文摘
心磷脂过氧化(CL)的线粒体膜各种病态的发展中扮演着重要角色,可能是老化。的四个脂肪酸反面CL通常多不饱和,这使得CL过氧化反应特别敏感。过氧化的CL参与细胞凋亡的启动,以及其他一些重要的细胞信号链。然而,CL过氧化反应的研究强烈的限制缺乏在活细胞的跟踪方法。我们合成一个新的mitochondria-targeted荧光探针对脂质过氧化(称为MitoCLox),那里的BODIPY荧光团,携带diene-containing一部分(如C11-BODIPY(581/591)探针),与triphenylphosphonium阳离子共轭(TPP+)通过一个长灵活的链接器,包含两个酰胺债券。MitoCLox氧化可以测量吸光度在588 nm的减少或增加荧光比率计模式在520/590 nm(排放)。CL-containing脂质体,MitoCLox氧化诱导了细胞色素c和发达与心磷脂氧化。泛太平洋伙伴关系+基于mitochondria-targeted抗氧化剂SkQ1,简化型,抑制氧化MitoCLox并发心磷脂的过氧化反应。分子动力学模拟的MitoCLox cardiolipin-containing膜显示关联的带正电的MitoCLox带负电荷的氯分子;的可氧化的二烯MitoCLox居住在同一深度的一半心磷脂脂质过氧化物。我们建议MitoCLox可用于监测氯氧化体内,由于其灵活的连接器,也作为一个生产平台特定的脂质过氧化反应传感器与亲和力。
1。介绍
线粒体,来源的活性氧(ROS),是氧化损伤的主要目标。内线粒体膜脂质过氧化(IMM)特别敏感(法律流程外包)因为它港口ROS-producing呼吸酶和容易可氧化的脂质如心磷脂。特定的心磷脂过氧化反应,只位于内线粒体膜,可以发挥重要的作用在一些细胞内信号通路的调控和凋亡[1- - - - - -3]。过度法律流程外包的线粒体膜可以明显导致各种疾病和衰老。因此,预防法律外包由mitochondria-targeted membranophilic抗氧化剂治疗高和抗衰老的力量4- - - - - -6]。
研究心磷脂过氧化反应的缺失意味着却阻碍了在实时跟踪它。目前,这种分析需要色谱和质谱技术(7]。我们的目标是获得一个cardiolipin-specific荧光法律流程外包探针(s)。这样的探测器应该能够积聚在线粒体和CL特定亲和力。早些时候,首相和他的同事们开发了一种mitochondria-targeted荧光提供法律服务外包的探针,MitoPerOx [8]。在这个调查中,BODIPY(581/591)一部分与membrane-penetrating共轭triphenylphosphonium (TPP)阳离子丙酰氨乙基链接器(8]。一般来说,TPP-carrying化合物选择性地积聚在线粒体推动了线粒体膜电位(160 - 180 mV,消极的内部)9]。在过去的几十年,TPP+根提供不同的抗氧化剂和荧光探针应用到线粒体(5,10,11]。MitoPerOx被证明积聚在线粒体和脂质过氧化(报告8]。
我们还在广泛使用的荧光传递法律外包探针C11-BODIPY(581/591),由一个BODIPY荧光团轴承共轭二烯基过氧化反应和C11-hydrocarbon尾巴敏感膜锚(12]。二烯的氧化导致荧光发射的强劲增长在520纳米,而初始荧光在590 nm减少。这些属性允许应用程序的C11-BODIPY(581/591)比率计染料。此外,我们被鼓励比尔克和同事的数据表明,SS-20肽(板式换热器-D-Arg-Phe-Lys-NH2)可以进入线粒体和选择性目标CL (13]。因为CL是主要的带负电荷的线粒体膜磷脂,妄想MitoPerOx和SS20与几个正电荷可以显示一个特定亲和力心磷脂和报告其氧化。事实上,正是表明TPP-containing化合物有效取代分子N-nonyl吖啶橙(NAO),一个特定的心磷脂探针,从线粒体膜14]。心磷脂的关联可能导致心磷脂氧化的有效的预防TPP-containing quinolic抗氧化剂和大概衬底的高效TPP-based mitochondria-targeted抗氧化剂在各种生理模型2]。
在这里,我们描述了合成和表征的新mitochondria-targeted脂质过氧化反应探针MitoCLox, BODIPY(581/591)荧光团和TPP残渣共轭使用长灵活的链接器,包含两个模仿SS-20肽肽债券。这个连接器是目前我们所使用的支架插入额外的正电荷。MitoCLox报道CL细胞色素c-dependent氧化的脂质体,不干扰TPP-based mitochondria-targeted抗氧化SkQ1。分子动态模拟显示,MitoCLox的二烯残渣是旁边的脂质双分子层内局部心磷脂脂质过氧化物,因此应该有效地氧化脂质自由基。的在活的有机体内MitoCLox应用在活细胞线粒体法律流程外包的分析提出了在一个单独的文章(Lyamzaev et al。“小说MitoCLox荧光Mitochondria-Targeted调查报告Lipid-Mediated氧化应激反应”。氧化物地中海细胞Longev2019年,这个问题)。
2。材料和方法
2.1。化学合成的MitoCLox
从4-difluoro-5 MitoCLox合成——(4-phenyl-1, 3-butadienyl) 4-bora-3a 4 a-diaza-s-indacene-3-propionic succinimidyl酸酯(BODIPY581/591 SE)(生命表达载体技术)和{5 - [(4-aminobutyl)аmino] 5-oxopentyl}(三苯基溴化磷)(5)(图1)。
最初,三苯基膦(TPP, 1)(1.0克,3.8更易)与5-bromovaleric浓缩酸(2)(688毫克,3.8更易)12 h,享年85岁оС。产品(4-carboxybutyl)(三苯基溴化磷)(3)在硅胶纯化60使用chloroform-methanol混合物(4:1 (/)作为洗脱液给纯产品收益率为90% (1.51 g)。薄层色谱:Rf(chloroform-MeOH 4: 1) 0.30;质:τ (ACQUITY本·C18 ( ,1.7μ米列(水);0.5毫升/分钟,20毫米甲酸,梯度5 - 100% MeCN 3分钟);/计算出C23H24O2P+363.2,363.2,发现。
介绍了产品3(108毫克,0.25更易)反应叔丁氨基甲酸(4-aminobutyl)(4)(47毫克,0.25更易)在1.5 N的等价物,N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 78毫克,0.375更易)和2版的二异丙基乙胺(DIPEA, 0.085毫升,0.5更易)在二氯甲烷(1毫升,添加少量的DMF,直到完全溶解)为2 h在室温下冷却和12 h。反应混合物稀释20毫升的二氯甲烷和10毫升0.1盐酸水溶液。水层用二氯甲烷提取( );结合有机层是用水洗( ),5%的溶液NaHCO3( ),水( ),和饱和氯化钠( )在无水和干Na2所以4;和挥发物消失了在真空内。残留物从MeOH-diethyl醚结晶的混合物,和产品(化合物5)tert-butyloxycarbonyl导数是孤立于沉淀在硅胶柱洗脱溶剂系统二氯甲烷:甲醇,7:1。产量:100毫克(65%)薄层色谱:Rf( ,4:1)0.70;Rf(chloroform-MeOH-water 65: 25: 4) 0.65;质:τ (ACQUITY本·C18 ( ,1.7μ米列(水);0.5毫升/分钟,20毫米甲酸,梯度5 - 100% MeCN 3分钟);/计算出C32H42N2O3P+533.2,533.29,发现。27毫克(0.044更易)产品0.5毫升的98%甲酸是补充道。混合物在室温下搅拌6 h,然后消失了在真空内。残留是溶解在少量的甲醇和醚。导致沉淀离心,干燥在真空内给纯化合物5作为厚无色油和88%的收益率(20毫克)。薄层色谱:Rf(氯仿-甲醇-水NH 25%365:25:4)0.10,Rf水NH (chloroform-MeOH-water-ethyl醋酸- 25%3336:130:17:5:10)0.17;Rf(chloroform-MeOH-water 65: 25: 4) 0.30;质:τ (ACQUITY本·C18 ( ,1.7μ米)列;0.5毫升/分钟,20毫米甲酸,梯度5 - 100% MeCN 3分钟);/计算出C27H34N2OP + 433.2,发现433.4。
MitoCLox,合成的化合物5的解决方案(3.2毫克,6.15μ摩尔)碳酸氢钠缓冲(0.1 N, pH值9.2,0.2毫升)被添加到解决方案BODIPY581/591 SE(2.0毫克,4.1μ摩尔)N-methylpyrrolidone(0.2毫升)。混合物在室温下保存2 h的黑暗,和0.1 M盐酸加入调整pH值7.0。产品与二氯甲烷提取( ),用水洗( ),在真空干燥,蒸发,在硅胶使用chloroform-methanol混合物分离(7:1 (/)作为洗脱液。纯产品三苯基(5 - {[4 - (4,4-difluoro-5——(4-phenyl-1, 3-butadienyl) 4-bora-3a 4 a-diaza-s-indacene-3 - (propionylamino)丁基]氨基}5-oxopentyl)磷氯(MitoCLox)得到一个蓝色固体收益率为80%(2.8毫克)。在某些情况下,使用C18柱(执行额外的净化 ,5μ米珠大小)在5毫升/分钟的流量在20 - 80%梯度0.01%的乙腈水组织20分钟( )。薄层色谱:Rf(chloroform-MeOH 4: 1) 0.65;Rf(chloroform-MeOH 7: 1) 0.29;紫外线(甲醇): ,347海里,334海里;荧光(EtOH): , ;质:τ (ACQUITY本·C18 ( ,1.7μ米)列;0.5毫升/分钟,20毫米甲酸,梯度5 - 100% MeCN 3分钟);/计算出C49H51男朋友2N4O2P+,807.38,807.59;1H NMR(500.13兆赫,CDCl3)δ0.91 ppm (m, 8 h、31、32、38、39), 1.11 - -1.79 (m, 8 h, 25日,22日,29日,34岁,37),3.19 - -3.79(33米,6 h, 30日,40),6.41 - -7.23 (m, 9 h, 13 - 16, 14日,15日,19日,21日,22日),7.41 (m, 5 h,在18到22岁),7.78 (m, 15 h, 43-47,调查55-59)。13C {1H} -JMOD NMR(125.76兆赫,CDCl3)δ29.51 ppm (d, 1 c, ,40)、29.71 (32 s, 4 c, 31日,38岁的39),31.94 (1 c, 25), 38.16 (2 c, 26日37),59.54 (2 c, 30日,33),118.22 (d、3 c、 ,42,48岁,54),124.81 (s, 2 c, 5、8), 125.46 - -130.02 (m, 9 c, 3、4、9、10、12、13 - 16), 126.15 (1 c, 17), 128.20 (2 c, 2、11), 130.79 (m, 6 c, 43岁,47岁,49岁,53岁,55岁,59),134.30 (m, 3 c, 45岁,51岁,57),135.27 (m, 6 c, 44岁,46岁,50岁,52岁,56岁的58),173.93 (b 2 c, 27岁,35)。
2.2。心磷脂脂质体的制备
脂质体是由挤压,基于该方法的希望和同事(15,16),类似于我们的先前的研究(17]。脂质体被暂停的CL准备牛心(美国雪花石膏两代情极性脂质Inc .)作为一个粉5分钟3毫克/毫升的涡流在50 mM钠磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)包含0.1毫米diethylenetriaminepentaacetic酸(缓冲)来绑定可能金属的痕迹。脂质体得到miniextruder配备两个注射器(两代情),每个1毫升卷;膜的孔隙直径100纳米(两代情)使用。齐次脂质悬架是通过膜19倍。脂质体样本存储在冰上,直到在同一天中使用。
2.3。氯氧化的脂质体
氯氧化是由细胞色素c (CytC)从马的心(Sigma-Aldrich,猫。不。C2506)。脂质体在缓冲区在最后CL浓度的0.1毫米与CytC孵化(1μ在37米)oC 3毫升石英试管内uv - 2450分光光度计(日本岛津公司、东京、日本)配备了珀尔帖热电偶。氧化氯被吸光度的变化监测在234 nm对应于共轭双烯的形成(18,19]。共轭二烯烃的摩尔吸光系数的值为274001厘米1。SkQ1也吸收紫外线范围(最大267海里),这吸光度降低SkQ1H减少2;然而,“氧化-还原”光谱isosbestic点接近234海里,因此并没有导致吸光度的变化在234海里。波长的光谱记录每5分钟210 - 600 nm和参考电池含有相同的组件,除了CytC。SkQ1, MitoCLox,另增加了两院最初或者30分钟后开始实验。
减少相应的对苯二酚(SkQ1H SkQ12),2 - 3毫克干硼氢化钠在乙醇添加到1 - 2毫米SkQ1解决方案。还原剂的过剩是被一个小的发烟量HCl其次是至少两个离心15800 g(5分钟)去除硼酸钠颗粒。减少SkQ1H2储存在−80°C到使用。
2.4。分子动态模拟
对于分子双层膜的动态建模,我们使用磷脂成分接近内线粒体膜(20.]:1-palmitoyl-2-linoleoyl-phosphatidylcholine (PLPC) 1-stearoyl-2-linoleoyl-phosphatidylcholine (SLPE) 1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholine (POPC)和tetralinoleoyl cardiolipin-cardiolipin (TLCL)混合比例的7:21:7:8。最初的结构与CHARMM-GUI服务器准备(21]。我们使用了CHARMM36力场模拟[22]。染料的力场是得到的从头开始密度泛函理论(DFT)计算进行了萤火虫包(23)使用我基础设置和B3LYP5功能。包进行能量最小化在离域坐标建立内部坐标的线性组合,与旋转角度约束,优化子空间向量做形式的决定可能会影响计算的能量。因此,我们把协议以及由此产生的旋转电影在每一步计算坐标(看某某电影文件)在Github存档(https://git.io/JevG6)。
部分指控来自量子化学计算是实现力场。此外,我们参数化二面角角度约二烯碳原子之间的键(C13-C14、C14-C15 C15-C16图1)phenyldiene尾巴。我们计算势能面和适合二面角参数复制分子动力学(MD)模拟。生产MD模拟2 - f一步NPT合奏大约1000纳秒;前面的平衡MD模拟约100 ns。
模拟CL mono-hydroperoxides,我们建模8变种的氧化分子。有四种变体的氢过氧化物亚油酸(24]:(1)13-Hydroperoxy - (E,E13)-octadeca-9 11-dienoic酸(“ee”)(2)13-Hydroperoxy - (Z,E)-octadeca-9 11-dienoic酸(“13泽”)(3)9-Hydroperoxy - (E,E)-octadeca-10 12-dienoic酸(9 ee)(4)9-Hydroperoxy - (E,Z)-octadeca-10 12-dienoic酸(9 ez)
CL可以携带氧化glycero-1-acid或者glycero-2-acid mono-peroxidized CL变异的总量等于八。
CHARMM力场的补充,我们执行从头开始计算下面的小分子:(1)7-Peroxy - (E, E)-nona-3 5-diene(2)7-Peroxy - (Z, E)-nona-3 5-diene
在这两种分子,我们计算部分费用和二面角C3-C4-C5-C6势能概要文件。
使用派生的分子,我们构造了两种模型膜:有四个变异的CL与过氧化氢在第九的位置和四个变异的过氧化13号的位置。
档案与MD模拟结果沉积在GitHub:https://github.com/comcon1/MitoMDMembranes。
3所示。结果与讨论
3.1。合成
MitoCLox合成4-difluoro-5 - (4-phenyl-1, 3-butadienyl) 4-bora-3a 4 a-diaza-s-indacene-3-propionic succinimidyl酸酯(BODIPY581/591 SE,表达载体的生命技术),{5 - [(4-aminobutyl)аmino] 5-oxopentyl}(三苯基溴化磷(图)1)。MitoCLox合成water-organic混合物(N-methylpyrrolidone / 0.1 N碳酸氢钠,pH值9.2)在室温下2 h硅胶净化后的80%的收益率。结构确认与1 h和13 c NMR谱。
的荧光光谱MitoCLox(减少和氧化形式)在脂质体(图测量2)和C11-BODIPY581/591(没有什么区别8]。
3.2。MitoCLox心磷脂脂质体氧化
氯氧化脂质体是由细胞色素c (CytC)和监控通过吸光度的变化对应于234纳米的形成共轭双烯(17,25]。的氧化MitoCLox注册通过减少吸光度在581纳米(图3MitoCLox荧光(图)或变化2和4)。吸光度测量仪器,因为他们允许我们同时遵循染料的氧化和共轭二烯烃的积累。荧光光谱的变化MitoCLox没有差别的C11-BODIPY581/591表明探测器由脂质自由基氧化的产品是相似的。动力学MitoCLox吸光度变化,共轭二烯的形成以相同的动力学分析中线性至少50分钟后添加CytC(数字3 (c)和3 (d))。在这些实验中,大约有20%的氯氧化。这些数据表明MitoCLox氧化成正比CL氧化多种氧化CL / CL比率减少。这些观察结果还表明,在反应活性氯自由基的生成CytC远远低于CL二烯轭合物的形成和MitoCLox氧化。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(一)
(b)
(c)
我们应用MitoCLox CL-containing脂质体的各种抗氧化剂的分析。发现tert-butylhydroquinone(特丁基对苯二酚)有效地防止MitoCLox CytC引起的氧化(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。之后特丁基对苯二酚,共轭二烯烃不再形式(数据3(一个)和3 (c)在581 nm)和吸光度的MitoCLox并没有改变(数据3 (b)和3 (d))。
重要的是添加MitoCLox并不影响氯的氧化证实了监测共轭双烯的形成(数字3 (e)和3 (f))。这些数据表明,MitoCLox干扰交互的CytC CL和回收罂过氧化自由基在CL显著的程度。
图4显示荧光的变化MitoCLox在暂停CL脂质体过氧化反应被添加CytC诱导。Mitochondria-targeted抗氧化剂SkQ1有效地阻止了进一步MitoCLox CytC引起的氧化(cf数据4(一)和4 (b))。在控制实验中,氧化醌的SkQ1形式并不影响MitoCLox氧化(图4 (c))。这些数据表明,阳离子TPP的残渣SkQ1并不影响与CL MitoCLox之间的交互。
3.3。分子动态模拟
二烯烃在BODIPY581/591 phenyl-butadienyl残渣被chain-propagating氧化物种,特别是衍生品的多不饱和脂肪酸(PUFA)包括罗⋅和厕所⋅(26]。因此,我们研究了染料的分布模型中线粒体膜的所有原子分子动态模拟。
从头开始的势能表面(PES)扫描MitoCLox分子进行使用轻松扫描方法实现在萤火虫诉8 +中描述的材料和方法。假设一个轻松的表面扫描给了低能量的值比一个简单的表面扫描,和由此产生的值更接近实验的。
建立力学模型包括新的二面角角度,我们首先计算费用的职责的过程。我们计算费用PDT-BODIPY部分(a)和(b)部分TPP分子分别(图5)。然后,我们适应二面角参数使MD势能概要接近从头开始概要文件。医学概要文件被旋转脚本验证沉积在Github (https://git.io/JevGX)。这个脚本执行一个轻松扫描在MD由以下步骤:(1)固定在某个值感兴趣的角度,(2)执行能量最小化的角固定,(3)执行机械能一步计算的动态运行,和(4)重复步骤(1)和一个新的角度值。
(一)
(b)
只有灵活的一部分疏水片段是butadienyl BODIPY核心和苯基之间的间隔。我们的从头开始计算表明,一些单键(图相对灵活6),这些债券可以改变周围的二面角在50度的范围内2 kt能量范围。这些从头开始结果衬底染料的MD模型;因此,古典模型相一致的行为量子估计。
(一)
(b)
分析共同安排MitoCLox和周围的脂肪(尤其是CL),我们模拟染料的双分子层复杂的成分,像内线粒体膜(20.]。tetra-linoleoyl-cardiolipin组成的双层模型(TLCL)和主要的两性离子磷脂胆碱和乙醇胺组负责人(有关详细信息,请参阅材料和方法)。图7说明了一些系统组件的密度分布沿着正常的双分子层平面。的疏水phenyl-butadienyl侧链(绿色短划线)位于该地区的酰脂质残留而BODIPY核心,链接器,TPP+(红色dash-dotted曲线)占据了极性脂质组地区负责人脂/水界面。深度的二烯碳密度分布MitoCLox(蓝色短划线)明显重叠的分布TLCL双键(灰色虚线),过氧化自由基的目标。密度分布的分析MitoCLox部分沿着正常的双层飞机表明染料是l型。phenyl-butadienyl侧链是面向大约沿着正常的双分子层平面,而链接器住在飞机的膜。同意这个结论,分子动态模拟显示MitoPerOx相似的密度分布(短链接器,看到8)在同一膜(没有显示)。
此外,我们检查的深度分布模型中氢过氧化物根的氧化膜,其中一个在每个CL亚油酸分子氢过氧化物。我们分别模拟膜含CL与氢过氧化物在9日或者13号位置(图8)。C9-hydroperoxide显示更多的重叠的深度分布的分布可氧化的二烯在MitoCLox C13-hydroperoxide,这表明氢过氧化物在第九的位置应该更有效率MitoCLox的氧化。
(一)MitoCLox CL-9hyp
(b) MitoCLox CL-13hyp
研究染料的相互作用与不同的脂质,我们分析了CL的横向分布和最常见的磷脂1-stearoyl-2-linoleoyl-phosphatidylethanolamine (SLPE)与染料(图9)。上面图的中心,附近的分布phenyl-butadienyl侧链(光绿点)和TPP(灰色现货)所示。我们观察到一个高度密集区附近的CL(橙色)MitoCLox指示一定亲和力的染料CL。相比较而言,与SLPE高度密集的区域(深绿色斑点)从染料大多位于远离地表明没有一个特定的亲和力SLPE与染料之间。同样的效果清晰可见的情节TPP的磷原子径向分布函数和C2甘油氯原子。这个情节MitoCLox显示了峰值在25 ~ SLPE和高峰在7 ~ TLCL(图9 (b))。非常相似的横向分布的MitoCLox CL和SLPE模型中也观察到氧化的双分子层(没有显示)。
(一)
(b)
相对刚性BODIPY-butadienyl部分,MitoCLox的结构更加灵活连接器地区相比与MitoPerOx(图10)。如此高的脂质双分子层的链接器的灵活性可能重要的交互CL内分子阻挡呼吸supercomplexes内部的线粒体膜(27]。
4所示。结论
在这里,我们表明,MitoCLox可靠报道的氯氧化膜,与此同时,不淬火脂质自由基的传播。可以防止氧化MitoCLox mitochondria-targeted抗氧化剂的氧化与CL。观察氧化SkQ1并不影响氧化的MitoCLox表明MitoCLox,在活的有机体内实验中,可以结合其他TPP+携带荧光探针没有危险的干扰探测器MitoCLox之间的交互和CL。
MD模拟的结果表明,TPP+群MitoCLox位于附近的地区CL高密度双分子层。MD模拟的结果表明,MitoCLox可以可靠地,最有可能的,特别是与CL激进分子在膜过氧化反应。更高的灵活性MitoCLox与MitoPerOx相比甚至可以使其相互作用与CL内分子阻挡呼吸supercomplexes [3,25,28- - - - - -30.]。
数据可用性
web档案参考数据用于支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
没有利益冲突。
确认
非常有用的与教授讨论副总裁Skulachev非常感激。支持的工作是格兰特从俄罗斯科学基金会(17-14-01314号),以及俄罗斯总统奖学金(5511.2018.4)(飞行员)。K.L.要感谢德国学术交流服务(德意志)及其Ostpartnerschaften方针的支持。分子动态模拟部分支持的俄罗斯基础研究基金会(批准号17-00-00088)。实验用CL脂质体被德国研究基金会(DFG)支持(项目# STE640/15 H.-J.S)。我们承认德意志Forschungsgemeinschaft的支持(DFG)和奥斯纳布吕克大学的开放获取出版基金。SMP计算机上的模拟进行了生物物理学和计算机科学分工的复杂系统的生物物理学(学校的生物学,罗蒙诺索夫莫斯科国立大学)。