文摘

骨肉瘤是最常见的诊断原发性恶性骨肉瘤在儿童和青少年。最近的研究表明,癌症干细胞(二者),一个集群的肿瘤细胞自我更新的能力,起着关键作用在肿瘤复发和转移。因此,有必要开发专门针对二者的治疗策略。2型糖尿病的一线药物二甲双胍,展品在各种肿瘤的抗肿瘤药活动。新的证据表明,二甲双胍可能目标二者并防止其复发。然而,潜在的具体机制尚不清楚。在这项研究中,我们发现二甲双胍显著抑制骨肉瘤干细胞的自我更新能力(osc)和诱导G0 / G1期逮捕通过阻断细胞周期蛋白依赖性激酶的活性。此外,二甲双胍通过mitochondria-dependent通路诱导细胞凋亡,导致线粒体跨膜电位的崩溃和活性氧(ROS)的生产。重要的是,二甲双胍直接作用于线粒体,导致ATP合成减少。这种变化允许访问下游AMPK激酶,和领导的AMPK激活的反转mTOR通路,从而引发自噬。 Particularly, metformin-mediated autophagy disturbed the homeostasis of stemness and pluripotency in the OSCs. Additionally, our mouse xenograft model confirmed the potential therapeutic use of metformin in targeting OSCs. In conclusion, our findings suggest that metformin suppresses the self-renewal ability and tumorigenicity of OSCs via ROS-mediated apoptosis and autophagy.

1。介绍

骨肉瘤,最常诊断原发性恶性肿瘤在儿童和青少年,特点是高患肺癌的风险转移和预后不良1]。尽管稳定癌症疗法的研究和开发进展,骨肉瘤的5年生存率仍一样,他们在1970年代(2]。癌症干细胞(二者),子群的肿瘤细胞自我更新的能力,起着关键作用在肿瘤复发和转移3]。研究表明,癌症的关键挑战是发生远处转移,其中二者发挥了主导作用[4]。因此,针对二者可能是一个有前途的未来的癌症治疗的策略。

二甲双胍,使用最广泛的药物治疗2型糖尿病,发挥抗肿瘤的活动绝大多数癌症(5- - - - - -7]。此外,大量研究表明,二甲双胍是一种很有前途的治疗对二者(8- - - - - -10]。自噬,必不可少的稳态过程对蛋白质降解,最近被确认为一种重要的监管机构在肿瘤发生[11]。进一步的研究表明,自噬可能调节药物敏感性和二者的多能性12]。然而,自噬在二者的角色很大程度上是未知的。了解这些角色,以及二者的分子机制维护,可能是肿瘤治疗的关键。

在这项研究中,骨肉瘤干细胞(osc)从K7M2 MG63骨肉瘤细胞系被孤立的两侧人口(SP)分析方法和无血清悬浮培养。K7M2和MG63 osc表达高水平的干细胞标记包括Sox2 Oct4, Nanog, CD44, CD133和ALDH1。同时,K7M2和MG63 osc有能力分化成成骨和chondrogenic血统。值得注意的是,二甲双胍治疗诱导细胞周期阻滞和减少的可行性K7M2和MG63 osc。此外,二甲双胍引发细胞凋亡K7M2和MG63 osc通过caspase-dependent线粒体凋亡通路,伴随着改变线粒体的形态结构和线粒体bcl - 2、Bax的平衡。最重要的是,我们发现自噬流量是在这些osc高于在他们父母的细胞。用二甲双胍治疗废除了K7M2多能性和MG63 osc的upregulation自噬通过AMPK / mTOR途径。当osc对待3-methyladenine马(3),一个自噬抑制剂,减少其具备干细胞特性。同样,也与自噬诱导物雷帕霉素治疗受损的多能性osc,废除他们具备干细胞。此外,二甲双胍治疗效果的进一步证实在小鼠体内轴承K7M2骨肉瘤异种移植。 This study suggests that metformin has promising anticancer activity in OSCs through regulation of autophagy.

2。材料和方法

2.1。药品、试剂、抗体

二甲双胍(D150959)、赫斯特33342年(14533),维拉帕米(V4629)、马3(189490),和雷帕霉素(553210)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,美国)。细胞线粒体隔离设备(C3601)、活性氧测定工具包(S0033) FITC-Annexin V /π凋亡检测设备(C1062L)、ATP测定工具包(S0026)和anti-p21 (AP021) anti-Cyclin D1 (AC853) anti-Cyclin D3 (AC856) anti-ATG5 (AF2269) anti-ATG7 (AA820)和anti-Nanog (AF1912)抗体购自Beyotime(海门,中国)。anti-Bcl-2 (ab182858), anti-Bax (ab182733) anti-active Caspase9 (ab2324) anti-active Caspase3 (ab2302) anti-cytochrome c (ab133504) anti-LC3 (ab48394) anti-Oct4 (ab181557) anti-Sox2 (ab97959) anti-Ki67 (ab15580) anti-AMPK (ab80039) anti-phospho AMPK (ab133448) anti-mTOR (ab134903) anti-phospho mTOR (ab109268)、CD105 (ab135528)和Stro-1 (ab106531)抗体来自Abcam(美国)。反β肌动蛋白(4967年代和E4D9Z)从细胞信号技术购买(丹佛,美国)。水户跟踪®红色CMXRos (M7512)和Lyso追踪红色dnd - 99 (L7528)获得热费希尔科学(美国沃尔瑟姆)。Alexa萤石®488鼠标/人类anti-Sox2抗体(656109),聚乙烯anti-mouse /人类Oct4抗体(653703),APC anti-mouse /人类CD44抗体(103011),APC anti-mouse CD133抗体(141207),和PE / Cy7反CD133抗体(372809)从Biolegend(美国圣地亚哥)。吖啶橙/溴化乙锭(AO / EB)是从Solarbio(中国,北京)。DAPI (BD5010)从Bioworld获得技术,Inc . DMEM (12800082), DMEM / F12(12400024),胎牛血清(的边后卫,10099 - 141),B27补充(17504044)、表皮生长因子(EGF, PHG0311),和基本的纤维母细胞生长因子(bFGF, 13256029)从Gibco购买(美国)。

2.2。动物

前不久雄性Balb / c小鼠获得第四军医大学。协议下所有实验过程进行了回顾和西北工业大学的伦理委员会批准。

2.3。细胞生存能力分析

的可行性K7M2和MG63 osc被CCK-8试验评估。简单地说,养殖K7M2和MG63 osc被播种到96 -微量滴定板的密度 细胞/好,用不同浓度的二甲双胍(0、6.4、12.8、25.6和51.2毫米)24 - 72 h。细胞被CCK-8处理解决方案,由断层和吸光度测量光谱(美国Bio-Rad)在570海里。K7M2和MG63细胞死亡的osc也是由染色与AO /π为10分钟。图像被使用蔡司倒置荧光显微镜(德国蔡司)。

2.4。细胞周期分析

的细胞周期分布K7M2和MG63 osc被流式细胞术进行评估。短暂,经过48小时的二甲双胍(0、6.4、12.8、25.6和51.2毫米)治疗,K7M2和MG63 osc收获和制成单细胞悬浮液由机械打击方法。细胞被固定,离心机,resuspended沾50毫克/毫升的π和0.5毫克/毫升的核糖核酸酶在黑暗中30分钟,然后分析了流式细胞术(BD流式细胞仪石中剑,美国)。

2.5。细胞凋亡检测

K7M2和MG63 osc被播种到90毫米文化板块的密度 细胞/好,用二甲双胍治疗(0、6.4、12.8、25.6和51.2毫米)48 h。细胞被收获,贴上FITC-Annexin V /π在室温20分钟根据指令。样品使用流式细胞仪进行分析(BD流式细胞仪石中剑,美国)。

2.6。人口(SP)测定

流式细胞术被用于识别描述的SP分数Steiniger et al。13]。总之,培养细胞使胰蛋白酶化和resuspended prewarmed DMEM孵化前5μg / mL赫斯特33342年孤独或50的存在μABC转运蛋白抑制剂维拉帕米的g / mL 90分钟37°C。细胞会通过一个100μ美国m筛网过滤器(BD)和排序的流式细胞仪咏叹调三世流式细胞分析仪(美国BD)配备赫斯特蓝375广泛通滤波器和赫斯特红675广通滤波器激光。收集整理SP细胞和使Sox2 Oct4、CD44, CD133, CD105, Stro-1流式细胞分析仪检测其具备干细胞。

2.7。醛脱氢酶(ALDH1)测定

K7M2和MG63 osc二甲双胍治疗6.4毫米,0.5毫米3 ma,二甲双胍,6.4毫米和0.5毫米3马在一起,或5μ米雷帕霉素48 h。分析了ALDH1-positive族群使用ALDEFLUOR分析工具包(干细胞技术、加拿大)。约 K7M2和MG63 osc收集和孵化ALDEFLUOR分析缓冲区为40分钟37°C。负控制样本处理50μM diethylaminobenzaldehyde (DEAB) ALDH1的抑制剂。之后,这些细胞被收获和resuspended ALDEFLUOR缓冲区并受流式细胞仪咏叹调三世流式细胞分析仪。

2.8。线粒体膜去极化

线粒体膜电位被水流动监测荧光染料(细胞技术公司,美国)。简单地说,大约 K7M2和MG63 osc孵化与显示二甲双胍的浓度(0、6.4、12.8、25.6和51.2毫米)48 h。细胞被染色和荧光染料30分钟和BD流式细胞仪检测到石中剑流式细胞分析仪。

2.9。活性氧(ROS)检测

ROS通过测量被检测出dichloro-dihydro-fluorescein氧化乙酰乙酸盐(DCFH-DA)使用活性氧化验设备。细胞在50% -60% confluency孵化与二甲双胍(0、6.4、12.8、25.6和51.2毫米)48 h,然后处理10μM的30分钟DCFH-DA 37°C在黑暗中。细胞被洗了,收获前使用流式细胞仪分析咏叹调三世流式细胞分析仪。

2.10。测量细胞内ATP

细胞内ATP含量是决定使用一个ATP测定设备根据制造商的指示。总之,K7M2和MG63 osc种植在96 -孔板和二甲双胍治疗(0、6.4、12.8、25.6和51.2毫米)48 h。细胞细胞溶解的ATP提取缓冲和离心收集上层的。当时上层清液混合稀释缓冲含有荧光素酶和衡量频谱断层(美国Bio-Rad)。

2.11。实时聚合酶链反应

总RNA提取metformin-treated osc的试剂盒试剂(美国表达载体)。孤立的RNA是反向转录成互补脱氧核糖核酸RT试剂配套使用的脚本(豆类生物技术,中国)。引物是从Sangon获得生物技术(上海,中国)。定量PCR进行使用IQ5实时PCR系统(美国Bio-Rad) 20μL反应体积。引物的序列如下:人类P21:5 - - - - - -AGCAGCGGAACAAGGAGT-3(意义)和5 - - - - - -CGTTAGTGCCAGGAAAGACA-3(反义);鼠标P21:5 - - - - - -GACAAGAGGCCCAGTACTTC-3(意义)和5 - - - - - -TAGAAATCTGTCAGGCTGGT-3(反义);人类细胞周期蛋白D1:5 - - - - - -TCTCCAAAATGCCAGAGGCG-3(意义)和5 - - - - - -AGGAAGTTGTTGGGGCTCCT-3(反义);鼠标细胞周期蛋白D1:5 - - - - - -CGGATGAGAACAAGCAGACC-3(意义)和5 - - - - - -GCAGGAGAGGAAGTTGTTGG-3(反义);人类细胞周期素D3:5 - - - - - -AGGGATCACTGGCACTGAAG-3(意义)和5 - - - - - -ACAGGTGTATGGCTGTGACAT-3(反义);鼠标细胞周期素D3:5 - - - - - -CTATGAACTACCTGGATCGCTACCT-3(意义)和5 - - - - - -CAGACGGTACCTAGAAGCTGCAA-3(反义);人类SOX2:5 - - - - - -AACCCCAAGATGCACAACTC-3(意义)和5 - - - - - -CGGGGCCGGTATTTATAATC-3(反义);鼠标SOX2:5 - - - - - -GCGGAGTGGAAACTTTTGTCC-3(意义)和5 - - - - - -GGGAAGCGTGTACTTATCCTTCT-3(反义);人类OCT4:5 - - - - - -GCTCGAGAAGGATGTGGTCC-3(意义)和5 - - - - - -CGTTGTGCATAGTCGCTGCT-3(反义);鼠标OCT4:5 - - - - - -CGGAAGAGAAAGCGAACTAGC-3(意义)和5 - - - - - -ATTGGCGATGTGAGTGATCTG-3(反义);人类NANOG:5 - - - - - -CAAAGGCAAACAACCCACTT-3(意义)和5 - - - - - -TCTGCTGGAGGCTGAGGTAT-3(反义);鼠标NANOG:5 - - - - - -TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3(意义)和5 - - - - - -CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3(反义);人类ATG5:5 - - - - - -新泽西州AGCAACTCTGGATGGGATT-3(意义)和5 - - - - - -CCATCTTCAG GATCAATAGCAGAAG-3(反义);鼠标ATG5:5 - - - - - -GTGCTTCGAGATGTGTGGTTTGGA-3(意义)和5 - - - - - -CGTCAAATAGCTGACTCTTGGCAA-3(反义);人类ATG7:5 - - - - - -GGTCAAAGGACGAAGATAACA-3(意义)和5 - - - - - -GGTCACGGAAGCAAACAACT-3(反义);鼠标ATG7:5 - - - - - -GCTAATGGACACCAGGGAGA-3(意义)和5 - - - - - -AAAAAGTGAGGAGCCCAGGT-3(反义);人类GAPDH:5 - - - - - -TTGATGGCAACAATCTCCAC-3(意义)和5 - - - - - -CGTCCCGTAGACAAAATGGT-3(反义);和鼠标GAPDH:5 - - - - - -CAACAGCAACTCCCACTCTTC-3(意义)和5 - - - - - -GGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT-3(反义)。

2.12。免疫印迹

线粒体的提取线粒体隔离设备根据制造商的指示。孤立的线粒体或细胞溶解里帕缓冲含有蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂(Beyotime,中国)和由bicinchoninic酸测定(Beyotime,中国)。30毫克的蛋白质是装上sds - page,电泳分离,转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。膜被封锁的1%牛血清白蛋白(BSA),孵化与主要抗体,用TBST缓冲区,然后孵化HRP-conjugated二级抗体(博士德,中国)。免疫印迹图像拍摄和量化使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)。乐队的强度测定和规范化β肌动蛋白。

2.13。肿瘤领域分析

K7M2和MG63 osc二甲双胍治疗6.4毫米,0.5毫米3 ma,二甲双胍,6.4毫米和0.5毫米3马在一起,或5μ米雷帕霉素48 h。肿瘤引起球体6-well超低贴壁培养板(美国康宁公司)。K7M2 MG63细胞被播种密度 细胞在无血清DMEM / F12培养基补充1×B27, 10 ng / mL EGF, 10 ng / mL bFGF。肿瘤领域形成量化最初播种后7天内通过与0.1%结晶紫染色(美国Sigma-Aldrich)和成像与倒置显微镜(日本奥林巴斯)。

2.14。免疫组织化学(包含IHC)和免疫荧光(如果)

包含IHC,肿瘤组织是收获,固定,脱水,石蜡嵌入式,切成4μ米的部分。片被沾hematoxylin-eosin())和包含IHC LC3 ATG5, Ki67 Sox2, Oct4。如果,细胞和4%多聚甲醛固定,阻止了1% BSA,然后孵化在初级抗体在一夜之间在4°C。细胞被洗与磷酸盐(PBS)和孵化fluorescence-labeled二级抗体在黑暗中在室温下。图像被使用一个FSX100显微镜(日本奥林巴斯)或一个FV10i共焦激光扫描显微镜(日本奥林巴斯)。

2.15。分化osc的潜力

K7M2和MG63 osc /没有二甲双胍处理在一个商业成骨和chondrogenic分化培养基培养(Cyagen,中国)6-well细胞培养板三个星期。这些细胞被然后用4%多聚甲醛固定和染色茜素红(Cyagen,中国)检测成骨分化和阿尔新蓝(中国Cyagen) chondrogenic分化。图片使用FSX100显微镜拍摄(奥林巴斯、日本)。

2.16。透射电子显微镜(TEM)

TEM检测、细胞与不同治疗固定2%磷钨酸,放到formvar铜/碳涂层网格网格,然后在室温下晾干。图片与日立HT7700透射电子显微镜拍摄(日立、日本)。

2.17。扫描电子显微镜(SEM)

osc是和2.5%戊二醛固定,在乙醇脱水,干在临界点,然后放在铜网格。标本被使用日立SU8010成像扫描电子显微镜(日立、日本)。

2.18。骨肉瘤的原位Intratibial小鼠模型

经过预处理的6.4毫米二甲双胍48 h,大约 , ,或 的K7M2 osc停牌30μL PBS和植入雄性Balb / c小鼠的胫骨intratibial注入。小鼠麻醉,左腿膝盖,举行,针插入胫骨粗隆使用钻井运动。2周后,小鼠安乐死,肿瘤体积和重量测定( )。为了进一步评估metformin-mediated自噬在肿瘤发生的影响,大约 的K7M2 osc悬浮在30岁μL PBS的胫骨注入雄性Balb / c小鼠。当肿瘤体积达到100毫米³,然后小鼠随机分为5组,接收(1)PBS的腹腔内注射,(2)250毫克/公斤/天二甲双胍与PBS稀释14),(3)15毫克/公斤/天3 ma与PBS稀释15),(4) 马3,(5)1毫克/公斤/天雷帕霉素与PBS稀释16]。老鼠被杀死后21天,肿瘤被移除,称重,并受LC3包含IHC染色,ATG5, Ki67 Sox2, Oct4。

2.19。统计分析

数据分析使用GraphPad棱镜(GraphPad软件公司,美国)。统计分析是由独立的样本 - - - - - -测试比较两组或组之间的单向方差分析。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。自噬流量在osc增强

我们从K7M2和孤立的osc MG63骨肉瘤细胞系的哪一边人口(SP)表型显示作为一个尾巴分开完成人口图特征1(一)。K7M2和MG63 SP细胞的平均比例为1.25%和1.07%,分别和SP细胞下降到0.2%和0.2%在与维拉帕米治疗,ABC转运蛋白的抑制剂。确定基底的自噬水平通量之间的不同一般的骨肉瘤细胞及其osc,我们首先通过TEM观察到自噬体。如图1 (b),自噬小体的数量显著增加比non-SP细胞SP细胞,表明K7M2和MG63 osc基底自噬流量更高。此外,从K7M2 osc MG63骨肉瘤细胞通过无血清悬浮培养7天,成功地分离和肿瘤领域形成作为显示在图1 (c)。进一步描述领域及其亲代细胞,具备干细胞和自噬属性进行了研究。如图1 (d),球从K7M2和MG63细胞蛋白质表达水平较高的多能转录因子包括Sox2 Oct4, Nanog,以及高水平的autophagy-associated蛋白质LC3-II ATG5, ATG7。实时PCR(图1 (e))还透露,球面K7M2和MG63细胞多能性基因的mRNA水平较高SOX2,OCT4,NANOG和autophagy-related基因ATG5和ATG7。Immunofluorescent染色试验(图1 (f))确认K7M2和MG63 SP细胞有较强的荧光斑点状的结构比non-SP LC3-II细胞,表明在osc更高水平的自噬。确定SP细胞的分化能力,他们培养的胶粘剂成骨的chondrogenic分化的介质中,文化系统为3周。SP细胞在DMEM / F12培养基培养作为控制。如图1 (g)K7M2和MG63 osc被发现有更多的钙结节性和蛋白多糖比non-SP口供的细胞,这表明osc经历了骨和软骨形成。这些结果表明,osc有能力分化成成骨细胞和软骨细胞。此外,多能转录因子Sox2 Oct4和CSC标记CD44、CD105, CD133和Stro-1 K7M2和MG63 SP细胞中高度表达比non-SP细胞(图1 (h)),这表明二者的SP细胞的特征。此外,我们发现没有区别在CD44的生物标记物,CD133, CD105, Stro-1 sphere-forming之间从K7M2和MG63细胞和SP细胞(图S1)。因此,在接下来的实验中,我们使用sphere-forming细胞。

3.2。二甲双胍在K7M2诱导细胞周期阻滞和MG63 osc

剂量和时间的减少细胞观察二甲双胍治疗后生存能力图2(一个)。二甲双胍的half-maximal抑制浓度(IC50) 48 h 为K7M2 osc和 为MG63 osc(图2 (b))。流仪分析被用来检查二甲双胍对细胞周期的影响。二甲双胍浓度增加治疗48 h的积累导致细胞G0 / G1期和减少在S期细胞的数量(数字2 (c)和2 (d))。实时PCR(图2 (e))和免疫印迹分析(数据2 (f)和2 (g))清楚地表明,细胞周期调控基因的表达水平和细胞周期蛋白D1蛋白和细胞周期素D3下调K7M2和MG63 osc二甲双胍治疗后,虽然P21调节。这些结果表明,二甲双胍在osc诱导细胞周期阻滞在体外通过阻断G0 G1过渡。

3.3。二甲双胍激活ROS-Mediated线粒体途径诱导细胞凋亡

细胞凋亡通常与线粒体功能相关,我们首先评估了二甲双胍对osc的线粒体形态的影响。用二甲双胍治疗48 h导致变化的管状网络形态的解体线粒体网络,减少线粒体分支(图3(一个))。评估线粒体膜电位的变化由于二甲双胍治疗,细胞受到水户流荧光染料。如图3 (b),metformin-treated细胞线粒体膜极化降低剂量依赖性的方式。此外,细胞内ATP浓度大幅下降二甲双胍治疗后48 h(图3 (c))。我们接下来探索是否metformin-mediated凋亡影响的函数ROS osc中的调制。如图3 (d)免疫荧光分析显示,osc用二甲双胍治疗48 h与对照组相比有更高的荧光强度,表明活性氧水平升高在二甲双胍治疗。此外,流仪结果图3 (e)还表示,二甲双胍治疗48小时显著增加了活性氧在剂量依赖性的方式生产。然而,N-acetyl-L-cysteine (NAC)部分逆转metformin-induced ROS浓度的增加。此外,二甲双胍的proapoptotic影响进行评估的FITC-Annexin V /π凋亡检测设备。如数据所示3 (f)和3 (g),二甲双胍诱导细胞凋亡K7M2和MG63 osc剂量依赖性的方式。免疫印迹分析(数据3 (h)和3(我)bcl - 2)显示,二甲双胍治疗减少凋亡,增加proapoptotic伯灵顿K7M2和MG63 osc,证实二甲双胍osc诱导细胞凋亡。此外,发现二甲双胍刺激易位线粒体细胞色素c的胞质和移植Caspase3激活Caspase9和激活。综上所述,这些研究结果表明,二甲双胍在osc主要是通过诱导细胞凋亡ROS-mediated线粒体功能障碍的途径。

3.4。二甲双胍损害具备干细胞和osc的多能性

球的形成进行了分析评估的具备干细胞特征K7M2和MG63 osc。球体的数量显著减少剂量依赖性的方式相比,二甲双胍治疗后控件(数字4(一)和4 (b))。探讨二甲双胍对osc的多能性的影响,sphere-forming K7M2和MG63细胞培养的成骨的chondrogenic诱导分化的介质中,有或没有二甲双胍。骨(图4 (c)和4 (d)和软骨形成的数字4 (e)和4 (f))经钙和蛋白聚糖的沉积。结果表明,二甲双胍降低osc的多能性能力分化成成骨细胞和软骨细胞的剂量依赖性的方式。进一步评价二甲双胍对osc的具备干细胞特性的影响,CSC标记CD44、CD105, CD133和Stro-1也通过流式细胞术(图4 (g))。CD105,正如所料,CD44的表达CD133,和Stro-1下调后osc二甲双胍治疗剂量依赖性的方式,表明二甲双胍可能抑制osc的具备干细胞。

3.5。二甲双胍通过AMPK / mTOR通路调节自噬

二甲双胍治疗导致剂量依赖性激活AMPK磷酸化(p-AMPK)在K7M2 osc(图5(一个))和MG63 osc(图5 (b))。进一步的调查显示,二甲双胍抑制mTOR的磷酸化(p-mTOR), mTOR的长期失活,最终诱导自噬。这些结果表明,AMPK信号通路可能参与metformin-induced自噬在K7M2和MG63 osc。需要进一步确定AMPK信号通路诱导的自噬二甲双胍,K7M2和MG63 osc AMPK抑制剂处理,复合治疗后10μ米复合C 48 h, metformin-induced自噬的K7M2 osc(图5 (c))和MG63 osc(图5 (d))部分减毒。与二甲双胍的影响,抑制的AMPK激活的蛋白表达p-mTOR和减少LC3的表达。TEM图像(图5 (e))和免疫荧光试验(图5 (f))进一步说明,AMPK信号通路的抑制化合物C减毒的metformin-induced自噬K7M2 osc和MG63 osc。因此,我们的研究结果表明,二甲双胍监管osc通过AMPK / mTOR的自噬信号通路。

3.6。自噬调节体内平衡osc的多能性

来验证是否metformin-mediated自噬与具备干细胞多能性和osc, K7M2和MG63 osc服用二甲双胍,自噬抑制剂3 ma,二甲双胍一起3 ma。自噬抑制剂3 ma单独作为一个消极的控制,以及自噬诱导物雷帕霉素作为积极的控制。治疗后,自噬的标志,具备干细胞,多能性检测。我们的研究结果显示,二甲双胍诱导自噬,二甲双胍+ 3 ma显著缓解metformin-induced自噬。自噬抑制剂治疗3 ma,自噬小体的数量减少而自噬诱导物雷帕霉素促进自噬的发生(图6(一))。此外,免疫荧光LC3的表达水平升高osc与二甲双胍或雷帕霉素治疗,而治疗3 ma抑制LC3如图的表达6 (b)。此外,的表达ALDH1 osc的osc是减少在所有情况下,无论自噬增强(雷帕霉素或二甲双胍)或受损的马(3)如图6 (c)和6 (d)。克隆形成osc也评估了结晶紫染色(图6 (e))和SEM观察(图6 (f))。在协议与上述结果,抑制和诱导自噬的克隆形成阻塞K7M2和MG63 osc。这些数据表明,自噬可能发挥重要作用在维护osc的多能性,因为干细胞的多能性主要是由网络维护pluripotency-associated转录因子如Oct4、Sox2, Nanog。自噬增强时,退化pluripotency-associated转录因子也增强,而引起自噬抑制增加pluripotency-associated转录因子如图6 (g)和6 (h)。虽然标记Sox2等多能性和Oct4增强osc自噬抑制时,肿瘤领域形成和具备干细胞明显减弱(数字6 (c)- - - - - -6 (f))。鉴于这些结果,我们推测自噬可能调节体内平衡osc的多能性。

3.7。二甲双胍抑制肿瘤生长和OSC异种移植物模型的能力

因为6.4毫米二甲双胍可以诱导自噬(图5(一个)),而不引起细胞凋亡(图3 (f)(图)或死亡S2)K7M2 osc,所以我们K7M2预处理与6.4毫米二甲双胍osc 48 h评估致瘤性在活的有机体内。如数据所示7(一)和7 (b),K7M2 osc植入的细胞密度 形成肿瘤控制在100%的老鼠,而肿瘤形成率降低到57.14%,二甲双胍治疗。移植后肿瘤形成率 osc是对照组的85.71%和57.14% metformin-treated组。与1000细胞植入导致肿瘤形成率85.71%,对照组;然而,植入密度导致肿瘤形成率大幅降低metformin-treated组为28.57%。此外,二甲双胍治疗显著降低肿瘤体积(图7 (c)(图)和权重7 (d))。

为了确定二甲双胍是否影响肿瘤的生长在活的有机体内, 介绍了K7M2 osc通过intratibial注入到老鼠。当肿瘤达到约100毫米³,上面描述的小鼠随机分为5组(图7 (e))。3周的治疗后,小鼠处死,肿瘤组织被剥夺了,体重。引人注目的是,肿瘤体积(图7 (f)重量(图)和肿瘤7 (g))在所有组与对照组相比显著降低。肺转移的老鼠也观察到明显的转移性结节。有明显减少小鼠肺转移二甲双胍组比对照组(图7 (h))。肺部转移性结节metformin-treated组明显降低(仅2 6小鼠)与对照组(4/6),表明二甲双胍降低骨肉瘤转移的进展。这种效应也观察到小鼠接受马3(1/6)和雷帕霉素(2/6)。肺组织(图)染色7(我))进一步证实了这些发现二甲双胍,rapamycin-induced自噬抑制的致瘤性K7M2 osc在活的有机体内。包含IHC染色(图7 (j))透露,LC3和ATG5调节,表明自噬在肿瘤诱导的小鼠相比,用二甲双胍治疗控制,而Ki67的表达下调。有趣的是,Sox2和Oct4积累当自噬抑制3 ma和自噬诱导时降低了二甲双胍或雷帕霉素,这与实验结果是相一致的在体外。

4所示。讨论

二者,也被称为肿瘤起源细胞,导致肿瘤发生、进展、转移17]。球面形成分析是一种经典广泛使用的方法分离和描述二者18]。越来越多的证据表明,SP细胞,这种细胞表现出二者的特点和负责肿瘤转移和化疗抵抗,能够有效地排除赫斯特33342染料(19]。一些多能转录因子如Oct4、Sox2, Nanog是二者的基本维持多能性和自我更新20.]。此外,类似于多能转录因子,CD44和CD133其他建立和无处不在的CSC表面标记(21]。ALDH1,位于细胞质和线粒体酶已被确定为一个预测OSC癌症的标志(22]。在这项研究中,我们使用两种肿瘤领域文化和SP分析评价二者的特点在K7M2和MG63骨肉瘤细胞系。我们发现SP K7M2和MG63细胞的比例约为1% - -2%,这是减少约0%,抑制与维拉帕米治疗。此外,K7M2和MG63可能形成肿瘤球在无血清培养系统中。有趣的是,我们发现肿瘤球来自K7M2 MG63骨肉瘤细胞具备干细胞更高的迹象,和基底自噬在肿瘤领域通量水平高于在他们父母的贴壁细胞,这是符合其他研究表明,自噬调节二者的具备干细胞(23]。在成骨的培养和chondrogenic分化诱导媒体,osc分化成osteoblast-like和chondroblast-like细胞。与上述相关的研究中,孤立的osc Sox2也积极,Oct4、CD133, CD105, Stro-1和ALDH1,而他们的父母细胞没有。

二甲双胍,2型糖尿病的一线药物治疗(24),最近成为一个潜在的抗癌药物(25- - - - - -27]。因为抗癌效果通常并发与细胞生长抑制和细胞周期阻滞细胞周期放松管制的特点之一,被认为是肿瘤细胞(28]。绝大多数肿瘤细胞被发现在细胞周期改变从G1过渡到S期,这是由细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)。p21, CDK2的抑制剂,在G1 / S过渡中起着至关重要的作用29日]。本研究表明,二甲双胍治疗活性的表达P21基因和抑制CDK基因的表达等细胞周期蛋白D1和细胞周期素D3的积累,导致osc停在G0 / G1期。这个观察是一致的发现王等。30.),显示,二甲双胍在骨髓瘤细胞细胞周期进程阻塞。最近,包等。31日]发现二甲双胍削弱了迁移和侵袭性骨肉瘤细胞的能力在体外和在活的有机体内。与这些结果相关,老鼠用二甲双胍治疗在肿瘤体积明显降低控制老鼠相比在我们的研究中,证实二甲双胍抗肿瘤的效果。

除了坏死,细胞凋亡,细胞程序性死亡在癌症治疗中起着举足轻重的作用32]。众所周知,细胞凋亡通常是由线粒体功能障碍,导致线粒体跨膜电位的损失和细胞间内源性活性氧的积累33],过量的活性氧可以氧化DNA、蛋白质和脂质,随后激活caspase-mediated凋亡[34]。我们证实二甲双胍治疗引发过多的活性氧产量,而预处理NAC部分逆转osc metformin-induced活性氧的积累。特别是,线粒体跨膜电位的损失引起bcl - 2、Bax之间的不平衡。伯灵顿,proapoptotic蛋白质转移到线粒体,从而导致细胞色素c的释放(35]。与这些结果相关,二甲双胍治疗诱导的线粒体功能障碍伴有线粒体跨膜电位的损失,以及减少凋亡bcl - 2蛋白的表达,增加Caspase9和Caspase3的活动。

有越来越多的证据证明AMPK信号可以抑制癌细胞的扩散和增强他们的CSC属性(36]。众所周知,此外,二甲双胍抑制二者在大肠癌的自我更新能力,依赖于相对谷氨酰胺代谢的调节(37]。符合这些发现,我们表明,二甲双胍大大减少K7M2多能性和MG63 osc通过抑制线粒体ATP合成,AMPK的激活。这也是符合的发现自噬调控AMPK / mTOR途径[38]。此外,AMPK抑制剂、复合C,自噬抑制剂,马3,被应用于研究AMPK / mTOR的角色在自噬通路(39]。我们的研究结果表明,激活AMPK抑制mTOR通路,似乎自噬增强。

自噬溶酶体,降解途径参与细胞内稳态的维持是成为一个有吸引力的治疗目标在某些类型的肿瘤40]。几种方法存在诱导自噬在细胞,包括饥饿和雷帕霉素治疗(41]。在这项研究中,我们发现自噬标记LC3 ATG5,和ATG7 osc用二甲双胍治疗明显增加,表明二甲双胍可以刺激自体吞噬,这是符合王等人的研究结果(30.在骨髓瘤细胞。使用这个模型,我们首先检查osc的可行性,发现它减少二甲双胍治疗。此外,干细胞标记物的表达Oct4 Sox2是自噬诱导时降低了二甲双胍或雷帕霉素,表明自噬可能有助于保持OSC的多能性。最后,我们证实自噬的直接影响osc的自我更新能力通过抑制自噬与3 ma。尽管潜在的干细胞标记Oct4和Sox2高表达的细胞治疗3 ma,然而,osc的克隆能力削弱。此外,metformin-mediated减少数量的球体可以部分逆转观察马3治疗,表明自噬在osc维持多能性至关重要。同样,它已经表明,自噬调节体内平衡的pluripotency-associated蛋白质在人类胚胎干细胞(42),而这些蛋白可能导致失衡在胚胎干细胞多能性的损失43]。在目前的研究中,我们首次证明二甲双胍抑制自我更新能力和致瘤性的osc针对自噬,自噬调节体内平衡的osc的多能性。

5。结论

总之,我们发现二甲双胍治疗抑制K7M2和MG63 osc诱导G0 / G1期细胞周期阻滞。此外,osc二甲双胍同时引发细胞凋亡,促进细胞死亡通过ROS-dependent mitochondria-mediated途径。引人注目的是,二甲双胍显著抑制osc的自我更新能力和致瘤性,通过调节自噬,调制的AMPK / mTOR通路(图8)。综上所述,这些数据表明,二甲双胍对osc发挥抗肿瘤效应,自噬可能是一个有前途的治疗骨肉瘤的目标。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

本赵,杰罗,你们王同样贡献了这项工作。

确认

我们感谢LetPub (https://www.letpub.com)的语言帮助在准备这个手稿。我们也感谢Xijing第四军医大学医院提供BD流式细胞仪咏叹调三世流式细胞分析仪。这项工作是支持的中国深圳科技计划项目(JCYJ20170412140904406)和西北工业大学博士论文的创新基金会(CX201969)。

补充材料

补充1。图S1: flow-cytometric分析CD44的生物标志物CD133, CD105, Stro-1 sphere-forming细胞和SP细胞之间。K7M2和MG63 osc CSC标记CD44阳性,CD133 CD105, Stro-1。适当的同形像抗体作为控制(黑线)。

补充2。图S2: AO / PI染色K7M2 osc。活细胞染色AO(绿色),而死细胞与π(红色)。没有显著差异二甲双胍孵化后死亡。AO:吖啶橙;PI: propidium碘。 。