24]。
有越来越多的证据表明,细胞程序性死亡(包括细胞凋亡和自噬,是DOX-induced心脏损伤的一个重要原因12,25]。因此,抑制DOX-induced细胞凋亡和自噬可能是一个新的治疗策略以减少DOX-induced心脏损伤。在我们的研究中,我们发现,伯灵顿,细胞色素c的表达减少,和bcl - 2蛋白的表达增加阿霉素治疗后。然而,mir - 204超表达恢复细胞色素c的变化活动,伯灵顿,bcl - 2阿霉素引起的。研究表明,抑制自噬可能减弱DOX-induced毒性(26]。在目前的研究中,我们发现LC3的表达,ATG5, ATG12增加阿霉素治疗但有效地抑制了mir - 204超表达。这些结果表明,mir - 204超表达产生抑制性影响DOX-induced细胞凋亡和自噬。
自噬是一个self-degradative过程。低水平的本构自噬具有重要作用的正常营业额蛋白质和细胞器。自噬是一种cytoprotective机制似乎对细胞死亡。然而,自噬也可能成为有害的和促进细胞死亡在特定条件下(27]。自噬在DOX-induced心肌损伤的作用已经被广泛讨论。Zilinyi报道,自噬在DOX-induced受损心脏损伤,和恢复自噬可能增加心肌细胞存活率(28]。你们等人表明DOX-induced心脏损伤与自噬小体的水平增加了透射电子显微图(29日]。在这项研究中,我们发现,自噬水平增加老鼠心脏和H9c2细胞接受阿霉素和mir - 204产生保护作用,抑制自噬。
众所周知,microrna发挥其生物学功能通过绑定3 - - - - - -UTR目标基因(21]。在我们的研究中,我们证实,mir - 204直接绑定到3 - - - - - -UTR HMGB1。HMGB1 DNA-bound核蛋白质刺激和被动释放的细胞因子刺激细胞损伤和死亡。先前的研究表明,HMGB1扮演着重要的角色在心血管疾病的发展30.]。姚等人发现,HMGB1参与DOX-induced心肌细胞凋亡和心功能不全,和抑制HMGB1可能缓解DOX-induced心肌病(20.]。此外,HMGB1可能直接与Beclin1 ATG5和块calpain-mediated乳沟在炎症,从而维护proautophagic函数(27]。在这项研究中,我们表明,HMGB1的表达增加阿霉素治疗后,虽然HMGB1的水平减少了mir - 204补充体内和体外。此外,救助实验表明,HMGB1补充废除mir - 204的保护作用DOX-induced心脏损伤,表明mir - 204部分通过调节HMGB1通路发挥心肌保护。李等人报道,等离子体mir - 204表达在儿童先天性心脏病肺动脉高压与肺动脉高压程度负相关,mir - 204表达的可能是一个指标严重肺动脉高压(31日]。这个结果与我们的研究结果不一致,mir - 204是一种保护性因素在DOX-induced心脏损伤。不同的疾病和潜在机制导致肺动脉高压(持续过载)可以负责这些不一致的结果。
5。结论
总之,本研究证实,mir - 204改善心脏功能和抑制炎症、心肌细胞凋亡和自噬在一定程度上通过调节HMGB1通路DOX-induced毒性模型。我们认为,新发现mir - 204 / HMGB1轴可能会提供一个研究策略为研究化疗药物引起的潜在毒性的分子机制。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
伦理批准
所有的程序都按照美国国立卫生研究院的指导的护理和使用实验室动物和动物保健和使用委员会批准郑州大学第一附属医院。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
鲁伊姚明和呦呦Du导致的概念和设计实验;鲁伊姚明,呦呦Du,广绘刘进行实验;鲁伊姚明和呦呦Du分析实验结果。鲁伊姚明和Luosha赵写和修改了手稿。