香草醛酸通过抑制氧化应激减轻急性心肌缺氧/复氧损伤

摘要

氧化应激是心肌缺氧/复氧(H/R)损伤的重要因素。我们的研究重点是如何通过天然植物提取物来减少氧化应激引起的心脏毒性。香草酸(vanilic acid, VA)是一种酚类化合物，存在于食用植物中，富含于植物的根部当归实验研究证明该化合物对心血管疾病有效;然而，其机制尚不清楚。本研究探讨VA对H9c2细胞H/R损伤保护作用的分子机制。结果表明，VA预处理可显著提高细胞活力，降低细胞凋亡百分率，降低上清中乳酸脱氢酶和肌酸磷酸激酶活性，降低活性氧水平，降低caspase-3活性。VA预处理也能恢复线粒体膜电位。此外，VA预孵育显著降低线粒体通透性过渡孔活性。VA给药上调腺苷单磷酸活化蛋白激酶α2 (AMPKα2） 蛋白质表达，有趣的是，AMPK预处理α2-siRNA慢病毒可有效减弱VA对H/R损伤的心脏保护作用。

1.导言

心肌缺氧/复氧（H/R）损伤导致显著的发病率和死亡率[1]，而氧化应激是引起心脏毒性的最重要因素之一。天然植物提取物具有副作用少、易获得的优点。因此，我们的研究重点是利用天然植物提取物保护心脏免受氧化应激，从而降低I/R损伤引起的心脏毒性cid（VA）是一种酚类化合物，存在于分子式为C的次生植物产品中₈H₈O₄．VA在食品工业中作为调味剂、食品添加剂和防腐剂被广泛应用。我们在各种食物中检测到VA，如草药、茶、咖啡、葡萄酒和啤酒[2- - - - - -7]VA具有强大的抗氧化功能、抗低血压作用、心脏保护作用、肝脏保护作用和抗凋亡活性[8- - - - - -11]．

腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）是一种应激反应性激酶，可调节多种生理和代谢途径，包括细胞凋亡、能量动态平衡和细胞代谢[12]AMPK改善细胞抗氧化酶系统，如锰超氧化物歧化酶（Mn SOD）和过氧化氢酶，从而减少氧化剂诱导的损伤[13]．

因此，我们假设VA对缺氧/复氧（H/R）损伤具有保护作用，这可能与AMPK信号通路有关。因此，本研究旨在解决以下目标：（1）确定VA预处理是否保护H9c2细胞免受缺氧/复氧（H/R）损伤和（2）探讨VA对H9c2细胞缺氧/复氧（H/R）损伤的保护机制。

2.材料和方法

2．1．试剂

VA（纯度：>98%）购自西格玛化学公司（美国密苏里州圣路易斯市）α2-siRNA慢病毒购自Genechem Co.（中国上海）。

2.2.细胞培养

从中国科学院细胞库购买胚胎大鼠心脏来源的H9c2细胞。H9c2细胞在37°C的温度下，在5%的CO₂培养箱（Forma）™ 310，美国赛默飞世尔），含高糖（4.5 g/l葡萄糖）DMEM（Solarbio，中国北京），通过添加13%的FBS（胎牛血清，加拿大WISENT）和抗生素（100 U/ml青霉素和100 μ建立缺氧/复氧（H/R）细胞模型，模拟体外缺血/再灌注（I/R）模型[14- - - - - -17]．简单地说，经不同预处理后，H9c2细胞在低氧溶液(乳酸钠40mm, NaH)中培养₂人事军官₄0.9 嗯，那科_3.6. 嗯，MgSO₄1.2 嗯，HEPES 20 嗯，CaCl₂1.8 毫米，氯化钠98.5 嗯，KCl10 mM，pH 6.8），并在37°C下与5%的CO孵育₂和0.1%啊₂在低氧舱(Proox型号C21, BioSpherix Ltd.， USA)中保存3小时。H9c2细胞在再氧溶液(葡萄糖5.5 mM, NaH)中培养₂人事军官₄0.9 嗯，那科_3.20 嗯，MgSO₄1.2 嗯，HEPES 20 嗯，CaCl₂1.8 嗯，129.5 嗯,KCl五 在37°C和95%O下培养₂/5%公司₂在复氧室中放置2小时 h、 所有实验均一式三份进行。

2.3.实验方案

将培养的H9c2细胞随机分为以下实验组:（1）对照组由H9c2细胞组成，在95%空气和5% CO的常氧条件下维持₂在完整的培养基中5小时（2）H/R组包括第节中描述的条件2.2（3)VA+H/R组包括经1.00预处理的H9c2细胞 毫米VA 24 h/R治疗前(4)VA+NC+H/R组为H/R处理前24 H经1.00 mM VA预处理的H9c2细胞，H/R处理前48 H慢病毒阴性(5)VA+AMPKα2-siRNA+H/R组包括经1.00预处理的H9c2细胞 毫米VA 24 h/R治疗前和慢病毒AMPK治疗前αh /R处理前48小时2-siRNA

２.４.细胞生存能力分析

使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H四氮唑（MTS）试剂盒测定H9c2细胞的活力。MTS（Promega，USA）在与活细胞孵育时产生深蓝色的福尔马赞产物。H9c2细胞被胰蛋白酶化、计数并接种在96孔板中，密度为 培养和不同处理后，H9c2细胞用20 μl MTS（5 100毫克/毫升） μl培养基37°C孵育2小时。2 h后，使用Bio-Rad 680，美国的酶标仪在490 nm波长下测定每个孔的光密度(OD)。H9c2细胞存活率显示为对照细胞的百分比。

2.5. LDH和CPK活性的评估

根据制造商的说明，使用乳酸脱氢酶（LDH）和磷酸肌酸激酶（CPK）商业分析试剂盒（中国南京建成生物工程研究所）测定乳酸脱氢酶（LDH）和磷酸肌酸激酶（CPK）活性[18]在不同处理后收集H9c2细胞上清液，并在440波长下测定光密度（OD） 纳米和660 nm使用微孔板读取器（美国Bio-Rad 680）分别测量LDH和CPK活性。

2.6.蛋白质印迹分析

用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗H9c2细胞三次，然后用放射免疫沉淀法（RIPA）和苯甲磺酰氟（PMSF）缓冲液在冰上溶解10分钟 为了去除不溶性物质，提取物在12000℃下离心 每分钟15转 随后使用Bradford蛋白质分析试剂盒（Beyotime，中国上海）测量总蛋白质含量。使用凝胶装置（Bio-Rad，美国）在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上对等量的蛋白质进行电泳。根据预先染色的双色蛋白质分子量标记切割凝胶，然后转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜（中国北京Solarbio），该膜用5%脱脂乳在TBST（Tris缓冲盐水，0.25%吐温-20）中封闭2小时 H用抗体（1）孵育膜 : 500稀释）用于AMPKα2 (Abcam，美国)和β-肌动蛋白（ZSGB-BIO，中国北京）在4°C下过夜。接下来，将膜清洗9次，持续10分钟 在TBST（Tris缓冲盐水，0.25%吐温-20）中各分钟。然后，将膜与HRP标记的IgG二级抗体一起培养AMPKα2（1：5000稀释）（ZSGB-BIO，北京，中国）和β-Actin（1：2000稀释）在室温下摇动2小时。接下来，在TBST中洗涤膜六次六次10分钟。为了检测免疫复合物，使用增强的化学发光（ECL）方法。为了测量蛋白质表达，使用图像实验室软件（Bio-rad，USA）使用密度测定分析。我们使用了靶蛋白的灰度值和相应的β-肌动蛋白蛋白的比例进行量化和统计分析。

2.7.活性氧（ROS）水平的测定

将荧光探针DCFH-DA（2,7-二氯荧光素二乙酸酯）转换为DCFH₂由ROS氧化为DCF。DCF发出可以通过流式细胞术测量的绿色荧光信号。根据制造商的说明使用该测定。收集H9C2细胞并在无血清培养基中孵育，终浓度为10 μM DCFH-DA（凯根生物科技，中国南京）在37°C温度下30分钟 用流式细胞仪（美国贝克曼·库尔特）在488℃测定二氯荧光素（DCF）的荧光强度 525 nm处的激发和散射 nm emission.A.U.是任意单位的缩写。

2.8。测量线粒体膜电位（ ）

JC-1（5,5 ，6、6 -Tetrachloro-1,1. ，3,3 -四乙基苯并咪唑基碳菁碘）是一种染料，当增加。使用JC-1（Keygen Biotech，南京，中国）染色后测量线粒体膜电位。用冰冷的PBS洗涤两次后，收获H9C2细胞并以终浓度为200的JC-1溶液孵育 μ在黑暗中在37℃下进行37℃。通过流式细胞术（Beckman Coulter，USA）在488/630nm（红色）和488/530nm（绿色）的激发和发射波长（Ex / em）下检测荧光。计算为红/绿荧光比。

2.9.Ca²⁺全身的线粒体肿胀

经过不同处理后，使用细胞线粒体分离试剂盒（中国南京凯根生物技术有限公司）提取H9c2细胞线粒体。接下来，用溶胀缓冲液（120）处理纯化的线粒体 毫米KCl，5 mM KH₂人事军官₄，20mm MOP和10 mm Tris-HCl（pH7.4））。使用CA评估MPTP开放级别²⁺-诱导线粒体肿胀试验[19]．后增加200μM CaCl₂对于线粒体，线粒体渗透率过渡孔的开口导致线粒体肿胀，导致线粒体密度稳定下降。由于线粒体能够扩张，使用520nm（Bio-rad 680，USA）的微孔板读卡器记录光密度（OD）。线粒体肿胀被记录为光学密度（OD₁)，第二光密度(OD₂)记录在案的有20人 诱导后最小。光密度为520 在20分钟内连续记录nm 最小mPTP活性计算如下： ．

2.10.半胱天冬酶-3活性的测定

按照制造商的说明，使用Caspase-3活性检测试剂盒(Beyotime，上海，中国)测定Caspase-3活性。将H9c2细胞置于裂解缓冲液中冰敷15分钟，收集并4℃16000g离心15分钟，得到上清液。蛋白浓度测定采用双茚二酮酸(BCA)蛋白检测试剂盒(Beyotime，中国上海)。加入检测缓冲液和Ac-DEVD-рNA, 37℃孵育18 h，在405 nm处检测光密度。用酶标仪(Bio-Rad 680, USA)测定Caspase-3活性。a.u是任意单位的缩写。

2.11.流式细胞术分析细胞凋亡

我们之前发表了测量细胞凋亡的方法[20]简言之，按照制造商的说明，使用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒（中国南京凯根生物科技有限公司）通过流式细胞术评估细胞凋亡。简单地说，收集H9c2细胞并用冰冷的PBS洗涤三次。接下来，将收集的H9c2细胞重新悬浮在1x结合缓冲液中，最终浓度为 细胞/毫升。加5之后μl Annexin V-FITC和5μl PI、H9c2细胞在黑暗中培养15天 通过流式细胞术（ex 488）分析细胞荧光 纳米；em530 nm，贝克曼·库尔特，美国）。

2.12.通过TUNEL染色评估细胞凋亡

采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）染色法（使用TUNEL凋亡检测试剂盒（Promega，USA））通过光学显微镜分析凋亡的H9c2细胞[21].凋亡的H9c2细胞呈棕色染色，鉴定为TUNEL阳性。然后，在显微镜下观察凋亡的H9c2细胞（日本奥林巴斯）。TUNEL阳性的H9c2细胞数/H9c2细胞总数代表凋亡指数。

2.13.统计分析

所有值都显示为 ．ANOVA用于测量不同组间检查数据的显著性，然后进行方差分析事后分析以确定个体差异。值≤0.05被认为是统计学意义的。

3.结果

3.1.VA预处理可改善H/R后H9c2细胞的活力，并降低H9c2细胞中LDH和CPK的水平

为了测量VA对经历缺氧/复氧（H/R）的H9c2细胞的影响，对经不同浓度VA 24预处理的H9c2细胞进行MTS测定 h/R前。h/R后H9c2细胞活力显著降低（图1(一)， 与对照组相比），我们证明VA显著增加了H9c2细胞的活力。不同浓度的VA预处理以浓度依赖的方式逐渐增加H9c2细胞的活力。H9c2细胞活力在1.00时达到峰值 mM VA( 对0.50 mM-VA+H/R组）。然而，经VA浓度高于2.00的预处理的H9c2细胞 mM的细胞活力显著降低，说明较高的VA浓度会导致毒性。因此，1.00 选择mM-VA作为后续实验的最佳预处理浓度。此外，在图中1 (b)，我们的结果表明AMPKα2-siRNA显著降低了细胞活力( 与VA + H / R组））。因此，我们假设VA通过AMPK信号通路保护H9C2细胞来自H / R损伤。

响应于H / R测量H9C2细胞膜的损伤，我们在H / R处理后评估了上清液中LDH和CPK的水平。H / R组中LDH和CPK的水平增加（ 与对照组相比)，VA+H/R组显著降低( 此外，VA+AMPKα2-siRNA+H/R组LDH和CPK水平显著升高( 与VA+H/R组相比（图1 (c)）.

3.2.VA预处理可上调AMPKα2 H9c2细胞H/R蛋白水平

要验证AMPKα2蛋白与观察到的心脏保护活性和VA最佳预处理浓度相关，我们评估AMPK蛋白水平α2通过western blot。我们用不同浓度（0.25,0.50,1.00,2.00,4.00和8.00）预处理H9c2细胞 24小时内的VA（毫米） 图中h/R之前的h2(一个)大多数VA预处理组的AMPK水平上调α2蛋白质相对于对照组和H/R组，以及1.00 mmva+H/R组的AMPK水平最高α2蛋白( 对0.50 mM-VA+H/R组）的最佳预处理浓度与MTS观察到的浓度一致，但AMPK水平α在VA +安培中，2个蛋白质显着降低α2-siRNA+H/R组相对于VA+H/R组( ）(图2（b））.因此，我们的数据表明VA通过上调AMPK对H / R表现出心脏保护作用α2蛋白质水平。

３．３．VA预处理可降低H/R诱导的ROS生成

进行相关实验以使用DCFH-DA荧光探针评估ROS水平。H / R组ROS水平显着增加（ 而VA+H/R组和VA+NC+H/R组的ROS水平显著降低( 与H/R组相比）。正如预期的那样，VA+AMPK中的ROS水平显著增加α2-siRNA + H / R组( 与VA+H/R组和VA+NC+H/R组相比）。这些结果证实，VA减少了与AMPK信号通路相关的ROS生成（图3.）.

3.4.使用VA还原剂进行预处理在暴露于H/R的H9c2细胞中

确定在H / R损伤后的H9C2细胞中，进行JC-1荧光探针测定。我们使用了右上象限和右下象限的荧光比来验证 ．结果表明对H/R的反应下降( (图4）.而VA预处理明显减少了失血量在VA+H/R组( 与H / R组)。相比之下，中断当AMPKα2基因被敲除( 与VA+H/R组相比），证明AMPKα2-siRNA可有效消除VA对H/R损伤的心脏保护作用。

3.5.VA预处理可防止H/R引起的mPTP开放

Ca²⁺- 诱导的线粒体肿胀用于检查VA对MPTP开口的影响。我们通过在一段时间内记录520nm / min（OD / min）的变化的光学密度值来确定MPTP开口的程度。如图所示5，则有显着上升ΔH / R组的OD / min（ 对照组）；然而，用VA预处理H9c2细胞延迟了mPTP开放( 与H / R组)。AMPKα2使用AMPK进行基因敲除α2-siRNA慢病毒通过抑制mPTP开放，消除了VA对H/R损伤的心脏保护作用( 与VA + H / R组））。

3.6.VA预处理减弱对H/R反应的Caspase-3活性

为了检测VA对H/R诱导损伤的心脏保护作用，使用比色法估计了caspase-3活性水平。图6显示H/R组中caspase-3活性显著增加( 而VA预处理显著降低了caspase-3活性( 此外，与先前的结果一致，在VA+AMPK中观察到caspase-3活性显著增加α2-siRNA + H / R组( 与VA + H / R组））。

3.7.VA预处理减少H/R引起的H9c2细胞凋亡

采用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒流式细胞术检测细胞凋亡。如图所示7H9C2细胞凋亡率在H / R组中显着增加（ 与对照组相比），而VA+H/R组则逐渐降低( 此外，VA+AMPK组H9c2细胞凋亡率再次增加α2-siRNA + H / R组( 与VA + H / R组））。

为了进一步证实VA对H/R损伤的心脏保护作用，我们通过光学显微镜对TUNEL阳性H9c2细胞的数量进行评分。如图所示8，H/R导致H/R组TUNEL阳性H9c2细胞数量显著增加( 对照组）。相反，VA预处理H9c2细胞后，TUNEL阳性的H9c2细胞显著减少( 与H/R组相比）。与先前的结果一致，在AMPK后VA的心脏保护作用被取消α2使用AMPK进行基因敲除α2-siRNA慢病毒。

4.讨论

香草酸(vanilic acid, VA)是一种酚类化合物，存在于可食用植物的根部当归VA具有强大的抗氧化功能，并具有心脏保护、抗低血压、抗凋亡和肝保护活性[8- - - - - -11]．实验研究证明了这种化合物对心脏的毒性作用。

在这项研究中，我们发现用1.00预处理的H9c2细胞 毫米VA 24 h/R前h显著增加H9c2细胞的活力，降低LDH和CPK水平。我们的数据进一步证实VA预处理可以抑制心肌细胞凋亡，保护心肌细胞免受H/R损伤。

VA的心脏保护作用已被广泛研究，其潜在机制可能与对抗能量代谢失衡引起的氧化应激有关，但其机制仍有待充分阐明。AMPK在能量平衡动力学中起着重要作用，与多种疾病有关[22].包括我们小组的研究表明，AMPK除了作为能量传感器和调节器的传统作用外，还可能是一种氧化应激传感器和氧化还原调节器[23，24]．此外，据信AMPK活化增强了细胞抗氧化能力[25，26]这些发现都使我们假设VA通过AMPK信号通路介导的抗氧化应激保护H9c2细胞免受H/R损伤。因此，我们试图检测AMPK的表达水平α2在治疗H9c2抗H/R损伤时用不同浓度的香草醛酸，发现AMPK的表达水平有变化趋势α2与香草醛酸抗H/R损伤的浓度趋势一致，如图所示1(一)和2(一个)．h /R前24 h用1.00 mM VA预处理的H9c2细胞AMPK最高α2蛋白质水平α已知2对缺氧敏感，并且可以通过AMP的增加来激活。一旦H9C2细胞受到H / R损伤，它们就不可避免地增加了AMPK的表达α2蛋白作为应急响应。但是，AMPK的增加αH/R损伤诱导的蛋白质水平非常有限，没有保护作用。结果表明，香草酸诱导H9c2细胞产生大量AMPKα2蛋白质，对H/R损伤起保护作用（图1和2)因此，在接下来的研究中，我们关注VA对H/R损伤的保护作用是否与AMPK有关α2.

要验证AMPKα2蛋白与香草酸诱导的心脏保护活性相关，我们使用AMPK的敲低α近年来，许多siRNA已成功应用于实验模型[27- - - - - -29].我们特别禁止AMPKα2通过RNA干扰表达，通过将双链RNA分子导入细胞选择性沉默基因表达，western blot分析显示目的蛋白AMPK表达α2可以减少，如图所示2（b）．一次AMPK的表达α2被抑制，香草醛酸预处理对H9c2细胞H/R损伤的保护作用被消除。这些发现证实VA诱导的H/R心脏保护作用与AMPK有关α2信号通路。

由于缺氧/复氧，电子传递链损伤导致线粒体ROS的产生和氧化应激损伤[30]．ROS爆发导致mPTP打开并触发细胞能量信号以应对ATP耗尽和离子动态平衡的改变，最终导致质膜破裂和细胞死亡[31，32]已经证明，mPTP是不同预处理保护机制中的中心因素，mPTP开放被认为是中间再灌注损伤中的重要因素[33].H9c2细胞暴露于H/R损伤后，表现出ROS的产生增加、mPTP的开放和细胞凋亡的丧失 ．相反，VA预处理减弱了活性氧的产生、mPTP的开放和活性氧的损失 ．

氧化应激损伤导致细胞凋亡信号级联[34]Caspase-3是线粒体介导的凋亡途径中的关键效应因子之一。结果表明，H/R损伤后caspase-3活性增加。相反，VA预处理减弱了这种影响。此外，VA预处理显著降低了H9c2细胞H/R损伤后的凋亡。为了进一步验证VA对H/R诱导的损伤的保护作用，采用两种方法检测细胞凋亡。流式细胞术和TUNEL的凋亡结果一致，表明VA对H/R暴露的H9c2细胞具有明显的保护作用。值得注意的是，VA对AMPK的保护作用消失α2下调。

我们的研究已经证明，VA通过减少ROS的产生、稳定线粒体膜电位、限制mPTP的开放、降低caspase-3活性并最终抑制心肌细胞凋亡来保护H9c2细胞免受H/R诱导的损伤。此外，所有保护作用都被AMPK的敲除所消除α2-siRNA。因此，我们的研究结果证实了va对H/R损伤的心脏保护作用与AMPK相关α2蛋白质。

数据可用性

感兴趣的读者可以使用我们的算法重现我们的结果。

利益冲突

作者报告没有利益冲突。

作者的贡献

姚秀雅和焦守峰对这项工作贡献相当。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（81460551, 81760587, 81460371、81760731）、南昌大学研究生创新专项基金（CX201699）、中国江西省科技支撑和社会发展项目（2010BSA13900）的资助。

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