VA(纯度:> 98%)从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。AMPK的 α2-siRNA慢病毒是购自Genechem有限公司(上海,中国)。

胚胎鼠heart-derived H9c2细胞购自中国科学院细胞库。H9c2在37°C细胞孵化有限公司5%₂美国热费希尔孵化器(形式™310)高葡萄糖(4.5 g / l的葡萄糖)DMEM (Solarbio,北京)通过添加13%的边后卫(胎牛血清,写到,加拿大)和抗生素青霉素(100 U /毫升和100年 μg / ml链霉素,Solarbio,北京)。缺氧/复氧(H / R)细胞模型建立模仿一个动脉缺血/再灌注(I / R)模型体外( 14- - - - - - 17]。简单,不同的预处理后,H9c2细胞在缺氧培养的解决方案(乳酸钠40毫米,不₂阿宝₄0.9毫米,NaHCO₃6毫米,MgSO₄1.2毫米,消息灵通的20毫米,CaCl₂98.5毫米1.8毫米,氯化钠,氯化钾10 mM, pH值6.8)和孵化37°C公司为5%₂和0.1%啊₂在低氧室(美国Proox模型C21 BioSpherix Ltd .) 3 h。H9c2细胞随后再氧化溶液中培养(葡萄糖5.5毫米,不₂阿宝₄0.9毫米,NaHCO₃20毫米,MgSO₄1.2毫米,消息灵通的20毫米,CaCl₂129.5毫米1.8毫米,氯化钠,氯化钾5毫米,pH值7.4)和孵化37°C和95% O₂/ 5%股份有限公司₂在一个复氧室2 h。所有实验进行了一式三份。

培养H9c2细胞随机分为以下实验组: (1)

对照组由H9c2细胞保持在常氧条件下有95%的空气和5%的有限公司₂在完全培养基5 h

H9c2细胞的生存能力是决定使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium (MTS)工具包。美国MTS (Promega)产生一个深蓝色甲瓒产品孵化时活细胞。H9c2细胞使胰蛋白酶化、计算和播种密度在96 -孔板 1 × 10 4 细胞每口井。孵化和不同的治疗后,H9c2细胞治疗20 μl MTS 100年(5毫克/毫升) μ2 h l媒介在37°C。2 h后,光密度(OD)的每一个决定在490 nm波长使用标仪(美国Bio-Rad 680)。H9c2细胞生存能力的比例控制指示。

乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸磷酸激酶(CPK)活性测定用LDH和肌酸磷酸激酶商业测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国)根据制造商的指示 18]。H9c2细胞上清液收集后不同的治疗方法,光密度(OD)决定在波长440 nm和660 nm)来衡量LDH和肌酸磷酸激酶活动,分别使用一个微型板块读者(美国Bio-Rad 680)。

H9c2细胞被洗使用冷磷酸盐(PBS)的三倍,其次是裂解与无线电免疫沉淀反应试验(里帕)和氟化phenylmethanesulfonyl (PMSF)缓冲区在冰上10分钟。除去不溶性物质,提取离心机在12000 rpm 15分钟在4°C。总蛋白质含量随后用布拉德福德蛋白质分析工具包(Beyotime、上海、中国)。等量的蛋白质产物以10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)使用凝胶装置(美国Bio-Rad)。根据prestained凝胶被削减,双颜色蛋白质分子量标记之后,转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Solarbio,北京),被封锁在TBST 5%脱脂牛奶(三羟甲基氨基甲烷缓冲液生理盐水、0.25% Tween-20) 2 h。膜是孵化AMPK抗体(1:500稀释) α2(美国Abcam)和 β肌动蛋白(ZSGB-BIO,北京)一夜之间在4°C。接下来,膜在TBST九次冲洗10分钟(三羟甲基氨基甲烷缓冲液生理盐水、0.25% Tween-20)。然后,膜与HRP-labelled孵化免疫球蛋白AMPK二级抗体 α2(1:5000稀释)(ZSGB-BIO,北京) β肌动蛋白(1:2000稀释)用颤抖的在室温下2 h。接下来,膜被洗了6次TBST各10分钟。检测免疫复合物,增强化学发光(ECL)方法。测量蛋白表达,微密度分析采用使用图像实验室软件(美国Bio-Rad)。我们使用目标的灰度值之比蛋白质和相应的beta-actin量化和统计分析。

二乙酸7-dichlorofluorescein荧光探针DCFH-DA(2)被转换为DCFH₂这是氧化DCF ROS。DCF发出绿色荧光信号,通过流式细胞仪可以测量。这个试验是根据制造商的指示使用。H9c2细胞无血清培养系统收集和孵化的最终浓度10 μM DCFH-DA(南京凯基生物生物技术,中国)37°C在黑暗中30分钟。荧光强度dichlorofluorescin (DCF)是衡量流式细胞仪(美国贝克曼库尔特)在488 nm励磁和525海里排放。运算器是任意单位的缩写。

JC-1 (5 5 ′ 6个6 ′ -tetrachloro-1 1 ′ 、3、3 ′ -tetraethylbenzimidazolo carbocyanine碘)是一个改变颜色从绿色到红色的染料 Δ ψ 米 增加。线粒体膜电位测量使用JC-1(南京凯基生物生物技术,中国)染色后,制造商的指示。与冰冷的PBS洗两次后,H9c2细胞收获和孵化JC-1解决方案在200年最终的浓度 μ在37°C M在黑暗中20分钟。荧光是由流式细胞术检测(美国贝克曼库尔特)激发和发射波长(例/ em) 488/630(红色)和488/530 nm(绿色)。 Δ ψ 米 被计算为红/绿荧光比率。

不同的治疗后,H9c2细胞线粒体提取使用细胞线粒体隔离设备(南京凯基生物生物技术,中国)。接下来,纯化的线粒体肿胀处理缓冲区(120毫米氯化钾,KH 5毫米₂阿宝₄,20毫米拖把,10毫米Tris-HCl (pH值7.4))。注射的mPTP药物使用Ca开放水平评估^{2 +}全身的线粒体肿胀试验( 19]。后增加200 μM CaCl₂线粒体,线粒体渗透性转换孔开放导致线粒体肿胀导致线粒体光密度稳定下降。由于线粒体扩张的能力,光密度(OD)使用标被记录在520海里(680年Bio-Rad,美国)。线粒体肿胀被记录作为光密度(OD₁在520纳米),第二个光密度(OD₂)是记录20分钟后归纳。520纳米的光密度是不断记录超过20分钟。mPTP活动计算 Δ OD O D 1 - - - - - - O D 2 / 最小值 × 1000年 。

Caspase-3活动测量使用Caspase-3活动分析工具包(Beyotime、上海、中国)后,制造商的指示。H9c2细胞细胞溶解在冰上裂解缓冲了15分钟,然后收集和离心机在4°C 16000克15分钟得到上层清液。蛋白质浓度测定使用bicinchoninic酸(BCA)蛋白质分析工具包(Beyotime、上海、中国)。添加检测缓冲区和Ac-DEVD-рNA和孵化后37°C 18 h,光密度检测在405海里。Caspase-3活动测量使用标仪(美国Bio-Rad 680)。运算器是任意单位的缩写。

我们以前公布的方法来测量细胞凋亡 20.]。短暂,凋亡的评估是通过流式细胞术使用膜联蛋白V-FITC /π凋亡工具包(南京凯基生物生物技术,中国)后,制造商的指示。短暂,H9c2细胞收集,用冰冷的PBS洗了三次。接下来,收集H9c2细胞resuspended在1 x绑定缓冲的最终浓度 5 × 10 5 细胞/毫升。后的5 μl膜联蛋白V-FITC和5 μlπ,H9c2细胞孵化在黑暗中在室温下15分钟。分析了细胞荧光流式细胞术(前488海里;美国贝克曼库尔特em 530海里)。

细胞凋亡H9c2分析通过光学显微镜使用终端原位尼克结束标签(TUNEL)染色法,这是使用TUNEL细胞凋亡检测工具执行(美国Promega) [ 21]。布朗凋亡H9c2细胞染色,确定TUNEL阳性。然后,细胞凋亡H9c2随后被观察到在显微镜(日本奥林巴斯)。的数量TUNEL-positive H9c2细胞/ H9c2细胞的总数代表凋亡指数。

所有值的 的意思是 ± 扫描电镜 。方差分析应用于测量检查数据在不同组的意义,紧随其后 事后分析来确定个体差异。 p 值≤0.05被认为是具有统计学意义。

测量的影响VA H9c2细胞处于缺氧/复氧(H / R), MTS试验进行H9c2细胞,用不同浓度的预处理VA H / R前24小时。H9c2细胞生存能力下降明显针对H / R(图 1(一), p < 0.01 比对照组)。我们证明了VA显著增加H9c2细胞生存能力。弗吉尼亚州预处理与不同浓度的逐渐增加H9c2细胞浓度的方式的可行性。弗吉尼亚州H9c2细胞生存能力达到峰值1.00毫米( p < 0.05 与0.50毫米VA + H / R组)。然而,弗吉尼亚州H9c2细胞使用的浓度高于2.00毫米表现出显著减少细胞生存能力,说明高VA含量造成毒性。因此,弗吉尼亚州1.00毫米被选为最优预处理浓度为后续实验。此外,在图 1 (b),我们的结果表明,AMPK α2-siRNA引起显著降低细胞生存能力 p < 0.05 与VA + H / R组)。因此,我们假设VA保护H9c2细胞H / R损伤通过AMPK信号通路。

测量损伤细胞膜H9c2 H / R,我们评估后上层清液LDH水平和肌酸磷酸激酶的H / R治疗。LDH和肌酸磷酸激酶的水平增加了H / R组( p < 0.01 比对照组),显著降低在VA + H / R组( p < 0.01 与H / R组)。此外,VA + AMPK α2-siRNA + H / R组显著增加的LDH水平和肌酸磷酸激酶( p < 0.01 与VA + H / R组)(图 1 (c))。

来验证是否AMPK α2蛋白与观察心血管活动和最佳预处理浓度VA,我们评估蛋白质的AMPK水平 α2通过免疫印迹。我们H9c2预处理细胞与不同浓度(0.25,0.50,1.00,2.00,4.00,和8.00毫米)的VA 24 h在h / R。在图 2(一个),大多数VA-pretreated组调节水平的AMPK展出 α2蛋白相对于那些控制和H / R组,和1.00毫米VA + H / R组表现出AMPK的最高水平 α2蛋白( p < 0.05 与0.50毫米VA + H / R组)。观察到的最佳预处理浓度符合MTS。然而,AMPK水平 α2蛋白在弗吉尼亚州+ AMPK明显减少 α2-siRNA + H / R组相对于那些在弗吉尼亚州+ H / R组( p < 0.01 )(图 2 (b))。因此,我们的数据表明,VA展品心血管效应对移植AMPK H / R α2蛋白质含量。

相关实验进行评估ROS水平使用DCFH-DA荧光探针。ROS水平显著增加H / R组( p < 0.01 与对照组),而有一个显著的减少ROS水平+ H / R和VA + NC + H / R组( p < 0.01 与H / R组)。正如所料,VA + AMPK ROS水平显著提高 α2-siRNA + H / R组( p < 0.01 与+ H / R组和VA + NC + H / R组)。这些结果证实,VA减少ROS生成与AMPK信号通路(图 3)。

来确定 Δ ψ 米 在H9c2细胞H / R损伤后,JC-1荧光探针测定。我们使用的荧光比率右上象限,右下象限来验证 Δ ψ 米 。结果表明, Δ ψ 米 减少对H / R ( p < 0.01 与对照组(图) 4)。然而,与VA预处理明显下降的损失 Δ ψ 米 在弗吉尼亚州+ H / R组( p < 0.01 与H / R组)。相比之下,一个中断 Δ ψ 米 观察时,AMPK吗 α2基因被撞倒了 p < 0.01 与VA + H / R组),证明AMPK α2-siRNA有效废除VA的心血管效应与H / R损伤。

Ca^{2 +}全身的线粒体肿胀被用来检查注射VA对mPTP药物的影响。我们确定注射的程度mPTP药物打开通过记录不同的光密度值在520 nm /分钟(OD /分钟)在一段时间内。如图 5,有一个显著增加 ΔH / R组OD /分钟( p < 0.01 与对照组);然而,与VA注射延迟mPTP药物预处理H9c2细胞打开( p < 0.01 与H / R组)。AMPK α2基因使用AMPK击倒 α2-siRNA慢病毒废除VA对H / R损伤的心血管效应对注射抑制mPTP药物打开( p < 0.05 与VA + H / R组)。

检查心血管效应的VA H / R-induced受伤,caspase-3活动水平估计使用比色法。图 6显示了一个显著增加caspase-3活动H / R组( p < 0.01 与对照组),但VA预处理明显减少caspase-3活动( p < 0.01 与H / R组)。此外,与以前的结果一致,显著增加caspase-3 VA + AMPK观察活动 α2-siRNA + H / R组( p < 0.01 与VA + H / R组)。

凋亡的评估是通过流式细胞术使用膜联蛋白V-FITC /π凋亡工具包。如图 7,H9c2细胞凋亡率显著增加H / R组( p < 0.01 与对照组),而逐步减少在VA + H / R组( p < 0.01 与H / R组)。此外,H9c2细胞凋亡率在弗吉尼亚州+ AMPK再次增加 α2-siRNA + H / R组( p < 0.01 与VA + H / R组)。

进一步证实VA-induced保护作用与H / R损伤,我们得分的数量TUNEL-positive H9c2细胞通过光学显微镜。如图 8H / R造成的数量显著增加TUNEL-positive H9c2细胞H / R组( p < 0.01 比对照组)。相比之下,H9c2细胞的预处理与VA导致显著降低TUNEL-positive H9c2细胞( p < 0.01 与H / R组)。与以前的研究结果一致,VA后被废除AMPK的心血管效应 α2基因使用AMPK击倒 α2-siRNA慢病毒。