Hypoxia-Reoxygenation的影响在鼠标数字屈肌Tendon-Derived细胞

文摘

客观的。缺血再灌注损伤是指造成的恶化和不可逆转的组织损伤修复缺血后血流量。体外hypoxia-reoxygenation (H / R)模型是适合在细胞水平上研究缺血再灌注损伤。我们使用这个模型,研究氯化钴(CoCl的影响₂-)细胞中诱导H / R源自鼠标指屈肌腱。材料和方法。各种H / R条件模拟通过治疗CoCl tendon-derived细胞与不同浓度的₂24 h,删除CoCl紧随其后₂恢复正常氧状态96 h。细胞生存能力是衡量使用细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定。细胞生长决心通过观察细胞形态和增殖。氧化应激标记和检测线粒体活动。的表达水平低氧诱导因子(HIF) 1α,血管内皮生长因子a (VEGF-A),胶原蛋白,第三和胶原蛋白测定采用免疫印迹(WB),实时PCR和免疫荧光染色。通过流式细胞仪分析细胞凋亡,伯灵顿apoptosis-related蛋白质的表达和bcl - 2使用白平衡检查。结果。CoCl的细胞处理低浓度₂复氧后显示显著增加细胞生存能力。细胞生存能力的增加更明显的细胞被高浓度的CoCl处理₂。在H / R条件下,细胞形态和生长持平,而氧化应激反应是诱发和线粒体活动增加。H / R施加HIF-1的表达相反的影响α信使rna和蛋白质。同时,VEGF-A表达的调节,而胶原蛋白I型和III型明显下调。细胞凋亡的程度没有显著变化在H / R,尽管显著增加伯灵顿蛋白质和bcl - 2蛋白水平降低,导致增加伯灵顿/ bcl - 2比例在再氧化。结论。Tendon-derived细胞高度宽容CoCl引起的低氧环境₂。缺氧预处理后再氧化促进细胞生存能力,特别是在细胞处理高浓度CoCl₂。H / R条件引起的氧化应激反应,但并不影响细胞生长。H / R对胶原蛋白生产过程有一个显著的影响和表达tendon-derived apoptosis-related蛋白质的细胞,而细胞凋亡水平保持不变。

1。介绍

肌腱损伤经常伴随着缺乏血液供应,使肌腱暴露于低氧条件。氧张力,这是影响血液供应,是至关重要的细胞存活和增殖。体外研究表明,低氧张力提高新生儿的扩张能力猪tenocytes而不影响细胞表型和功能(1)和缺氧条件显著改善细胞增殖和自我更新能力的人类肌腱干细胞(2,3]。然而,其他研究已经表明,缺氧抑制细胞增殖和改变矩阵的合成组件在滑膜组织4]。二氯化钴(CoCl₂-)诱导缺氧已被证明改变bcl - 2家族蛋白的表达和半胱天冬酶级联触发凋亡5,6]。总的来说,冲突的结果在这些研究强调复杂的缺氧对细胞生长的影响。

大多数组织受到缺氧损伤后进行再灌注(7- - - - - -10]。再灌注损伤,由血液flow-deprived和缺氧器官表现吹流修复和组织复氧后,是刺激的组织反应氧化代谢(11- - - - - -15]。组织与再灌注损伤分享的一些特征损伤对缺氧的反应和随后的再氧化,如坏死、凋亡、微血管功能受损和水肿。它已经表明,相当多的血管重建肌腱愈合过程中发生增强灌注(16,17]。斯坦格等人报道相对血容量的变化见顶后7天内原位freezing-induced病变在老鼠髌腱18]。显著均匀hypervascularization发生在慢性跟腱附着点病变手术后的愈合过程tenolysis在兔子17]。增加血管化促进肌腱修复期间再氧化。因此,跟腱受伤后缺血/再灌注过程中,导致hypoxia-reoxygenation (H / R)在细胞水平的变化,提出了一种肌腱复苏的主要障碍(19]。然而,tendon-derived细胞缺氧的敏感性和H / R细胞生长的影响和特点已经很少了。

在这项研究中,我们旨在建立氯化钴(CoCl的体外模型₂-)诱导hypoxia-reoxygenation (H / R)在老鼠数字屈肌tendon-derived细胞和调查H / R的影响这些细胞(20.]。缺氧条件下模拟了治疗与CoCl培养细胞₂,而复氧条件模拟代替CoCl后的培养基₂治疗。CoCl背后的原理₂全身缺氧是铁的替代^{2 +}由有限公司^{2 +}heme-based氧气传感器,防止氧传感器结合氧(21]。与低氧孵化培养细胞相比,模拟缺氧利基化学展览的几个优点,包括简单的CoCl准备₂,灵活调整剂量,治疗悬挂在任何时候,不影响氧气水平细胞需要正常氧张力(22]。更好的控制缺氧的程度,我们决定使用不同的CoCl₂浓度。H / R后,细胞活力、细胞生长、氧化应激标记,HIF-1的线粒体活动和表达α血管内皮生长因子a (VEGF-A),胶原蛋白I,胶原蛋白三世进行评估。细胞凋亡和表达apoptosis-related蛋白质标记伯灵顿和bcl - 2进行了分析。

2。材料和方法

2.1。实验设计

我们首先确认CoCl的成功₂全身缺氧模型通过检查HIF-1的表达α蛋白质CoCl tendon-derived细胞由低浓度处理₂(0.05,0.1,0.2,0.4毫米),根据先前的研究20.,23,24]。接下来,细胞被分成以下组:控制(在普通培养基培养细胞),H(细胞治疗CoCl的浓度梯度₂24 h)、R(细胞CoCl对待₂24 h,其次是在普通培养基培养24小时,48 h, h, 72和96 h (R24h, R48h、R72h R96h))。细胞生存能力是整个控制相比,H,和R组,以及不同浓度的CoCl之一₂。然后,我们确定一个适当的CoCl的浓度₂缺氧模型进行以下实验:细胞生长、氧化应激标记,线粒体活动,HIF-1的信使rna和蛋白质表达αVEGF-A,胶原蛋白I,胶原蛋白三世,细胞凋亡,apoptosis-related蛋白的表达伯灵顿和bcl - 2。

2.2。隔离的老鼠屈肌肌腱细胞和H / R模型

动物程序实验动物管理委员会批准我们的大学。所有动物实验进行了按照《实验动物管理条例》(中国国家科学技术委员会)和指导的护理和使用实验动物(贝塞斯达国立卫生研究院(NIH),医学博士,美国)。Tendon-derived细胞脱离鼠标profundus屈肌腱牵向前(FDP)肌腱(C57BL / 6,女,4周大)。老鼠牺牲颈椎脱位,自民党肌腱的指数,中间,后爪和无名指的收获。肌腱样本用无菌磷酸盐(PBS)洗净,然后切成小块。削减的混合样本消化3毫克/毫升I型胶原酶(Gibco、热费希尔科学、大岛,纽约)和4毫克/毫升dispase (Gibco热费希尔科学)2 h在37°C。通过70年未消化的组织和碎片被过滤μm细胞过滤器(默克密理博、软木、爱尔兰)。滤液中的释放细胞在600 g离心10分钟和resuspended低糖杜尔贝科修改鹰的介质(LG-DMEM;Gibco热费希尔科学)补充10%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。段0时的孤立镀有核细胞(P0)播种密度500细胞/厘米²之前的研究中,确定(25]。细胞培养在37°C公司为5%₂。2天后,细胞被洗两次与PBS移除不依从细胞。10天后,细胞融合95%是通过收集当地胰蛋白酶消化和分裂1:3为后续章节。媒介改变了两次一个星期。在P3细胞用于实验。

2.3。细胞生存能力

96 -孔板的细胞被播种密度5000细胞在DMEM /好和培养。48小时后,不同浓度的CoCl₂(0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.35,和0.4毫米)被添加到细胞24 h。随后,细胞媒体取代常规的DMEM,和细胞培养24小时,48 h, 72 h和96 h。细胞计数Kit-8 (CCK-8;meilunbio,中国)被用来评估细胞的生存能力受到H / R。简单、新鲜培养基含有CCK-8方案添加到96孔板中不同时期的细胞培养。细胞培养1.5 h在37°C。上层清液的吸光度(100μl)是使用自动标仪测量450海里(Bio-Rad)。

2.4。细胞生长

细胞被播种在6-well板在5000个细胞/厘米²在96孔板在5000个细胞/。48小时后,细胞CoCl对待₂(浓度由上图细胞生存能力测量)24 h,随后再氧化24 h, 48 h, 72 h和96 h。细胞的形态变化6-well板H / R治疗前后相差显微镜下观察(奥林巴斯IX71)。96孔板的细胞收获用0.05%胰蛋白酶(表达载体)的解决方案,和细胞生长曲线施工人数统计H / R之前和之后的治疗。

2.5。氧化应激的标记

细胞内丙二醛(MDA)水平测定使用MDA测定脂质过氧化工具包(Beyotime、上海、中国)后,制造商的指示。首先,细胞被播种在6-well板( 细胞/)和持续增长,直到融合达到90%。收集H / R治疗后,细胞和细胞溶解细胞裂解缓冲(Beyotime、上海、中国)和离心机在10000克15分钟。上层清液的反应与硫代巴比土酸(稍后通知),和反应产物测定spectrophotometrically 532海里。

超氧化物歧化酶(SOD)测定了用总超氧化物歧化酶试验装备WST-8 (Beyotime、上海、中国)。细胞被播种在6-well板( 细胞/)和持续增长,直到融合达到90%。细胞治疗与H / R条件₂。细胞被洗冷PBS之前添加SOD缓冲溶液。蛋白质浓度测定使用增强的BCA分析工具包(Beyotime、上海、中国)。样品(20μl)与WST-8 /混合酶解决方案(160μl(20)和反应开始的解决方案μl)和孵化37°C 30分钟。450纳米的吸光度测量使用标(Bio-Rad)。

2.6。MitoTracker红染色

细胞被沾MitoSOX红色线粒体超氧化物指标(Yeasen、上海、中国)和赫斯特33342(细胞信号技术,丹弗斯,MA)。细胞在80 - 90%融合处理H / R条件₂。然后,细胞被孵化MitoSOX红色线粒体超氧化物指标10分钟37°C。然后,这些细胞被洗PBS和沾染了赫斯特33342年标签解决方案(1:10000)在室温下10分钟。荧光显微镜下观察到的细胞(奥林巴斯IX71)。

2.7。免疫印迹分析

细胞与冷PBS冲洗两次,然后细胞溶解在里帕缓冲区(Beyotime、上海、中国)含有1% (/)phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF) (Beyotime、上海、中国)和1% (/)蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(罗氏,曼海姆,德国)。增强BCA蛋白质分析工具包(Beyotime、上海、中国)是用来测量蛋白质浓度。样品受到10% SDS-polyacrylamide凝胶电泳,随后转移到一个聚乙二烯二氟化物膜(微孔Corp .)、Billerica质量。)在100伏2 h。膜被孵化Tris-buffered盐水(TBS: 10毫米Tris-HCl, pH值7.4,150毫米氯化钠)和0.1% (/)渐变20 (TBS-Tween)含有5% (/)奶粉1 h,然后各自主要抗体孵育过夜在4°C。主HIF-1抗体α胶原蛋白,胶原蛋白我VEGF-A三世,伯灵顿,bcl - 2中所描述的表S1。接下来,过滤器清洗3次,8分钟,TBS-T然后孵化与共轭affinity-purified二级抗体标记IRDye 800 v在室温下1 h。之后,再次洗膜,蛋白质带检测的奥德赛成像仪(LI-COR, Inc .,林肯,NE)。每个乐队的强度与ImageJ量化软件(贝塞斯达国立卫生研究院,医学博士,美国)。蛋白质的表达水平正常化β肌动蛋白。

2.8。实时聚合酶链反应

细胞总RNA分离使用试剂盒^®试剂(Ambion,生活技术)。第一链cDNA与HiScript reverse-transcribed II qRT SuperMix + gDNA雨刷(Vazyme R223-01,中国)。存在使用1 xaceq qPCR SYBR绿色主人混合(中国Vazyme Q111-02)根据制造商的指示。HIF-1特定引物合成α第三VEGF-A,胶原蛋白I,胶原蛋白mrna。GAPDH是作为内部参考,几何平均数的表达式用于规范化。qPCR引物的序列表中列出S2。相对量化的目标基因进行了一式三份和分析使用2^−ΔΔCt方法。

2.9。免疫细胞化学

这些细胞被镀的密度 细胞/在盖玻片24-well板块2天。4蛋白标记物的表达,包括HIF-1αVEGF-A,胶原蛋白I,胶原蛋白三世,用免疫细胞化学测量。简单地说,细胞被固定在4%多聚甲醛在室温下30分钟。洗后,这些细胞被permeabilized 0.25% Triton x - 100在PBS和屏蔽1%牛血清白蛋白(BSA)在室温下1 h。HIF-1抗体的细胞培养αVEGF-A,胶原蛋白I,胶原蛋白三世在一夜之间在4°C。与PBS 3洗后,细胞被孵化的Alexa Fluor488山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)在室温下2 H。最后,细胞与赫斯特复染色。然后染色细胞荧光显微镜下检查(奥林巴斯IX71)。

2.10。流式细胞术分析

膜联蛋白V标签使用结合流式细胞术检测凋亡细胞的外膜上磷脂酰丝氨酸。首先,绑定缓冲被稀释1:4与去离子水(4毫升绑定缓冲+ 12毫升去离子水)。然后,细胞收获用0.05%胰蛋白酶没有EDTA的解决方案(表达载体),与4°C prechilled PBS洗两次,resuspended绑定缓冲。接下来,调整细胞浓度 细胞细胞悬液(100 /毫升μl)被放置在一个5毫升流管,和5μ10和488 l膜联蛋白V / Alexa萤石μl propidium添加碘化解决方案。混合后,混合物在室温下避光孵化15分钟。孵化后,400μl PBS的添加到反应管,和细胞用流式细胞术分析(调NxT,应用生物系统公司、钙、美国)。对于每一个样品,大约10000事件统计和分析使用FlowJo软件(美国FlowJo、亚什兰或)。

2.11。统计分析

所有实验至少重复3次复制。数据被表示为 。分析的结果是单向方差分析与事后图基或测试 - - - - - -测试两两比较。所有的数据进行了分析使用Prism 5.0 b(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。CoCl₂全身缺氧提升HIF-1α表达式

HIF-1的蛋白表达α显著增加细胞内CoCl对待₂在0.05和0.1毫米的浓度( )并与高CoCl进一步增加₂浓度的0.2和0.4毫米( )(图1),它证实了CoCl的成功₂全身tendon-derived细胞缺氧模型。

3.2。H / R增加细胞的可行性

在缺氧条件下诱导CoCl的不同浓度₂tendon-derived细胞的生存能力显示,最初的增加逐渐减少与增加CoCl紧随其后₂浓度。观察一个显著差异只在CoCl 0.1毫米₂与对照组相比( )(图2(a))。复氧后24 h (R24h),细胞生存能力显著增加细胞接受0.15毫米和CoCl更高₂浓度( )(图2(b))。在R48h,细胞生存能力显著增加细胞内CoCl处理0.2 - -0.4毫米₂( 或 )(图2(c))。在R72h,显著增加细胞生存能力只是观察到细胞处理CoCl 0.25毫米₂( )(图2(d))。CoCl细胞生存能力₂细胞治疗在R96h类似于对照组(图2(e))。

在每个浓度、细胞生存能力在控制相比,缺氧和再氧化组。与对照组相比,低浓度的细胞治疗CoCl₂增加细胞缺氧下生存能力,增加了14%在0.1毫米0.05毫米和15% ( )(数据3(一个)和3 (b))。细胞治疗CoCl的浓度更高₂为0.15,0.2,0.25,和0.3毫米表现出显著提高细胞生存能力再氧化后24 h - 72 h ( 或 )(数据3 (c)- - - - - -3 (f))。2 CoCl最高₂浓度,细胞生存能力显著增加R48h相比在控制和H组( )(数据3 (g)和3 (h))。

3.3。H / R不抑制细胞生长

在实验中,我们观察到相对健康的细胞增长0.3毫米CoCl对待₂后再氧化。时略有萎缩的细胞在缺氧条件下,但形态恢复正常后再氧化(图4(一))。因此,我们选择了0.3毫米CoCl₂为后续实验模拟缺氧。细胞生长曲线显示略有增加细胞增殖在H / R比对照组(图4 (b))。

3.4。H / R介导氧化应激和线粒体活动

确定H / R对氧化应激的影响,水平细胞内MDA和SOD测定。期间MDA水平显著提高复氧与控制和H组( )(图5(a))。SOD水平下显著降低H / R的价格相比对照组( )(图5 (b))。MitoTracker红染色表明,生物活性的强度线粒体H和R组高于对照组(图5 (c))。

3.5。H / R HIF-1提高蛋白表达αVEGF-A和减少胶原蛋白的表达我和III

HIF-1的蛋白表达α显著增加,当细胞在缺氧复氧后,回到正常水平( )(图6(一))。相比之下,VEGF-A水平显示相似,但并不显著增加在缺氧和R24h和从R48h和之后(图恢复正常6 (b))。我胶原蛋白和胶原蛋白三世在R48h蛋白质含量显著降低,R72h, R96h相比对照组和H组( 或 )(数据6 (c)和6 (d))。

3.6。H / R调节HIF-1的mRNA表达αVEGF-A,胶原蛋白I,胶原蛋白三世

在H / R条件下,HIF-1的mRNA的表达α显著抑制(图7(一))。VEGF-A mRNA水平显著增加细胞在缺氧时,与对照组相比R24h ( )但显著减少当细胞处于R72h和R96h相比与H组( )(图7 (b))。胶原蛋白的mRNA表达我缺氧下显著增加,在R24h回到正常水平,显著降低从R48h R96h相比控制和H组( 或 )(图7 (c))。胶原蛋白III mRNA水平也显著增加缺氧下与对照组相比,但保持在正常水平与不同时期的复氧( )(图7 (d))。

3.7。采用免疫染色

图8(一个)显示HIF-1代表荧光显微图α第三VEGF-A,胶原蛋白I,胶原蛋白细胞H / R条件下时。我们计算阳性细胞通过细胞计数的百分比图8(b)。与对照组相比,HIF-1的百分比α缺氧(图下阳性细胞显著增加8(,而VEGF-A-positive细胞缺氧下显著增加,在R24h和R48h (P< 0.05)(图8(CID = " C002 " value = " B "))。胶原蛋白I -和胶原蛋白的百分比在R48h III-positive细胞显著降低,R72h, R96h相比之下,那些在控制和H组( 或 )(数据8(CID = " C004 " value = " C ")8(CID = " C006 " value = " D "))。

3.8。H / R并不影响细胞凋亡但改变bcl - 2蛋白表达的伯灵顿和

价值= "弗洛" value = " w "血细胞计数进行了探讨H / R条件下细胞凋亡水平。流仪分析表明,凋亡细胞的数量没有显著差异被发现在控制、缺氧和再氧化组(数据9(一个)和9 (b))。同时,伯灵顿的比例/ bcl - 2蛋白表达显著调节相比,复氧后的控制和缺氧组( ),在R48h峰(图9 (c))。

4所示。讨论

目前的研究发现tendon-derived细胞缺氧细胞反应和随后的再氧化。我们的研究结果表明,不同浓度的CoCl₂施加不同的影响细胞的生存能力。CoCl缺氧引起的低₂浓度(0.05和0.1毫米)增强细胞活力,而CoCl进一步增加₂浓度(0.15 - -0.4毫米)导致细胞生存能力逐渐降低。24 h - 72 h的再氧化,细胞生存能力增加细胞内高浓度的CoCl对待₂。细胞生存能力回到同一水平对照组的96 h的复氧后,无论初始CoCl₂浓度。

先前的研究已经表明,不同细胞系显示不同的公差CoCl₂全身的H / R。张等人证明CoCl₂没有促进或减弱A498细胞的生存能力在低浓度(0.05 - -0.2毫米),但当浓度增加到0.25毫米时,细胞活性逐渐下降(20.]。施等人的研究在人类卵巢癌细胞系表明CoCl₂全身(0.15毫米)缺氧抑制细胞增殖,随后恢复与复氧(23]。通等人表明HepG2细胞与不同浓度的CoCl治疗₂(0.05,0.1,0.15,0.2毫米)浓度的方式表现出显著抑制细胞生存能力(24]。然而,我们的数据显示,细胞生存能力被CoCl增强₂全身缺氧,即使CoCl的浓度₂达到0.3毫米。此外,在早期的再氧化,细胞生存能力进一步提高,特别是在细胞处理高浓度CoCl₂(0.25 - -0.4毫米)。此外,H / R对细胞生长没有明显的负面影响。这些结果表明,tendon-derived细胞CoCl高度宽容₂全身缺氧和再氧化。

H / R条件会导致氧化应激,这是一个主要的机制参与H / R损伤的发病机理(26- - - - - -29日]。因此,我们研究了两个氧化应激标志物的水平,MDA和SOD,生物活性细胞中线粒体的活动下H / R。MDA,脂质氧化的副产品,是细胞的氧化应激的生物标志(30.]。SOD是主要的抗氧化剂酶细胞扮演重要的角色在清除氧自由基和抗氧自由基的损害31日]。线粒体,占大多数的耗氧量,可以帮助调节细胞和有机体的缺氧反应(32]。我们的结果表明,MDA水平增加,SOD水平下降,和线粒体的活性生物活性增强下H / R,表明H / R tendon-derived细胞诱导的氧化应激。然而,氧化应激并不影响细胞生长在这个研究。我们推测,增加线粒体活动可能保持细胞的代谢需求和诱导氧化应激的适应性反应33- - - - - -36]。

HIF-1α是一个关键的转录因子在缺氧反应压力和广泛表达于哺乳动物,包括人类,在缺氧条件下37,38]。在目前的研究中,HIF-1α蛋白质水平显著增加细胞缺氧,然后返回到同一水平下控制细胞后立即再氧化。但是我们注意到,HIF-1的变化αmRNA和蛋白表达是不一致的。具体来说,HIF-1α在缺氧和再氧化mRNA表达显著降低,与先前的研究一致(39,40]。一个可能的解释是,HIF-1的表达αmRNA前蛋白的表达变化,信使rna表达的高峰发生在不到24小时。然后,抑制HIF-1α信使rna表达的恢复HIF-1引起的α蛋白质水平下的细胞再氧化。这些结果表明,tendon-derived细胞可以调节HIF-1的表达α在H / R条件下迅速。可能会带来好处的适应tendon-derived细胞缺氧,导致的高容忍这种类型的细胞H / R。

VEGF-A是一个重要的生长因子对于大多数组织在他们的反应涉及血液供应中断的外伤。先前的研究表明,VEGF基因的表达显著增加在肌腱的早期治疗,术中交付VEGF明显增强的肌腱愈合的鸡模型,表明VEGF在肌腱愈合的重要性41,42]。在我们的研究中,我们发现当HIF-1 VEGF-A调节受到缺氧α被激活,其水平恢复正常再氧化过程中随着时间的推移。我们的结果与先前的研究一致调查HIF-1的角色α在缺氧/ VEGF通路。梁等人明显表明,缺氧调节VEGF-A和适当的血管反应可能是必不可少的正常维修和改造。VEGF-A高程是快速和强大的应对缺氧侮辱通常出现在大多数组织(43]。因此,hypoxia-promoted VEGF的表达可能是肌腱损伤后自我保护的机制。

胶原蛋白是主要由肌腱细胞分泌的物质。腱ECM的主要成分,因此,合成胶原蛋白是至关重要的维持肌腱结构(44,45]。正常肌腱由65% - -85%的胶原蛋白,这是最丰富的胶原蛋白,其次是胶原蛋白3 (46,47]。胶原蛋白III是肌腱愈合过程中高度调节48]。胶原蛋白三世主要形成了丰富但紊乱的胶原蛋白在增殖阶段矩阵的肌腱愈合。韦伯斯特等人表明tendon-derived细胞在低氧培养紧张时,细胞代谢是沮丧和总蛋白和胶原蛋白生产减少(49]。这是假设缺氧环境可能没有满足细胞的氧生理需求,和胶原蛋白生产可能产生不良的影响50]。研究还报告说,有一个突然减少空我和III阿基里斯腱炎的早期阶段;随后肌腱发达实质性障碍和阿基里斯腱炎最终发生51]。我们的结果表明,胶原蛋白的表达我和III中表达下调再氧化。因此,体外再氧化过程可能与缺血后体内修复过程相对应。有趣的是,胶原蛋白的表达的下降似乎矛盾的增加细胞的可行性。我们推测,尽管细胞生长不受影响,其他细胞功能抑制在低氧的压力。

细胞凋亡中起关键作用的体内平衡的正常组织52]。在人类旋转肌附着点病变,HIF-1α积累与细胞凋亡有关,它提供了一个支持早期低氧诱导损伤的作用通过细胞凋亡(细胞损失53]。然而,Sasabe等人报道,迫使HIF-1的表情α抑制低氧诱导细胞凋亡的人类口腔鳞状细胞癌细胞系(54]。基于流式细胞术分析在目前的研究中,CoCl₂全身的H / R对细胞凋亡的影响最小。然而,伯灵顿的蛋白表达的调节而bcl - 2表达下调,导致显著增加在伯灵顿/ bcl - 2比例再氧化。伯灵顿/ bcl - 2比例达到了顶峰,48 h后再氧化之后,开始减少。这表明尽管凋亡通路被激活,并非真正的细胞凋亡在观察期内。我们推测tendon-derived细胞是高度抗H / R-induced凋亡及其固有细胞特征可以预防甚至逆转细胞凋亡的发生。另一个可能性是凋亡的起始先于细胞凋亡的发生机制。这方面,延长观察时间可以让我们得到一个更完整的画卷的凋亡事件后H / R。

5。结论

总的来说,本研究成功地建立了CoCl₂全身的H / R模型tendon-derived细胞,这为未来的研究提供了一个框架来理解这广泛的tendon-specific特性观察应激反应机制。该研究中的数据表明,缺氧复氧紧随其后的一段时间提升细胞浓度的方式生存。Tendon-derived缺氧细胞表现出相当的宽容。H / R引起氧化应激反应,但并不影响细胞生长。H / R HIF-1的表达改变αVEGF-A,胶原蛋白I,胶原蛋白三世。细胞凋亡不是影响H / R,但伯灵顿在复氧/ bcl - 2比例增加。

数据可用性

本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。

的利益冲突

所有读过《华尔街日报》的作者披露潜在的利益冲突和政策声明无利益冲突。

确认

这项工作得到了江苏省医学青年人才(批准号QNRC2016701)、江苏省自然科学基金(批准号BK20181203),和江苏省六大人才高峰计划(批准号西南偏西- 048)。

补充材料

表S1:抗体用于免疫印迹分析,采用免疫染色。表S2: qPCR引物序列。(补充材料)

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