在人类胚胎肾293T细胞的氧化损伤柠檬种子黄酮类化合物的改进由H诱导₂Ø₂

抽象

在本研究中，我们利用柠檬种子中的黄酮类化合物(FLS)来评估其对H . H诱导的人胚胎肾293T细胞(hek293t细胞)氧化损伤的改善作用₂Ø₂。在体外实验表明，用不同的类黄酮浓度处理HEK 293T细胞的存活率（50 μg / mL, 100μ克/毫升，和150 μ克/毫升）超过95％，这表明没有显著毒性作用。与正常组，H相比₂Ø₂（0。3 mmol/L) resulted significantly in oxidative stress injury of HEK 293T cells. The survival rate of the damaged cells increased after treatment with flavonoids, and the survival rate of cells treated with a high concentration (150 μ黄酮类化合物克/毫升）中的76.2％。黄酮类化合物还有效地抑制了^ h₂Ø₂诱导细胞凋亡。同时，类黄酮治疗显著降低在细胞中的丙二醛含量和增加的过氧化氢酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽（GSH）的水平，和谷胱甘肽过氧化物酶（谷胱甘肽过氧化物酶）。定量聚合酶链反应（qPCR的）和Western印迹分析也表明，FLS上调CAT的mRNA和蛋白表达，SOD（SOD1，SOD2），GSH（GSH1），和GSH-Px H中₂Ø₂HEK 293T细胞的诱导的氧化损伤。高性能液相色谱分析表明，FLS包含六种化合物，包括没食子儿茶素，咖啡酸，表儿茶素，牡荆素，槲皮素，橙皮苷和。FLS被证明具有良好的抗氧化能力在体外显著改善H诱导的HEK 293T细胞氧化损伤₂Ø₂。生物活性值值得进一步研究。

1.简介

柠檬（L.）打嗝。f、 作为富含维生素的水果被广泛食用[1]。大多数水果中的柠檬种子被丢弃。在中国的传统医学，只柠檬籽少量在中国传统医药的一些化合物加入。小是关于现代分子生物学等技术，其生物活性闻名。一项研究表明，柠檬籽提取物可在大豆油脂加工起到抗氧化的作用[2]。柠檬籽提取物可以保持氧化稳定性和α-生育酚在大豆油加工中的应用[3]。在体外实验证明，柠檬籽提取物能抑制人乳腺癌的增殖，具有抗癌作用[4]。

由人的有氧代谢产生活性氧物质（ROS）主要包括超氧阴离子（O₂^-），过氧根阴离子（O₂^2个-），羟基自由基（·OH），有机过氧自由基（ROO^-)和H₂Ø₂。当大量的氧自由基(雌花)超过自己的抗氧化保护系统的范围和过度氧化发生时,它会攻击人类细胞获得电子和保持自己的稳定,导致损失相对于细胞的形态和功能,以及炎症和其他类型的慢性疾病,如心血管疾病、神经系统疾病、肾脏疾病和癌症(五，6]。这些疾病的机制，在大多数情况下，涉及关键生理分子的氧化变化，如蛋白质，脂质，碳水化合物，核酸，基因表达的调节，和炎症反应[7]。为了保护身体免受氧自由基损伤，人类通过自己的抗氧化系统和抗氧化剂外源性摄入抗氧化应激。所述酶系统包括超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT），和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的系统。非酶抗氧化剂包括面筋，茶叶中的茶多酚，维生素E，类黄酮，和脂肪酸[8]。作为ROS的主要形式体内， H₂Ø₂，具有广泛的来源和稳定的特性，能够产生·OH与细胞内的Fe^2个+通过Fenton反应，从而引起连锁反应，是细胞氧化应激建模的首选诱导剂[9]。

293T细胞是人肾上皮细胞系，其表现出对外部环境和强的蛋白质表达有明显的影响。它经常被用于检查测试样品的氧化应激的抑制作用[10个]。肾上皮细胞的损伤是密切相关的慢性肾功能疾病，如慢性肾盂肾炎和慢性梗阻性肾病[11个]。肾上皮细胞损伤将导致肾功能的衰退，也将影响其它疾病，包括多发性骨髓瘤，白血病，和恶性肿瘤[德意志北方银行]。人胚胎肾293T可通过氧化应激有效检测活性物质在疾病控制中的作用。因此，本研究对黄酮类化合物的抗氧化活性进行了研究在体外并建立使用H的HEK 293T细胞损伤模型₂Ø₂作为诱导剂。此外，不同的浓度与氧化应激损伤的细胞黄酮的保护作用进行了评价。同时，类黄酮的活性成分进行了测定，其为类黄酮与由氧化应激引起的治疗有关的疾病提供了参考。

2.材料和方法

2.1。制备黄酮从柠檬种子提取物（FLS）

将FLS (Chongqing Huida Lemon Technology Group Co.， Ltd .， Chongqing, China)的提取物干燥，以保持柠檬种子的重量不变，然后将其研磨在砂浆中，筛取柠檬种子粉。正己烷脱脂90 min(脱脂温度50℃;料液比，1:30;和功率，200w)。过滤干燥后，从8 g脱脂柠檬籽粉中提取黄酮类化合物，加入300 mL 95%乙醇，静置60 min(温度50℃;功率200 W)。最后过滤得到样品溶液，用旋转蒸发器(郑州长城科工贸有限公司长城R-1050)蒸发干燥FLS。

2.2。细胞培养

将人胚胎肾293T细胞(上海生物化学与细胞生物学研究所，上海，中国)从液氮中复苏，接种于Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM)(高糖，含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗体溶液)(Solarbio Life Sciences，北京，中国)。培养基在37℃、5% CO的饱和潮湿环境中每周更换2 - 3次₂. 当细胞融合率达到90%时，胰蛋白酶（0.25%）被用于消化和传代。所有实验均采用对数期细胞。

2.3。FLS对HEK 293T细胞的毒性

hek293t细胞悬液( 细胞/ mL）接种到96孔细胞培养板（ ）Cultured at 37°C for 24 h until it adhered to the wall, and 20 μL不同浓度的FLS溶液(正常组，50μg / mL, 100μ克/毫升，和150 μg/mL）添加到培养基中。

2.4。细胞存活率由MTT检测

采用MTT法测定细胞存活率:hek293t细胞原代培养于细胞壁24 h，培养20 hμL的FLS溶液和不同浓度(正常组，50μg / mL, 100μ克/毫升，和150 μg/mL）24小时；20小时μL of MTT (5 mg/mL) (Solarbio Life Sciences) was added, mixed, and cultured for 4 h. The upper medium was discarded, followed by adding 150 μL二甲基亚砜(DMSO) (Solarbio生命科学)，在黑暗期和37°C条件下摇晃30分钟。在490 nm处测量光密度(OD)。实验一式三份。 ，其中Ar是FLS治疗组的OD和As是正常组OD（演进™350，赛默飞世尔科技，纽约，美国）。

2.5。细胞增殖观察

hek293t细胞悬液( 细胞/ mL）接种到96孔细胞培养板（ ）Cultured at 37°C for 24 h, adhered to the wall, and cultured with 20 μ的H L₂Ø₂（0。3 mmol/L), and 20 μL不同浓度的FLS溶液(正常组，40μg / mL, 100μ克/毫升和160μg/mL)加入培养24 h, MTT法测定细胞存活率(图1（一个））。

hek293t细胞悬液( 细胞/ mL）接种到96孔细胞培养板（ ）Cultured at 37°C for 24 h, adhered to the wall, and cultured with 20 μ的H L₂Ø₂（0。3 mmol/L) for 4 h to prepare the oxidative damage model. After discarding the upper medium, 20 μL不同浓度的FLS溶液(正常组，40μg / mL, 100μ克/毫升和160μg/mL)加入培养24 h, MTT法测定细胞存活率(图1(b))。

2.6。细胞凋亡的观察流式细胞仪

根据细胞增殖实验处理hek293t细胞，收集并形成单细胞悬液。固定和染色后，用流式细胞术检测细胞凋亡(Accuri C6, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)。

2.7。HEK 293T细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH- px)和过氧化氢酶(CAT)的测定

对数生长期hek293t细胞用0.25%胰酶消化，接种于6孔细胞培养板( 细胞/mL），与2 mL DMEM在37℃和5%CO的饱和潮湿环境中培养₂24小时，贴壁，加200μ的H L₂Ø₂(0.3 mmol/L)，混合均匀，培养4 h，制备氧化损伤模型。FLS水提液(200μL）用不同浓度（0 μ克/毫升，50 μg / mL, 100μ克/毫升，和150 μg/mL) was added into each well of the HEK 293T cell model of oxidative damage, and PBS solution (0.1 mol/L) was added to maintain balance. The cells were further cultured at 37°C and 5% CO₂for 24 h. HEK 293T cells treated with FLS were removed from the old culture medium, washed with precooled PBS, detached from the wall with 200 μL of trypsin, transferred to a 1.5 mL centrifuge tube, and centrifuged to discard the supernatant. The cells were again washed with precooled PBS and centrifuged at 4,000 r/min for 15 min to discard the supernatant, with the addition of 800 μL标准盐水和均质化。MDA，SOD，GSH，GSH-Px活性在匀浆的内容，和CAT是根据试剂盒说明书（南京建成生物工程研究所，南京，中国）来确定。

2.8。单独分析

HEK 293T细胞按分段细胞培养法进行培养2.2;the HEK 293T cells in the logarithmic growth stage were digested by 2.5 g/L trypsin to form a single cell suspension. The HEK 293T cells were inoculated into 24-well plates, with 50 cells per well. Each group of cells was inoculated with six wells, five groups in total (normal, control, FLSL, FSLM, and FLSH groups). HEK 293T cells in the normal group were cultured for 1 week without any other treatment. HEK 293T cells in the control group were cultured using 900 μ大号DMEM培养基和100 μL含H的培养基溶液₂Ø₂（0。3 mmol/L); the FLSL group, FSLM group, and FLSH group were cultured using 800 μ大号DMEM培养基，100 μL含H的培养基溶液₂Ø₂（0。3 mmol/L), and 100 μL含FLS(40)的培养基溶液μ克/毫升，80 μ克/毫升和160μ克/毫升）1周。The culture medium was discarded, the wells of the culture dish were washed using PBS, fixed with 1 mL pure methanol for 15 min, and Giemsa stain solution (Solarbio Life Sciences) was used for dyeing. The number of clones comprising more than 50 cells was counted when the culture plate was placed in the low multiple of microscope (IX73, Olympus, Tokyo, Japan), and the clone formation rate was calculated according to the following formula: [13个]。

2.9。定量聚合酶链反应(qPCR)

hek293t细胞培养于6孔板中( 细胞/ mL）和建模后，在不同浓度的FLS处理。使用TRIzol试剂（赛默飞世尔科技）HEK 293T细胞的总RNA提取。我们增加了1 μL of Oligo (dT) 18 primer (500 ng) and 1.0 μ总RNA的L (1.0)μ10.0 g)μL of nonnuclease water heated at 65°C for 5 min on a gradient PCR apparatus. Then, the mixture containing 4.0 μ微升5x反应缓冲液，1.0 μ核糖核酸酶抑制剂L（20 U），2.0 μL 10毫米dNTP混合，和1.0μL的逆转录酶(200 U/μL) (Thermo Fisher Scientific) was added to the total RNA system, which was transcribed into cDNA at 42°C for 60 min and 70°C for 5 min. Amplification conditions were as follows: denaturation at 95°C for 3 min, annealing at 60°C for 30 s, extension at 95°C for 1 min, and a total of 40 cycles. mRNA expressions of SOD, CAT, GSH, and GSH-Px were detected using qPCR (Table1）。各基因的cDNA的扩增在平行三次，得到的Ct的平均值。看家基因GAPDH用作内部参考，并且根据计算出的相关基因(StepOnePlus, Thermo Fisher Scientific) [14个]。

2.10。Western印迹

用RIPA细胞裂解液裂解细胞后，分离上清，用蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。我们分离出30 - 50μ通过SDS-PAGE，我们将g蛋白电印到一层硝化纤维素(NC)膜上。将NC膜封闭后，分别与SOD1、SOD2、GSH1、CAT的一抗、二抗结合，利用化学发光法检测抗体(Thermo Fisher Scientific)结合区(中国上海塔农科技有限公司)[15个]。

2.11。高效液相色谱法

The FLS extracts were dissolved in DMSO to obtain a solution with a concentration of 10 mg/mL, and then diluted with 50% methanol to obtain a final concentration of 2 mg/mL. After passing through a 0.22 μ米有机滤膜过滤，该溶液用5注射体积测试 μ五十、 数据如下：色谱柱：Accucore C18柱（2.6 μ男， ）;流动相A：0.5％乙酸;流动相B：乙腈;flow rate: 0.6 mL/min; column temperature: 35°C; detection wavelength: 285 nm; gradient elution conditions: 0–10 min, 12%–25% A; 10–30 min, 25%–45% B.

2.12。统计

SPSS 20.0统计软件来分析数据。所有的实验数据，重复3次。结果表示为 值。采用邓肯的多范围检验和方差的单向分析的结果进行了分析。一个 被认为是统计上显著。

3.结果

3.1。FLS对HEK 293T细胞的毒性

如图1，治疗后50岁μg / mL, 100μ克/毫升，和150 μFLS提取物g/mL，HEK 293T细胞的存活率超过95%，说明FLS在0～150μg/mL范围内没有明显的致死作用μ（g/mL）在HEK 293T细胞上。因此，从50 浓度的柠檬籽中提取FLSμg / mL, 100μ克/毫升，和150 μg/mL用于后续研究。

3.2。FLS对h的增殖保护作用₂Ø₂诱导HEK 293T细胞

如图2与正常细胞相比，H损伤的hek293t细胞的存活率较低₂Ø₂显著下降。用H同步处理后₂Ø₂（数字2(一个))H之后₂Ø₂诱导的氧化损伤（图2 (b)），细胞的生存率50处理 μg / mL, 100μ克/毫升，和150 μ克/毫升FLS萃取物显著提高，并且具有高浓度处理的细胞的存活率（150 μ克/毫升）中的89.2％，具有更显著效果（ ）。

3.3条。FLS对H诱导HEK 293T细胞损伤的抑制作用₂Ø₂

在数字中3与正常细胞相比，H损伤的hek293t细胞出现严重损伤(受损细胞和凋亡细胞)₂Ø₂（97.1％受损，细胞凋亡，对照组）。与50后的治疗 μ克/毫升（77.1％受损和细胞凋亡），100 μg/mL(66.2%细胞受损及凋亡)μ克/毫升FLS（39.8％受损和凋亡细胞）提取物，细胞损伤显著抑制（ ）和的抑制作用是具有增加的浓度FLS更好。

3.4。FLS处理后hek293t细胞MDA、SOD、GSH、GSH- px和CAT水平的变化

如图4、H处理hek293t细胞的MDA含量₂Ø₂（0。3 mmol/L) for 4 h is significantly higher than that in normal cells, but the OD, GSH, GSH-Px, and CAT levels are significantly lower. After being treated with FLS at different concentrations (50 μg / mL, 100μ克/毫升，和150 μ(g/mL)， MDA含量显著降低( ）但SOD，GSH，GSH-Px活性和CAT水平显著升高（ ）。150的影响μ克/ mL的治疗FLS是最显著。

3.5。在损坏的HEK 293T细胞FLS对克隆形成

如表所示2，相比于正常HEK 293T细胞，H₂Ø₂有显著的影响（ ）对细胞克隆形成HEK 293T细胞的，与对照组有HEK 293T细胞克隆的数量最少。FLS能显著（ ）抑制H。H。引起的克隆形成的减少₂Ø₂以及与FLS浓度的增加，抑制效果更强。

3.6。在损坏的HEK 293T细胞中的SOD，CAT，GSH和GSH-Px的表达FLS的影响。

如图五H后,₂Ø₂-诱导损伤（0.3 mmol/L），HEK 293T细胞中SOD、CAT、GSH、GSH-Px的mRNA表达及SOD1、SOD2、CAT、GSH的蛋白表达均显著降低。经FLS处理后，损伤细胞中SOD、CAT、GSH和GSH-Px的表达显著增加( ）这与该试剂盒测试的结果是一致的。FLS可以增加SOD，CAT，GSH，和GSH-Px水平，因为它是使用试剂盒，以确定在使用qPCR和Western印迹测定受损HEK 293T细胞中的表达来确定。

3.7。FLS的HPLC测定

如图6，FLS含有六种化合物，包括没食子儿茶素，咖啡酸，表儿茶素，牡荆素，槲皮素，橙皮苷和。Their peak retention time on the liquid chromatogram was 5.664 min, 9.715 min, 10.611 min, 20.442 min, 25.017 min, and 31.010 min, respectively. The contents of the six components in the FLS were 18.304 mg/g, 37.294 mg/g, 25.080 mg/g, 108.539 mg/g, 334.585 mg/g, and 145.983 mg/g, respectively.

4。讨论

由氧化应激引起的损伤影响正常细胞的增殖，导致细胞死亡和下降中的细胞[增殖16个]。因此，FLS可以抑制HEK 293T细胞的由H诱导的降低的增殖₂Ø₂并保护正常细胞增殖。氧化应激可破坏细胞，引起细胞凋亡，促进正常细胞的死亡，并有效地减少氧化损伤的细胞的凋亡程度保护正常细胞[17岁]。当FLS和H₂Ø₂同时加入到培养的细胞中，FLS可直接与H₂Ø₂， H的量减少₂Ø₂能破坏细胞，从而发挥不是H后加入FLS的干预作用更强₂Ø₂首先破坏细胞。因此，FLS能有效地预防氧化应激引起的细胞凋亡，保护正常细胞。

MDA从与蛋白质和核酸细胞膜发生反应释放时，引起交联聚合，并抑制蛋白质的合成，主要是通过破坏膜的结构和功能，改变其磁导率，从而影响在正常体生化反应[18岁]。因此，MDA含量可以反映脂质过氧化程度和细胞损伤程度。摄入适当的抗氧化物质可降低ros诱导的脂质过氧化程度[19个]。CAT，SOD，和GSH-Px是重要的抗氧化酶，和GSH也是一个具有良好的抗氧化作用。它们可以有效地调节体内氧化平衡，抑制氧化应激引起的损伤[20个]。这项研究的结果表明，FLS有效地降低引起由H的氧化应激损伤₂Ø₂对细胞和保护细胞。

克隆分析(集落形成分析)是一种新的分析方法在体外基于单个细胞的长成的菌落，这基本上是在群体中的每个小区的“无限”除以功率的实验的能力的细胞存活试验。产克隆测定可以被用于确定细胞毒性或药物或活性物质的疗效[21岁]。在这项研究中，我们也发现，FLS可有效抑制因过氧化氢，实现细胞保护作用正常细胞的异常克隆形成。

表没食子儿茶素是一种从植物中提取的化合物，具有一定的抗氧化活性[22个]。咖啡酸具有广泛的抗菌和抗病毒作用[23个]并已被证明能抑制小鼠脑匀浆中脂质过氧化物的形成[24个]。表儿茶素具有抗氧化、清除自由基、增强新陈代谢、调节免疫和抗肿瘤等作用。其抗氧化能力被认为是酚羟基与分子内自由基的结合，以清除自由基[25个]. 牡荆素的主要作用是促进血液循环，祛瘀，理气，疏通血管。牡荆素也是一种天然的抗癌药物成分[26个]. 槲皮素广泛存在于植物中，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、神经保护、降压等多种生物学活性[27个]。橙皮苷具有抗炎、抗病毒和抗菌作用，用于治疗高血压和心肌梗死[28个]。这些六种物质是有效的生物活性的所有化合物。FLS的正常保护作用归因于这些化学品的生物活性，以及​​这些化合物的混合物可以产生改进的组合效果，其权证进一步调查。

5个。结论

在这个研究中，在体外进行实验以评价FLS对细胞水平和下的氧化性损伤的潜在活性的化合物的改善的效果。结果在体外实验表明，FLS表明对氧化的细胞损伤，从而避免由氧化应激引起的细胞死亡的有益效果，抑制细胞凋亡的氧化损伤导致的，并增强在细胞中抗氧化酶以抵抗氧化应激。成分分析结果表明，包含在FLS活性化合物具有多种生物活性，并且它们的组合显示出对氧化细胞损伤的抑制作用。不过，这项研究只是初步研究抗氧化活性和改善从柠檬种子FLS的氧化损伤在体外。抗氧化保护的机制体内需要更多的探索。

数据可用性

没有数据支持这项研究。

利益冲突

作者声明他们没有潜在的利益冲突需要披露。

作者的贡献

大部分实验由杨定义完成，手稿由他撰写;蒋勇，王玉青，罗倩倩，赵鑫，易若坤对数据分析有贡献;张欣设计并指导了这项研究，并阅读了最终的手稿。

致谢

本研究部分得到了重庆市教委科技研究项目（KJQN201900104）、重庆市自然科学基金项目（cstc2019jcyj-msxmX0648）、院士领导的重庆市科技创新指导项目（cstc2017jcyj-yszx0001）的支持，重庆市重大疾病防治技术项目（2019ZX002）和重庆教育大学重庆功能食品协同创新中心科研平台建设。

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