文摘

活性氧(ROS)介导cisplatin-induced肿瘤细胞的细胞毒性。然而,当cisplatin-induced ROS不达到细胞毒性水平,癌细胞可能开发药物抗性。这种现象可以归因于遗传抗氧化蛋白的高表达网络。H-Ferritin是一个重要的抗氧化系统由于其无毒形式储存铁的能力。改变在卵巢癌H-Ferritin被描述的表达;然而,其功能作用cisplatin-based化学抗性的癌症类型从未被探索。在这里,我们调查的灯是否H-Ferritin可能影响cisplatin-induced卵巢癌细胞的细胞毒性。首先,我们OVCAR3特征和OVCAR8细胞相对ROS和H-Ferritin基线。OVCAR3展出ROS水平较低而H-Ferritin OVCAR8和更大的表达式。此外,OVCAR3显示明显的增长潜力和生存伴随着强烈的活跃/ pAKT和过度激活原癌基因和细胞周期蛋白E1。 When exposed to different concentrations of cisplatin, OVCAR3 were less sensitive than OVCAR8. At the lowest concentration of cisplatin (6μ米),OVCAR8经历了一个一致的细胞凋亡的差别以及对这些H-Ferritin ROS水平的和一致的增加;另一方面,OVCAR3细胞被完全反应迟钝,H-Ferritin几乎不受影响,ROS含量略有增加。因此,我们评估调制H-Ferritin水平是否能够影响cisplatin-mediated细胞株的细胞毒性。H-Ferritin击倒加强cisplatin-mediated ROS和显著恢复敏感性增加到6μ顺铂耐药OVCAR3细胞。相反,被迫过度H-Ferritin显著抑制细胞内ROS的cisplatin-mediated海拔随后导致减少OVCAR8细胞反应。总的来说,我们的研究表明,在cisplatin-based H-Ferritin可能是一个关键的蛋白药物抗性,其抑制可能代表一个潜在的方法来增强顺铂耐药卵巢癌细胞的敏感性。

1。介绍

含氧活性物种(ROS)不稳定细胞新陈代谢的副产品是必不可少的几个生物过程包括线粒体和质膜功能,细胞信号和免疫反应(1]。ROS的速度和规模生产严格控制的抗氧化防御系统(过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx),硫氧还蛋白(硫氧还蛋白)和铁蛋白亚基(FHC)),消除他们随着时间的推移2,3]。ROS生产中的不平衡电路和删除会导致损伤的细胞信号、氧化损伤的细胞组件,和细胞毒性1- - - - - -4]。另一方面,最近的证据表明,活性氧的特点是一个二元属性在决定细胞命运(4,5]。持久ROS生产过剩可能诱发细胞适应,因为它发生在许多疾病,特别是癌症。否则,过度ROS生产可能产生致命的损伤,导致细胞死亡4,5]。因此,许多当前的化疗策略旨在提高活性氧对细胞毒性阈值水平在恶性肿瘤细胞6- - - - - -10]。ROS prooncogenic区内,癌细胞提供广泛的抗氧化分子,减少供应prooxidant药物的功效,使肿瘤细胞获得药物抗性(11,12]。

顺铂是prooxidant化学治疗剂广泛用于卵巢癌的治疗(13- - - - - -16]。尽管如此,卵巢癌细胞往往开发顺铂耐药性的增加抗氧化系统的表达(14- - - - - -17]。因此,最后的ROS浓度由顺铂诱发接触对这种prooxidant癌症治疗的有效性至关重要(17]。由于这个原因,有一种强烈的需要发展新的治疗策略能够克服铂电阻在复发性和转移性卵巢癌。

抗氧化剂酶家族,沉重的人类铁蛋白的亚基(H-Ferritin FHC)行为通过回收铁生物利用率和催化地活动形式从而防止其在细胞内的积累不稳定池(唇)及其参与ROS-generating芬顿反应(18]。FHC作为抗氧化蛋白的作用是强调通过多种机制导致其转录和转录后upregulation针对氧化刺激(19]。FHC表达式通常是改变报道在癌症细胞在肺20.],乳腺癌[21,22],黑色素瘤[23)和卵巢癌细胞24]。然而,可能FHC数量之间的关系和癌细胞的能力开发药物抗性特征顺铂仍然不佳。

在当前的研究中,我们调查是否和H-Ferritin调制的数量可能会影响到什么程度OVCAR3顺铂敏感性,一个完善的在体外chemoresistant卵巢癌细胞的实验模型25),相比OVCAR8细胞。通过一系列的分析包括FHC击倒和被迫过度,我们首次展示,铁蛋白亚基,通过调节活性氧的能力,是一个关键因素在决定卵巢癌细胞暴露于顺铂的反应。

2。材料和方法

2.1。细胞系,细胞培养

我们选择的是在体外实验模型两个人类卵巢癌OVCAR3和OVCAR8行卵巢腺癌上皮的代表。从美国获得细胞类型文化集合(写明ATCC,罗克维尔市,医学博士,美国)。根据写明ATCC OVCAR3细胞来源于腹水的转移性站点和一个适当的模型系统在卵巢癌顺铂耐药性的研究。两个细胞系由p53基因的突变特征。OVCAR3 OVCAR8细胞维持RPMI 1640媒体(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。文化媒体补充10%胎牛血清在37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂。每个单元格行通过了望®已经检查支原体污染支原体PCR检测设备(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。病人和标本

我们选择一组高档浆液性卵巢癌患者28 (HGSC)治疗妇产科肿瘤学的单位,大希腊大学Germaneto, Pugliese-Ciaccio医院Catanzaro,意大利,2013年4月至2016年3月。组织和病人的血清样本检索从我们生物FHC mRNA的表达进行分析。入选标准如下:临床数据的可用性和生物样品;阶段II-III-IV HGSC手术了。先前的或并发癌症患者位于其他网站,已知的遗传易感性妇科或nongynecologic癌症(BRCA1-2运营商、息肉病相关条件(APC), Fanconi综合征)(14),或积极的家庭记忆卵巢癌和/或乳腺癌被排除在外。病人的临床资料报道在表1。

程序进行的这项研究是按照指南的赫尔辛基宣言人体实验和良好的临床实践(GCP)。批准“Pugliese-Ciaccio”机构审查委员会(IRB号:AOPC12404)开始前获得病人的入学率。此外,在处理之前所有病人的知情同意了他们的数据从住院的时候,即使数据不包括任何个人识别信息。生物样本包含在外科组织标本固定在4%多聚甲醛和随后嵌入石蜡。

2.3。试剂

顺铂是来自妇产科肿瘤的门诊药房在单位,大希腊大学,Germaneto。OVCAR3 OVCAR8细胞被播种在24-well板不使用媒介。顺铂被添加到介质在不同浓度(6μ米,12μ米,24μM和48μ米)。治疗至少进行三次独立的生物复制。电子商务₅₀计算通过使用GraphPad棱镜®5.01版。n -乙酰半胱氨酸(NAC)从Sigma-Aldrich购买(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),用于在10毫米2 h。

2.4。活性氧的检测

使用三种不同的细胞内ROS含量检测方法。CellROX®绿色试剂(热费希尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)检测总ROS MitoSOX时细胞内的内容^™红色指示器(热费希尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)专门探讨过氧化物自由基。检测是由免疫荧光分析。免疫荧光分析,OVCAR3 OVCAR8细胞培养在盖玻片上,24小时,细胞被孵化与CellROX®绿色试剂30分钟。两个细胞系和MitoSOX孵化^™红色指示器10分钟37°C。细胞被轻轻洗。封面都安装在显微镜幻灯片使用安装解决方案延长黄金不变色试剂(热费希尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)。图片收集使用徕卡DM-IRB / TC-SP2共焦显微镜系统(63 x)。ROS也由孵化与redox-sensitive探针2细胞 - - - - - -7 - - - - - -DCF (CM-H2CFDA;分子探针,尤金,或者美国)。分析中描述的男婴et al。26]。荧光被曝使用Victor3 Multilabel计数器(PerkinElmer,图尔库,芬兰)在485 nm和535 nm)激发和发射,分别。结果归一化蛋白质浓度。

2.5。MTT试验

MTT检测,3 - 4 5-dimethylthiaoly 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)使用。简而言之,OVCAR3和OVCAR8细胞( 细胞/)被播种24-well板。在具体的治疗,肝癌和新鲜2毫克/毫升(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),在PBS resuspended,被添加到每个包含两个细胞系;新鲜肝癌2毫克/毫升(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。2 h孵化后,培养基被抛弃,取而代之的是200年μ异丙醇的L。光密度测量在595 nm分光光度计。执行分析OVCAR3和OVCAR8细胞生长在0 h, 12小时、24小时、48小时和72 h。对于每一个样本,MTT试验进行了一式三份。

2.6。细胞周期分析

总共 细胞被固定为100%乙醇和储存在4°C。细胞水化与PBS RT 10分钟,然后用碘化propidium细胞染色(π)染色解决方案包含50μg / mLπ(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),100年μg / mL DNase-free核糖核酸酶A (Calbiochem拉霍亚,CA),和0.01% NP-40 (USB,克利夫兰,哦)在室温下PBS 60分钟。染色分析细胞的细胞周期分析BD LSRFortessa™×20 (BD生物科学,圣何塞,CA)和FlowJo软件。

2.7。细胞凋亡分析

细胞凋亡分析通过Alexa萤石®488膜联蛋白V /死亡细胞凋亡工具包(热费希尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)根据制造商的指示。染色后,细胞被孵化在黑暗中在室温下15分钟。与400年每个管稀释μL膜联蛋白绑定的缓冲区,然后,分析了细胞的流式细胞仪使用BD LSRFortessa™×20 (BD生物科学,圣何塞,CA)和FACSDiva7.0程序(BD生物科学,圣何塞,CA)。

2.8。西方墨点法

使用缓冲区里帕总细胞溶解产物准备,如所描述的男婴et al。27]。每个蛋白质样品(奖金μg)是由10 - 15% sds - page分离,然后转移到硝化纤维膜。膜是孵化主要抗体在一夜之间在4°C。主要抗体FHC(1: 200年,sc - 376594), SOD1 (1: 500、11、sc - 17767), GPx 1/2 (b - 6 1: 500年,sc - 133160),原癌基因(1:500年,C33 sc-42) CCNE1(1: 500年,军医,sc - 377100)购买从圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯生物技术,达拉斯,德克萨斯)。主要抗体半胱天冬酶3(1:1000 # 9662年代),一种蛋白激酶/ pAKT(1: 1000年,9772年代和4058年代),ERK /活跃(1:1000年,9772年代和4058年代),Phospho-Chk2 (Thr68)(1: 1000年,C13C1)和相关的(D9C6, 1: 1000)从细胞信号技术购买(荷兰莱顿)。膜进行清洗和孵化,2 h,与二次抗体HRP-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白g(1: 2000年,sc - 2005)和HRP-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 2000年,sc - 2357)(圣克鲁斯生物技术,达拉斯,德克萨斯)和免疫反应性的乐队与ECL可视化免疫印迹检测系统(圣克鲁斯生物技术,达拉斯,德克萨斯)。确保相同加载的蛋白质,我们用山羊多克隆抗γ微管蛋白抗体(C-20) (sc - 7396 1: 2000年,圣克鲁斯生物技术)。实验报告和代表图像进行三次。免疫印迹微执行使用ImageJ软件。

2.9。FHC瞬态击倒和超表达

OVCAR3 OVCAR8细胞被镀成six-well板块 转染前细胞/好,饿死在一夜之间。FHC瞬态击倒是由使用特定FHC核(s5385热费希尔科学,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)(OVCAR3^siFHC和OVCAR8^siFHC)。确保最优控制、OVCAR3和OVCAR8进一步转染细胞消音器™选择消极控制核(热费希尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)(OVCAR3^负的控制和OVCAR8^负的控制)。FHC瞬态超表达是由使用特定pc3FHC表达载体(OVCAR3^pc3FHC和OVCAR8^pc3FHC)如前所报道Zolea et al。28]。细胞被进一步转化为转染空着pc3DNA负控制(OVCAR3表达载体^pc3DNA和OVCAR8^pc3DNA)。所有转染进行三次使用Lipofectamine 2000试剂根据制造商的建议(热费希尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)。48小时后,FHC-specific超表达和沉默是通过免疫印迹在蛋白质含量检查。

2.10。RNA隔离和绝对存在的分析

总RNA隔离和单链DNA互补(互补)一代进行如前所报道Di Sanzo et al。29日]。RNA从石蜡包埋组织标本通过一系列的孵化与二甲苯和随后的乙醇洗涤。绝对qPCR分析也用于确定FHC mRNA的表达在肿瘤组织标本。FHC表达式的分析是由使用SYBR绿色qPCR大师混合(热费希尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)。引物用于检测FHC如下:弗兰克-威廉姆斯:5 - - - - - -CATCAACCGCCAGATCAAC-3牧师:5 - - - - - -GATGGCTTTCACCTGCTCAT-3 。分析了QuantStudio 3热费希尔科学应用生物系统公司。从样本已知的模板浓度,5点10倍连续制备标准曲线,和所有其他样品的浓度是由简单的插值计算每个阈值周期(Ct)标准曲线。FHC mRNA表达数据报告为日志(数量、ng)和代表三个独立的意思是技术复制。

2.11。统计分析

结果表示为 并分析了使用未配对的学生的 - - - - - -测试或双向方差分析显示在图的传说。GraphPad棱镜®5.01版是用来计算EC₅₀;Sidak测试是用来识别EC的统计学意义₅₀值。chemoresistant FHC肿瘤组织的水平vs。敏感的HGSC患者相比,使用非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验识别统计组之间的差异。克鲁斯卡尔-沃利斯检验被选为一个非参数选择单向方差分析和Mann-Whitney的延伸测试允许比较两个以上的独立组织。 被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。OVCAR3细胞显示出更低的内源性活性氧和内源性FHC水平高于OVCAR8细胞

我们选择的是在体外实验模型OVCAR3和OVCAR8细胞株卵巢腺癌上皮的代表。OVCAR3被选为实验模型,研究顺铂药物抗性(25]。首先,我们执行OVCAR3和OVCAR8细胞ROS分析通过使用两个fluorogenic探针:CellROX®绿色试剂能够检测总细胞内活性氧含量和MitoSOX™红色指示器能够选择性地检测超氧化物自由基。如数据所示1(一)和1 (b)荧光显微法强调,CellROX®绿色荧光强度明显高于OVCAR8细胞相比OVCAR3细胞。相反,MitoSOX染色显示只有两个细胞系之间的强度略有不同。这些结果表明,OVCAR8细胞具有更高水平的总ROS含量相比OVCAR3细胞。超氧化物自由基贡献这不同程度出现不一致。基线ROS含量的差异可能反映,原则上,各种抗氧化酶的表达。因此,我们分析了FHC蛋白质的表达,属于抗氧化系统,OVCAR3和OVCAR8细胞。代表免疫印迹分析和相对微图1 (c)强调表达的抗氧化蛋白FHC一直更多OVCAR3相比OVCAR8细胞。这种行为反映了其他两个抗氧化酶的表达SOD1和GPx(图S1)。

3.2。OVCAR3细胞显示增强的细胞周期s阶段和细胞生长

我们下一个评估的差异是否细胞内ROS基线数量和FHC蛋白质水平的不同的癌细胞的生长。图2(一个)显示了一个具有代表性的情节和柱状图表示 三种细胞周期cytofluorimetric分析,由染色细胞π的解决方案。结果强调一个重要的更高比例的OVCAR3细胞相比,在S阶段OVCAR8细胞(S %: vs。 , )。因此,结果MTT分析表明,OVCAR3展出一个增强细胞的增长潜力在24 h, 48 h, 72 h(图2 (b))。报道在图2 (c)OVCAR3细胞也具有一致的超表达细胞周期素E1的具体s阶段与原癌基因的表达增加(CCNE1)原癌基因和增强的磷酸化ERK1/2和AKT OVCAR8细胞。相反,细胞周期蛋白依赖性激酶的磷酸化s阶段相关(Thr68)观察OVCAR3和OVCAR8细胞。光学微的世行分析报告在图S1。

3.3。顺铂治疗诱发显著和ROS增加专门差别FHC对这些敏感的OVCAR8细胞

OVCAR3和OVCAR8细胞对顺铂的敏感性取决于治疗两个细胞系与药物浓度增加(6μ米,12μ米,24μM和48μ米)。24小时后,我们进行MTT试验监测治疗后细胞生存能力。如图3(一个),我们发现OVCAR3细胞,总的来说,抵抗治疗比OVCAR8细胞(EC日志₅₀OVCAR3vs。日志EC₅₀OVCAR8: vs。 , )。特别是,在最低顺铂浓度(6μ米)OVCAR8细胞生存能力几乎减少了一半,而OVCAR3细胞完全没有响应。DCFDA luminometric分析强调,顺铂治疗引起的活性氧积累的程度OVCAR8细胞明显高于诱导OVCAR3细胞在每个浓度除了48μM(图3 (b))。接下来,我们观察到接触6μ的半胱天冬酶3 M顺铂诱导一个清晰的乳沟OVCAR8细胞而不是OVCAR3细胞(图3 (c))。此外,FHC蛋白质含量表现出完全不同的行为之间的两个细胞系;在6μ顺铂,FHC一直OVCAR8细胞中表达下调,而几乎在OVCAR3细胞(图的影响3 (c))。光学微世行报告在无花果。S2。SOD1的分析和GPx蛋白质含量在6μ顺铂显示,相反,略有增加的细胞系(图S2)。此外,免疫荧光分析强调,6μM顺铂诱导显著增加总ROS和超氧化物自由基水平drug-responsive OVCAR8细胞相比OVCAR3耐药细胞(数字3 (d)和3 (e))。

3.4。调制的胞内FHC水平影响OVCAR3和OVCAR8细胞对顺铂的敏感性

这里,我们问及FHC水平的变化可能会影响曲线端细胞对顺铂的反应。,我们首先是暂时性的转染OVCAR3细胞与一个特定的小干扰rna (OVCAR3 FHC^siFHC)或消极的控制(OVCAR3^负的控制)48 h。膜联蛋白V / 7-AAD cytofluorimetric分析表明,6μM顺铂无法导致OVCAR3一致的细胞凋亡^负的控制(早期细胞凋亡: ;晚期凋亡: )。相反,同样的药物浓度提升显著增加OVCAR3凋亡细胞死亡^siFHC早期凋亡细胞(: ;晚期凋亡: )未经处理的OVCAR3相比^负的控制( )或OVCAR3^负的控制处理6μ顺铂单独( )。细胞凋亡检测在OVCAR3执行^负的控制细胞治疗(i) 10毫米N-acetyl-cysteine独自(NAC),(2) 10毫米N-acetyl-cysteine (NAC)结合6μ在未经处理的OVCAR3 M顺铂^siFHC并没有发现相当大的变化。三个独立的生物复制的结果报告 在表2以及在图4(一)。

因此,检测与CellROX®绿色试剂表明活性氧诱发6μM顺铂治疗结合FHC在OVCAR3细胞(OVCAR3击倒^siFHC顺铂6μ米)都高于单独诱导通过顺铂治疗(OVCAR3^负的控制顺铂6μ米)或FHC (OVCAR3独自沉默^siFHC)(图4 (b))。没有观察到相当大的变化OVCAR3细胞10毫米NAC (OVCAR3处理^负的控制南汽10毫米)与OVCAR3相比^负的控制未经处理的细胞。正如所料,NAC治疗减少活性氧积累OVCAR3细胞治疗6μ顺铂(OVCAR3^负的控制顺铂6μ米/ NAC 10毫米)。此外,免疫印迹分析显示,6μM的顺铂暴露的差别导致了进一步对这些FHC在OVCAR3蛋白质含量^siFHC细胞;相反,顺铂离开FHC OVCAR3不变的水平^负的控制细胞(图4 (c))。

接下来,我们执行FHC在OVCAR8细胞过度。如数据所示5(一个)和5 (c)明显,迫使FHC过度保护OVCAR8细胞6μM cisplatin-induced细胞毒性(OVCAR3^pc3FHC顺铂(6μ米)vs。OVCAR8^pc3DNA顺铂(6μ米), )。类似的结果当OVCAR8细胞治疗6μM顺铂24 h结合10毫米的活性氧清除剂NAC 2 h (OVCAR8^pc3DNA顺铂(6μ米)/ NAC(10毫米)vs。OVCAR8^pc3DNA顺铂(6μ米), )。三个独立的生物复制的结果报告 在表3。因此,检测与CellROX®绿色试剂进一步透露,FHC过度,以及NAC治疗,持续减少活性氧诱发6μM顺铂治疗OVCAR8细胞(数据5 (b))。

3.5。FHC组织高水平Chemoresistant高档浆液性卵巢癌(HGSC)患者比较敏感的问题

根据在体外结果,我们绝对qPCR进行分析FHC信使rna组织水平在一个小的高档浆液性卵巢癌患者28 (HSGC,阶段II, III, IV)与含铂化疗治疗,其中13也可以成为鉴别药物抵抗和药物15人是敏感的。如箱线图,如图所示S3、统计克鲁斯卡尔-沃利斯检验表明,抵抗化疗患者可能具有更高的FHC水平比较敏感的问题。然而,数据没有达到统计学意义。

4所示。讨论

尽管相当大的努力开发新颖的和更有效的治疗策略,卵巢癌患者常常受到咄咄逼人,therapy-resistant疾病预后不良的特征和高死亡率14,30.,31日]。顺铂是prooxidant化学治疗剂主要用作在卵巢癌的一线治疗;然而,它的功效是非常有限的,因为大多数患者最终死platinum-resistant疾病(30.,31日]。大量证据表明,改变氧化还原平衡,现在它被广泛的认为是癌症的一个主要特征,可以关键耐抗肿瘤药物包括顺铂(1,2,4]。

由于遗传、代谢和microenvironment-related畸变,癌细胞受到持续prooxidant刺激,最终提高基线ROS水平通过诱导基因组不稳定性,促进肿瘤的生长和代谢重编程(32]。然而,肿瘤细胞已经开发出一种高效的活性氧解毒系统,当受到进一步prooxidant条件获得优势。这种依赖性的抗氧化系统代表了一个特定的漏洞,目前使用prooxidant化疗药物行动通过增加氧化应激在毒性阈值(1- - - - - -5]。

在这项研究中,通过分析细胞内ROS水平的变化,我们探索FHC的角色发展的一个重要的抗氧化酶,抵抗cisplatin-based治疗卵巢癌细胞。

FHC沉重的人类铁蛋白的亚基,铁氧化酶活动通过它安全地储存铁铁催化地无所作为^{3 +}因此形式严格控制不稳定的内稳态prooxidant铁池(33]。我们之前和其他人证明FHC NFkB-mediated的下游效应抑制氧化应激的细胞凋亡(26,34]。此外,FHC由抗氧化剂转录调节转录因子Nrf2保持铁和氧化还原内稳态35,36]。

作为一个在体外实验模型中,我们选择OVCAR3 OVCAR8细胞系和卵巢癌细胞的代表。特别是,OVCAR3细胞被选为顺铂耐火细胞系建立转移性腹水的患者卵巢腺癌(25]。

总体而言,我们的研究结果有力地表明,FHC发挥关键作用的抗氧化性质决定顺铂治疗的卵巢癌细胞的反应。首先,我们观察到chemoresistant OVCAR3细胞具有更高的本构FHC水平和OVCAR8细胞内源性活性氧含量比较低。此外,prooxidant顺铂治疗影响FHC水平虽然差别OVCAR8细胞诱导其对这些叶子不变FHC在OVCAR3细胞数量。这些影响似乎选择性FHC因为其他两种抗氧化酶,即SOD1 GPx,没有对顺铂接触不断修改。最近的证据表明,H-Ferritin可能在细胞暴露于抗癌化合物进行降解,这是伴随着细胞内铁iron-dependent活性氧积累和增产(37]。事实上,我们注意到在OVCAR8 FHC由顺铂的差别细胞对这些接触是伴随着活性氧积累的大量增加,可能超过细胞毒性阈值水平。相反,OVCAR3细胞顺铂的冲击是不足以推动生产活性氧对细胞毒性水平。

在过去的几十年中,已经提出的三个主要方法利用ROS的癌细胞杀死潜力:(i)增强活性氧的生成在肿瘤细胞通过增加一个prooxidant化疗药物的剂量,(ii)结合传统抗癌药物的天然化合物,增加活性氧的产量,所谓“ROS + ROS概念”,和(3)抑制肿瘤细胞的抗氧化防御系统。值得注意的是,前两种方法是非常具有挑战性的翻译在体外模型在活的有机体内条件,因为明显的副作用(10,38,39]。相反,禁用关键抗氧化系统的活性氧诱导物代表了最有前途的抗癌新战略在耐药肿瘤细胞。事实上,影响抗氧化能力,如Nrf2、SOD、GPx,已经成为一个很好的策略目标许多癌症类型(40]。这里,我们证明,第一次调制的胞内H-Ferritin (FHC)蛋白质能够条件卵巢癌细胞对顺铂从而增加这个分子通道抗氧化蛋白面板。的相关性FHC / ROS轴调制卵巢癌细胞对顺铂已经证明FHC击倒或迫使我们过度在体外系统。FHC击倒,通过使用一个特定的核,伴随着显著增加细胞毒性效应的顺铂耐药OVCAR3细胞。因此,过度的FHC在非OVCAR8细胞抑制的cytototoxic影响药物水平与获得通过清除ROS NAC治疗。FHC击倒的基本机制能够恢复OVCAR3对顺铂的敏感性似乎是严格与它的抗氧化性能和其领导能力有效最终大量活性氧诱发的顺铂单独治疗。

最后,我们还分析了FHC患者癌组织水平28 HGSC接收以铂为基础的化疗。尽管暗示可能的高水平的FHC和药物抗性之间的联系,收集到的数据没有达到统计学意义。这一趋势促使我们提高,在未来的研究中,患者群进行分析,以提供额外的参数的数量估计ROS的重要性和FHC地位改善治疗卵巢癌的治疗结果。

5。结论

总之,我们的数据首次演示FHC协会/ ROS轴与顺铂耐药性卵巢癌细胞。此外,我们建议FHC抑制可能是一个潜在的方法恢复顺铂耐药卵巢癌细胞的敏感性。siRNA载体系统与配体的结合,表现出高亲和力特定受体在卵巢癌细胞可能使这种方法可行在活的有机体内。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

亚历山德罗Salatino和Ilenia男婴同样导致了这项工作。

确认

我们感谢Caterina阿莱西编辑评估。

补充材料

Fig.S1:世行分析SOD1、GPx CCNE1,原癌基因,ERK /活跃,AKT / pAKT和相关/ pChk2 OVCAR3和OVCAR8细胞。代表抗氧化蛋白的蛋白质印迹SOD1、GPx CCNE1,原癌基因一起ERK / AKT在OVCAR3和OVCAR8细胞相关的磷酸化。γ微管蛋白作为内部控制。每个情节都有被使用ImageJ量化软件和光学微报道。世行分析三次,结果重现性好。图S2:世行分析FHC半胱天冬酶3 /裂解半胱天冬酶3 SOD1, GPx OVCAR3 OVCAR8细胞未经处理或处理6μ顺铂。代表免疫印迹FHC半胱天冬酶3 /裂解半胱天冬酶3 SOD1, GPx OVCAR3 OVCAR8细胞治疗(NT)或接受6μ顺铂。γ微管蛋白作为内部控制。每个情节都有被使用ImageJ量化软件和光学微报道。世行分析三次,结果重现性好。图S3:世行分析FHC半胱天冬酶3 /裂解半胱天冬酶3 SOD1, GPx OVCAR3 OVCAR8细胞在一些治疗。免疫印迹OVCAR3 FHC的代表^负的控制,OVCAR3^负的控制(6μ米)OVCAR3 -顺铂^负的控制10毫米NAC OVCAR3^负的控制(6μ米)顺铂/ 10毫米NAC (6μ米)OVCAR3 -顺铂^siFHC,OVCAR3^siFHC(6μ米)顺铂,OVCAR8^pc3DNA,OVCAR8^pc3DNA(6μ米)顺铂,OVCAR8^pc3DNA(6μ米)顺铂/ 10毫米NAC, OVCAR8^pc3FHC(6μM)顺铂。γ微管蛋白作为内部控制。每个情节都有被使用ImageJ量化软件和光学微报道。世行分析三次,结果重现性好。无花果。S4:分析FHC在28个HGSC病人肿瘤组织的水平。代表图像的卵巢癌组织标本(左)。箱线图描述FHC mRNA水平,表示为日志(ng),所评估的绝对qPCR分析癌组织标本chemoresistant HGSC患者( )和敏感的HGSC患者( )(右)。数据没有统计学意义(n)。(补充材料)