文摘
设计一个新的mitochondria-targeted探针MitoCLox作为起始化合物的一系列探测器敏感心磷脂过氧化(CL)。荧光显微法选择性报道MitoCLox积累不同的活细胞中线粒体的文化及其氧化应激条件下,特别是导致选择性心磷脂氧化。比率荧光测量使用流式细胞仪显示显著依赖MitoCLox动态范围的样品的氧化。具体来说,MitoCLox氧化诱导了低剂量的过氧化氢或有机氢过氧化物。mitochondria-targeted抗氧化剂10 - 6 - - - - - -plastoquinonyl) decyltriphenyl-phosphonium (SkQ1)早些时候显示有选择地保护心磷脂的氧化,防止氢peroxide-induced MitoCLox细胞氧化。并发跟踪MitoCLox氧化和过氧化氢膜电位的变化反应表明,氧化MitoCLox开始没有延迟,是在第一个小时完成,而膜电位开始腐烂后40分钟的孵化。因此,MitoCLox可以用于把细胞氧化应激反应在单独的步骤。应用MitoCLox显示线粒体人口的异质性;生活的内皮细胞,小的一小部分,圆形的线粒体脂质过氧化水平增加细胞核附近被发现。此外,MitoCLox染色显示特定的细胞比例增加的氧化脂质水平的文化人类成肌细胞。这些细胞增加高密度文化的一部分。这些具体情况对应于自发肌细胞生成的起始在体外,这表明氧化爆发可能会先于肌原性的分化。这些数据点可能氧化CL参与细胞信号和分化。
1。介绍
心磷脂(CL)是一个独特的diphosphatidylglycerol磷脂有四个酰基链。在真核细胞中,仅位于内线粒体膜构成大约18%的磷脂。CL支持线粒体的功能活动通过塑造膜曲率和定义脊形态(1],稳定呼吸supercomplexes [2- - - - - -5),调节质子转移到energy-converting酶(6- - - - - -8),和防止质子漏(9]。几乎所有膜energy-converting酶包含紧密地绑定氯分子结构组件[一样重要10- - - - - -12]。
在完整的线粒体,CL位于内膜只在,但各种mitochondria-damaging代理产生易位的CL线粒体外膜(13]。发现核苷二磷酸激酶D (NDPK-D)结合CL膜间隙并促进其再分配(13,14]。外部化CL可以与dynamin-related GTPase Drp1及其寡聚化刺激,这对线粒体的分裂是至关重要的15]。有趣的是,其他dynamin-related GTPase OPA1,刺激内膜融合,也与CL (13,16]。此外,CL暴露在分子表面的分散可以被受体线粒体自噬小体包括LC3、导致受损细胞器的吞没(mitophagy)之后,他们在溶酶体(消化17]。外部化CL的其他重要的合作伙伴是inflammasome NLRP3 [18]和caspase-1 [18]。建议独立的交互NLRP3和caspase-1 CL的线粒体外膜促炎激活的巨噬细胞(19]。这些发现表明CL是一个重要的球员在线粒体动力学的监管和质量控制的机制。
不饱和脂肪酸的含量在CL显著高于其他线粒体磷脂。结合靠近呼吸酶的潜在来源的活性氧(ROS),不饱和脂肪酸的含量高使氧化CL特别敏感。发现一个小呼吸道细胞色素蛋白质c绑定后,氧化CL内线粒体膜的外表面,可以催化CL过氧化反应,导致细胞色素c从线粒体释放和细胞凋亡20.,21]。氧化和年龄相关性的损失提出了CL为老年性心脏(22和神经退行性23]疾病以及糖尿病(24]。建议的保护作用mitochondria-targeted肽SS-20欠其绑定CL和防止细胞色素c端依赖CL过氧化反应(25]。Imidazole-substituted类似物与TPP共轭的脂肪酸+抑制细胞色素c端依赖CL过氧化反应和保护老鼠胚胎细胞暴露于电离辐射(26]。认为在其他地方,mitochondria-targeted抗氧化剂的保护和抗衰老的效果与各种阳离子maieties可能是由于对过氧化(CL的具体保护27,28]。
在其他地方,我们已经描述了MitoCLox,跟踪新mitochondria-targeted荧光探针心磷脂(CL)氧化29日]。在MitoCLox,类似于前面介绍了MitoPerOx [30.),一个BODIPY(581/591)荧光团与triphenylphosphonium阳离子(TPP+)。然而,链接器在MitoCLox长于MitoPerOx链接器,包含两个肽债券(见图1)。灵活的链接器被选为一个模仿SS-20肽的裁判。25];这长链接器有一个可以容纳额外的带正电的根。
结果表明:MitoCLox可以报告CL氧化脂质体,但没有与有机氢过氧化物反应甚至在铁离子的存在29日]。基于分子动力学模拟的结果,建议MitoCLox及其衍生物,由于正电荷(s),可以选择性地氧化敏感的心磷脂,占主导地位的带负电荷磷脂的线粒体膜(29日]。
在这里,我们使用MitoCLox跟踪活细胞的线粒体脂质过氧化反应。MitoCLox选择性积累引起的线粒体和脂质过氧化作用报道外生prooxidants或内部氧化还原变化。
2。材料和方法
2.1。化学物质
MitoCLox合成中描述(29日]。SkQ1合成,如[31日]。其他试剂从Sigma-Aldrich(美国)。
2.2。细胞培养
人类癌细胞系(写明ATCC crl - 2577), RKO人类胎儿肺成纤维细胞MRC5转换与猿猴病毒40 (MRC5 SV2, EcACC猫。84100401),和人类内皮细胞系EA.hy926(写明ATCC crl - 2922)在DMEM培养基培养(杜尔贝科修改鹰的介质)(美国Gibco)补充2毫米谷氨酰胺和10%胎牛血清(的边后卫)(美国HyClone)和100 U /毫升链霉素和100 U /毫升青霉素(都来自Gibco, CA)。海拉细胞被培养在最小的必要媒介与厄尔的盐(MEM、PAA实验室GmbH e15 - 888)与5.6毫米葡萄糖,2毫米稳定的谷氨酰胺,碳酸氢钠,补充10%的边后卫(Biochrom AG), 1% MEM不必要的氨基酸(Biochrom AG)和1% 4−(2−羟乙基)piperazine-1-ethanesulfonic酸(玫瑰,PAA实验室GmbH)。人类成肌细胞永生化MB135是199年DMEM和培养基培养(4:1)补充15%的边后卫(美国HyClone),碱性纤维母细胞生长因子FGF-2 (10 ng / ml PanEco、俄罗斯)和0.1μΜ地塞米松。
2.3。显微镜
MRC5-SV40 EA.hy926内皮细胞和成纤维细胞生长在玻璃盖玻片放在6-well细胞培养板在200000细胞/和分析使用一个Axiovert显微镜(卡尔蔡司)。线粒体膜电位的分析,与TMRM Ea.hy926细胞孵化(100μ米,30分钟)和MitoTracker绿色(250 nM, 30分钟)。检测线粒体脂质过氧化,MitoCLox(200海里)添加2 h。成肌细胞MB135被播种在35毫米盘子和玻璃底(SPL)共焦显微镜在初始密度从0.5到 细胞/菜和培养4天。然后,MitoCLox(200海里)添加5 h,和细胞进行了分析使用尼康Eclipse Ti(尼康)共焦显微镜激发在488和562海里。
海拉细胞的荧光成像技术进行了用共焦激光扫描显微镜(徕卡TCS SP8 SMD)配备了63 x水目标(水、HCPL Apo 63 x / 1.2 W CS2)和两个光谱探测器、氩和可调白光激光器。测量在37°C。海拉细胞孵化了25μ甲萘醌或100μ米叔丁基氢过氧化物(tBOOH) 1 h和200 nM MitoCLox添加指定的时间了。绿色通道,荧光很兴奋的氩离子激光器的波长448纳米,收集和排放在500 - 560纳米的范围。在红色通道,荧光是兴奋与白光激光器的波长559纳米的激光波长和发射在580 - 630纳米的范围。
2.4。图像处理
海拉细胞的荧光强度沾MitoCLox分析与ImageJ (MacBiophotonics)。排除背景强度,大津面具被用作线粒体的面具,背景被设置为南。比率是决定从每个通道和平均灰度值表示基本细胞的线粒体网络。
2.5。流式细胞术
与MitoCLox MRC5-SV40细胞孵化(100 - 200 nM) 1 h之前添加h2O2或氢过氧化枯烯。SkQ1添加氧化应激刺激前24小时。衡量线粒体膜电位(MMP),这些细胞被沾染了100 nM TMRM 15分钟。
成肌细胞MB135被播种在6-well细胞培养板(9.6厘米2每口井的表面积)初始密度0.5,1,2,4,6 (×105/)和细胞培养4天。然后,添加了200海里MitoCLox 5 h,和细胞进行了分析。
流式细胞术分析用贝克曼库尔特FC 500年,由一个蓝色装备(488海里)激光或与5激光BDFACSAria三世(375 nm 405 nm 488 nm 561 nm,和633海里)。流动比率分析,软件2.4(细胞成像的核心,图尔库生物技术中心)使用。
2.6。统计数据
数据分析提出的 。比较分析了单向方差分析。Prism 7.0软件的意义进行了分析(美国GraphPad);一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。使用执行数据分析MitoCLox-stained海拉细胞起源™(OriginLab合作,北安普顿,MA)。给出的数据意味着在box-and-whisker情节,与框代表25日第75百分位数。为了确定治疗组之间的差异,为单因素方差分析(方差分析)(单向)与事后矫正人员执行测试。被认为是统计上的显著差异 。
3所示。结果
3.1。互动MitoCLox成纤维细胞的线粒体
评估的能力MitoCLox积累人类MRC5-SV40成纤维细胞,在细胞中线粒体的我们与红色荧光显微镜使用过滤器对应的荧光探针。我们观察到MitoCLox积累在成纤维细胞及其colocalization mitochondria-specific染料MitoTracker绿色(图2(一个))。以来MitoCLox不显著的绿色荧光染料是减少,不影响colocalization分析。
(一)
(b)
染料的动态积累和释放的细胞的速度使用流式细胞仪进行评估。最大MitoCLox积累在细胞达到在45 - 60分钟(图2 (b))。去除MitoCLox的介质后,荧光的细胞慢慢下降,达到50%的最大大约1 h。的膜去极化剂FCCP在探测器删除显著加速释放MitoCLox从细胞(图2 (b)),这表明积累的依赖的线粒体膜电位。FCCP MitoCLox之前添加的时候,荧光染料的扩散分布在胞质(没有显示)。
氧化MitoCLox分析相同的成纤维细胞的流式细胞术设置使用一个蓝色(488海里)激光和标准的带通滤波器 (FL1)记录氧化MitoCLox的发射峰与峰 (FL2)。尽管这些设置并不完全适合BODIPY581/591荧光(图的峰值3(一个)),之后,“碳足迹”FL1信号的变化增加了11倍的500年μM H2O2活细胞。FL2信号也略有提高,这主要是由于长波长的贡献肩膀荧光光谱的氧化形式(图3)。因此,MitoCLox氧化导致5-6-fold FL1 / FL2发射信号的比例增加。为了进一步提高灵敏度,我们应用流式细胞仪设置有两个激光器,即蓝色激光(488海里)和绿色激光(561海里)和带通滤波器 (FL1)和 (FL2)。这些设置适合的参数BODIPY581/591荧光,但FL1 / FL2信号的动态范围MitoCLox没有明显优于最小设置(没有显示),所以用一个蓝色激光流式细胞术是在进一步的实验中使用。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
H的分析2O2全身的氧化应激证明MitoCLox氧化发生只在一小部分细胞群的低水平的H2O2。在高剂量的H2O2观察,近正态分布的氧化MitoCLox(图3 (c))。500年MitoCLox氧化诱导动力学μM H2O2达到饱和约60分钟(图3 (d))。氢过氧化枯烯(CumOOH)诱导MitoCLox类似的反应,但在低剂量(没有显示)。线粒体靶向抗氧化剂SkQ1 (10 - 6 - - - - - -plastoquinonyl) decyltriphenyl-phosphonium [27)抑制氧化MitoCLox诱导的H2O2或者通过CumOOH(图3 (e))。
3.2。测量的海拉细胞线粒体脂质过氧化作用
海拉细胞被使用甲萘醌等氧化化合物(25μ米)和叔丁基氢过氧化物(tBOOH;100年μ米),分别为1 h。线粒体在细胞治疗这些氧化剂,然后沾MitoCLox 30分钟(200海里),和两个渠道(荧光 ; )记录了共焦显微镜(图4(一))。各自的荧光图像显示显著增加荧光绿色通道和红色通道(图几乎没有变化4(一))。绿色/红色荧光比率的计算表明,荧光发射比的增加 )甲萘醌和tBOOH治疗后显著(图4 (b)),说明MitoCLox氧化。
(一)
(b)
3.3。应用程序跟踪分离步骤的MitoCLox细胞氧化应激反应
氧化应激是导致线粒体脂质过氧化和线粒体膜电位下降(MMP) [9,24]。分析时间模式下的脂质过氧化和MMP减少氧化应激,我们测量MitoCLox氧化同时与potential-dependent tetramethylrhodamine积累(TMRM) MRC5-SV40细胞(图5)。细胞内过氧化氢处理0.5毫米,氧化MitoCLox开始没有延迟,是几乎完全在第一个小时(黑色的方块图5)。MMP的显著下降可能是40分钟后观察孵化(红色方块图5)。
3.4。异质性MitoCLox氧化在单个细胞
染色的内皮细胞培养MitoCLox透露的一小部分线粒体脂质过氧化水平增加(图6(一))。这些线粒体小,圆形,位于细胞核附近。
(一)
(b)
在图6 (b)比较类似的示例,我们展示的线粒体在内皮细胞异质性,我们观察到的早些时候32,33]。独立使用的组合MitoTracker绿色染色线粒体MMP和甲酯TMRM只积累与高MMP的线粒体,我们发现线粒体去极化的位于细胞核附近的一小部分。这些细胞核周围的线粒体是更小、更圆比线粒体与更高的潜在位于相同的单元中。图像的比较数据6(一)和6 (b)表明在异构模式相似性MitoCLox线粒体的氧化和MMP的人口。
3.5。MitoCLox在成肌细胞细胞培养中的应用
我们应用MitoCLox分析线粒体脂质过氧化作用在人类的文化成肌细胞MB135。
线粒体氧化状态是至关重要的各种流程的肌肉,包括肌原性的分化(肌发生)——肌肉纤维的形成过程在胚胎发育和肌肉再生。线粒体肌细胞生成伴随着戏剧性的重组网通过mitophagy和线粒体生物起源(34,35]过程极度依赖mitoROS [36]。因此,分析CL过氧化的成肌细胞细胞培养肌细胞生成的研究可能是一个有价值的工具。我们发现一个特定部分的细胞表现出明显的氧化MitoCLox否则同质文化的人类成肌细胞MB135。荧光显微法证明了细胞与氧化MitoCLox形成紧凑的胰岛细胞单层(图7(一))。抗氧化剂Tempol防止MitoCLox氧化。流式细胞术能量化这个分数的大小(图7 (b))。细胞的氧化MitoCLox积累了文化,被播种的初始密度 细胞/好,达到高密度融合(80 - 100%)在4天的培养。如果最初的播种密度过低的细胞变成接近confluency 4天后( 细胞/),未发现与氧化MitoCLox细胞。细胞氧化MitoCLox增加的分数成正比的增加最初播种密度(图7 (c))。如果在高密度的细胞被播种 细胞/好,但只培养24小时,而不是4天前MitoCLox,人口的细胞氧化MitoCLox不是观察(数据未显示)。这些数据让我们排除可能先在的(遗传或表观遗传异质性的细胞培养。
(一)
(b)
(c)
我们发现,线粒体在细胞分裂更明显氧化MitoCLox(图7(一))协议的关键作用线粒体ROS在线粒体碎片36]。
4所示。讨论
在这里,我们测试一个新的mitochondria-targeted法律外包荧光探针MitoCLox不同细胞培养条件下,导致氧化应激。在所有测试例,MitoCLox可靠报告法律流程外包。获得的数据完全一致的行为模型中MitoCLox脂质体系统[29日]。
具体来说,MitoCLox MMP-dependent积累在细胞,改变了荧光响应的H2O2、甲萘醌和tBOOH(数字2- - - - - -5)。可以防止氧化MitoCLox mitochondria-targeted抗氧化剂SkQ1(图3),以及抗氧化剂Tempol(图7),这是在良好的协议与高效的抗氧化剂保护线粒体的结构和功能在不同的细胞氧化应激模型(27,37)和他们的保护行动在活的有机体内(38,39]。
值得注意的是MitoCLox的响应,以流式细胞术(图3),是更明显比显微镜实验(数字2和4- - - - - -7),它呈现MitoCLox作为一个合适的标记流式细胞仪测量的脂质氧化。
氯氧化增加质子漏通过内线粒体膜和导致MMP的下降(9,24]。根据总编和他的同事建议,MMP保护细胞免受氧化损伤的下降通过抑制ROS的生成(40]。衰减氧化损伤的另一个机制是MMP-dependent碎片的线粒体网络,它允许将受损的线粒体与整数的和消除前(9,41]。自氧化CL也是作为装配apoptosome[触发器42,43),似乎CL触发器支持和凋亡的氧化反应。因此,细胞的命运似乎是由职业之间的平衡,同一事件引发的凋亡反应的氯氧化9]。为理解这个相互作用,它需要遵循CL氧化和MMP的变化在活的有机体内。图5显示MMP遵循下降MitoCLox氧化有一定滞后。尽管滞后的原因值得进一步调查,似乎容易推测,细胞维持MMP几十分钟通过水解ATP股票。ATP浓度不应在高度迅速降低糖酵解细胞使用,所以最初预期的增加膜质子漏可以抵消由MMP一代腺苷三磷酸酶(以及其他质子泵)。
早些时候,结果表明,氧化应激是最初在一次独家氧化氯分子(44- - - - - -46]。因此,快速巴解组织,据MitoCLox针对氧化应激在不同系统(数据2- - - - - -5),最有可能的是,由于主要的氧化CL。
小细胞核周围的线粒体的观察MMP的较低(图6)可能与早期内皮细胞线粒体异质性的报告(32,33]。数据的数据6(一)和6 (b)表明一个特定的小族群的存在线粒体的内皮细胞MMP的减少和氧化CL。早些时候,类似的结果为“库兹涅佐夫”和Margreiter观察小圆细胞核周围的线粒体与降低MMP HL-1心肌细胞(47,48]。人们很容易推测线粒体的过氧化脂质(主要是CL)可以负责降低MMP在线粒体的一部分人口箭头在图所示6。也许,这些小线粒体作为细胞内稳态的传感器。众所周知,氧化磷酸化不是ATP在内皮细胞的一个重要来源48),这样的一小部分线粒体去极化的不会显著影响这些细胞的能量平衡。我们的观察表明,CL过氧化反应在线粒体的一小部分人群可能是一个原因在单个细胞线粒体的功能和结构的异质性。
应用MitoCLox允许我们探测到一个特定的分数与高水平的细胞线粒体脂质过氧化作用在人类文化的成肌细胞MB135。这个单元格的大小比例增加,细胞密度随着培养时间的增加。这些特定的条件与自发肌发生的概率增加在体外(49]。在高细胞密度、信息联系人发起接触抑制细胞周期的进展,细胞融合,表情肌细胞生成的关键球员如MyoD和myogenin [50]。此外,肌母细胞被证明自己分泌细胞外基质糖蛋白,促进肌原性的分化(51]。人们很容易推测,一个族群与氧化成肌细胞线粒体CL包括承诺的成肌细胞分化。
碎片化的线粒体网络和mitophagy需要线粒体生物起源和肌原性的分化34,35]。放松管制的这些过程有助于各种类型的遗传肌肉萎缩症和与年龄有关的sarcopenia [36]。心磷脂是深入参与线粒体动力学的规定,因为它既与profission交互(Drp1) [15)和缤纷(Opa1) [13]dynamin-related gtpase。此外,外化的CL外线粒体膜可以作为mitophagy[消除信号之一15]。这些数据表明,氧化CL(也许,其他脂质)是导致早期的事件之一,通过线粒体分裂和mitophagy肌细胞生成。这个建议很好协议mitochondria-targeted发现高剂量的抗氧化剂抑制肌发生通过抑制线粒体分裂和mitophagy [52- - - - - -54]。有趣的是,轻微的线粒体ROS的损耗不块体外基本成肌细胞融合,甚至刺激分化成肌细胞的一些遗传缺陷55]。肌细胞生成并不是唯一的例子分化程序取决于mitoROS。在间充质干细胞,mitoROS被发现不仅开始分化,而且有助于细胞命运决定(56]。线粒体ROS(至少部分通过调制线粒体动力学和mitophagy)的贡献也在表皮和毛囊角化细胞分化发展(57和脂肪细胞的分化58)和免疫细胞(59]。MitoCLox可能是一个有价值的工具,这些分化的研究项目。
5。结论
在这里,我们表明,一个新的分子mitochondria-targeted探针MitoCLox积累在活细胞线粒体和报告的氧化条件下线粒体脂质氧化应激。比率计测量MitoCLox氧化使用流式细胞仪显示很好的动态范围的调查。Mitochondria-targeted抗氧化剂SkQ1抑制MitoCLox氧化是诱导通过过氧化氢或有机氢过氧化物。早期的研究结果表明,CL(一)选择性氧化条件下兼容我们的实验和(b)可以通过阳离子mitochondria-targeted抗氧化剂(防止氧化44- - - - - -46]。我们建议MitoCLox最有可能最好报告CL的氧化,同意分子动态模拟预测的结果特定的亲和力MitoCLox CL (29日]。具体来说,应用MitoCLox透露,脂质氧化发生后立即添加过氧化氢和之前MMP的下降。在肌细胞生成的体外模型,使用MitoCLox揭示细胞亚群水平增加脂质氧化和支离破碎的线粒体。观察这些细胞只有在成肌细胞的长期培养一个密集的文化,这是一个必要条件的肌原性的分化。总之,新的调查表明一个显著的潜在的活细胞线粒体脂质过氧化作用研究。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
没有利益冲突。
确认
支持的工作是俄罗斯科学基金会授予17-14-01314。K.L.要感谢德国学术交流服务(德意志)及其Ostpartnerschaften方针的支持。作者承认德意志Forschungsgemeinschaft的支持(DFG)和奥斯纳布吕克大学的开放获取出版基金。K.B.和开国元勋之一B.R.安贝德卡对由德意志Forschungsgemeinschaft (Bu2288/1-2)和CiM。中给出的研究数据6和7支持部分由俄罗斯基础研究基金会(资助号17-00-00088和1904 - 01020年)。