对PPAR Hydroxysafflor黄色显示保护γ失活在Nitrosative神经元

文摘

Peroxynitrite-mediated nitrosative压力在大脑中与各种神经退行性疾病有关。最近的证据强调过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ)作为关键的神经退行性疾病的神经因素。这里,我们观察到的影响草hydroxysafflor黄色(HSYA)在神经元nitrosative压力和基于PPAR调查机制γ保护。我们发现,单一的初级神经元接触过氧亚硝基捐赠者SIN-1神经损伤引起的,这是伴随着PPAR的增加γ硝化状况和缺乏受体的激活,以PPAR衡量γdna结合活性,通过受体激动剂(15 d-pgj2或罗格列酮)刺激。PPAR的至关重要的作用γ在神经元防御nitrosative压力验证了通过显示预处理15 d-pgj2或罗格列酮减毒SIN-1-induced神经元损伤但与GW9662预处理,PPARγ拮抗剂,加重SIN-1-induced神经元损伤。添加HSYA PPAR不仅抑制SIN-1-induced神经损伤,预防γ和恢复PPAR nitrative修改γ活动由15 d-pgj2或罗格列酮刺激。此外,HSYA还显示救援能力的神经保护效应15 d-pgj2或在受体激动剂罗格列酮与SIN-1 coincubated。最后,体内实验证明HSYA也有效地阻止了PPAR的管理γ硝化和损失的活动SIN-1-injected海马和逆转的神经元易感性增加支持SIN-1引起差别bcl - 2蛋白对这些基因的抑制。结果表明HSYA保护神经元免受nitrosative通过保持PPAR压力γ作为一个功能的受体,允许更有效的神经保护因子的激活内源性或外源性受体激动剂。我们的研究结果提供了新的线索理解神经保护的作用的草药HSYA潜力。

1。介绍

过度产生一氧化氮(NO)和超氧化物导致生成过氧亚硝基(ONOO⁻)。Peroxynitrite-mediated nitrosative压力导致严重破坏蛋白质,脂类,和DNA,导致细胞凋亡或死亡。3-Nitrotyrosine (3 nt)形成被广泛使用的足迹nitrosative压力引起的过氧亚硝基(1]。3 nt的浓度已经在广泛的报道增加神经退行性疾病,如帕金森病、阿尔茨海默氏症和创伤或缺血性脑损伤(2- - - - - -5]。在缺血性脑,3 nt的形成是显著升高和显著升高3 nt脑梗塞体积呈正相关,在缺血性动物(2]。同时,3 nt积累已被证明与广告的大脑认知能力的下降(5]。此外,3 nt形成的抑制防止脑损伤在这些疾病2- - - - - -5]。因此,peroxynitrite-mediated nitrosative压力是一个重要的神经退行性疾病的发病机理。

过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ配体依赖性转录因子)是一种调节葡萄糖脂质代谢和体内平衡。15-Deoxy-delta前列腺素J2 (15 d-pgj2),不饱和脂肪酸,和氧化磷脂是PPARγ天然配体。其合成配体包括thiazolidinedione (TZD)类insulin-sensitizing代理(ciglitazone troglitazone,吡格列酮,罗格列酮)和一些非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)。最近的研究表明,除了其经典角色,PPARγ激活神经保护与炎症反应和氧化应激模型(神经退行性疾病6- - - - - -8]。例如,PPARγ受体激动剂troglitazone或吡格列酮减少炎症和梗死体积和改善神经功能在大鼠大脑中动脉闭塞后(7]。在培养的海马神经元,罗格列酮是保护线粒体损伤、氧化应激和细胞凋亡引起的β淀粉样蛋白(β)[8]。

Hydroxysafflor黄色(HSYA) (C27H32O16 612.53兆瓦),呈现在图1(一),是一种水溶性单体从红花中提取植物(Carthamus tinctoriusl .)。HSYA据报道是一种天然抗氧化剂用于中药。HSYA的抗氧化性质特别感兴趣,因为大脑的基本作用,氧化损伤在众多形式的脑部疾病。据报道,HSYA能够提供神经保护效应通过降低脂质过氧化水平的产品(9,10)和抑制ROS生成(11]。最近,HSYA也展示了大脑的调节内源性抗氧化防御系统通过增加抗氧化酶的活性,包括超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT),以及谷胱甘肽(GSH)的比例/二硫化谷胱甘肽(GSSG) [12]。然而,很少有研究调查的作用HSYA nitrosative压力的神经元和底层机制。在这项研究中,我们假设HSYA救援神经元通过抑制PPAR nitrosative受伤γnitrative修改和失活。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

HSYA慷慨地提供了浙江永宁制药有限公司(浙江,中国)。HSYA的纯度> 98%由高效液相色谱法。3-Morpholino-sydnonimine (SIN-1), 15 d-pgj2,罗格列酮,GW9662,鼠标抗体3-nitrotyrosine来自开曼化学公司(安阿伯市MI)。赫斯特33825年和兔抗体从西格玛化工有限公司购买了3-nitrotyrosine(圣路易斯,密苏里州)。兔子NeuN和PPAR的抗体γ和VeriBlot IP二级抗体合来自Abcam (Cambridge, MA)。老鼠抗体PPARγ和bcl - 2得到圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。所有其他化学物质分析成绩最高的商业应用。

2.2。主要鼠神经元和治疗

主要神经元,是准备从胚胎日17 Sprague-Dawley老鼠如前所述[8,13,14]。短暂,细胞被分离从海马体和无血清培养系统中维护,B27 neurobasal媒体(表达载体)poly-D-lysine-coated菜肴。1 d体外后,介质改为MEM(表达载体)补充葡萄糖5.5克/毫升、2毫米谷氨酰胺,10%胎牛血清的边后卫(表达载体),丙酮酸钠1毫米,100 U /毫升青霉素和链霉素0.1毫克/毫升。这种媒介变化被要求减少过度抗氧化剂水平从B27介质14,15]。文化是维持在37°C公司5%₂/ 95%的室内空气,湿润孵化器。对文化的第三天,细胞治疗48 h为0.5μ米阿糖胞苷防止胶质的增长。9天的文化,形成了广泛的轴突和树突细胞网络,为实验做好准备。神经元纯度决定使用MAP2标签,神经元细胞的标志显示,纯度> 95%的文化。

使细胞暴露在各种代理、培养基取代MEM补充为5.5 mg / l d -葡萄糖,2毫米谷氨酰胺,5%的边后卫,100 U /毫升青霉素和链霉素0.1毫克/毫升。在一些研究中,细胞被孵化与SIN-1浓度增加(0.05 - 2毫米,在PBS) 24 h。在一组不同的实验中,细胞暴露于HSYA(0.01 - 1毫米,在PBS) 10分钟前添加SIN-1(1毫米),然后coincubated 24 h。SIN-1和HSYA都准备立即之前使用。在一组额外的实验中,PPAR的影响γ受体激动剂和拮抗剂。测试PPAR的效果γ在PPAR激动剂γ激活,神经元与SIN-1孵化(1毫米)单独或结合HSYA(1毫米)24 h,然后处理15 d-pgj2 (5μ米,在PBS)或罗格列酮(1μ米,在DMSO) 6 h。测试PPAR的效果γ受体激动剂或拮抗剂预处理方案、细胞进行预处理与PPAR 24 hγ受体激动剂(5μM 15 d-pgj2或1μ罗格列酮)或PPARγ拮抗剂(5μM GW9662在DMSO),然后暴露于SIN-1(1毫米)进行进一步的24小时。在实验中PPARγ受体激动剂和PPARγ拮抗剂,GW9662添加到媒体PPAR前10分钟γ受体激动剂。测试PPAR的效果γ受体激动剂cotreatment方案,细胞暴露于PPARγ受体激动剂有或没有HSYA(0.1毫米),10分钟前添加SIN-1(1毫米),然后coincubated 24 h。罗格列酮的浓度15 d-pgj2, GW9662是基于我们的初步量效实验和先前公布的数据8,16]。在每一个研究中,实验条件包含相同的DMSO浓度不超过0.1%。

2.3。乳酸脱氢酶测定的活动

细胞毒性被测量的百分比量化总从细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放到媒体使用LDH细胞毒性试验设备(开曼化工、安阿伯、MI)按照制造商的指示。细胞治疗SIN-1单独或与其他代理各种组合。24小时后开始SIN-1治疗,上层清液(100μl)被转移到一个96孔板测量的LDH活性。LDH释放到媒体的比例是由以下公式计算:在媒体上(LDH活性/总LDH活性)×100,其中总LDH活性表示细胞LDH活动和媒体。总LDH测定细胞内处理0.1% Triton x - 100。

2.4。细胞生存能力分析

评估神经可行性,3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl-tetrazolium溴化(MTT)进行分析。测定的原理是基于四唑盐的乳沟线粒体琥珀酸还原酶在可行的细胞形成甲瓒染料。短暂,麻省理工的解决方案(0.5毫克/毫升)添加到文化SIN-1治疗后24小时。孵化后4 h在37°C,甲瓒形成晶体溶解在DMSO溶液。吸光度的测定在570 nm使用自动板读者,和控制的细胞生存能力表示为百分数。

2.5。赫斯特33258年染色

细胞凋亡测定先前描述的过程使用赫斯特33258染色(8,17]。核的变化观察细胞凋亡的形态学特征与赫斯特33258年细胞标记。正常细胞的细胞核呈现均匀hypochromatic蓝色,凋亡细胞的细胞核呈现分散和浓缩的染色。凋亡细胞核的数量至少10个随机选择的字段数,表示为细胞总数的百分比。

大鼠的海马的细胞损失是通过计算测量的数字与赫斯特33258年细胞核染色。六个预选区域的海马体被数/每只动物。从每组六个动物被用于分析。每个区域受细胞核数设置为300μm×300μm。

2.6。免疫印迹分析

样品被sds - page分离,然后转移到硝化纤维膜。后阻塞1 h在0.1%渐变20 / PBS含有5%脱脂牛奶,anti-PPAR污点被孵化γ抗体、anti-nitrotyrosine抗体或anti-Bcl-2抗体在一夜之间在4°C。与适当的孵化后HRP-conjugated二级抗体,化学发光的污点是可视化。乐队的密度是评价densitometrically使用程序数量一个4.6.2 (Bio-Rad实验室、大力神、CA)。乐队的特异性为硝化酪氨酸在飞行员的免疫印迹实验证实。SDS-PAGE-transferred膜是孵化anti-nitrotyrosine抗体,preabsorpted 4 h和过度的自由硝基酪氨酸(10毫米),aminotyrosine(10毫米),phosphotyrosine(10毫米),methyltyrosine(10毫米),或酪氨酸(10毫米)。硝化蛋白抗体的乐队被preabsorption废除硝基酪氨酸但不是aminotyrosine phosphotyrosine, methyltyrosine或酪氨酸。这种方法也被别人用来验证试验的特异性蛋白质酪氨酸硝化(18]。

2.7。免疫沉淀反应分析

免疫沉淀反应分析,样本事先批准蛋白质A / G琼脂糖珠泥浆在4°C瓶10分钟消除非特异性结合蛋白。蛋白质A / G珠子在14000年被旋转在4°C 10分钟。上层清液(500μg蛋白在0.5毫克/毫升)与2孵化μg鼠标anti-PPARγ或anti-IgG(控制)抗体和旋转在4°C 3 h。Ag / Ab immunocomplexes捕获通过添加蛋白质A / G琼脂糖珠,一夜之间发生在4°C。琼脂糖珠被离心收集在14000年在4°C在PBS 10分钟,然后洗了三次。最后,immunocomplexes被沸腾和sds - page分离从琼脂糖珠样品缓冲5分钟和西方墨点法进行硝化PPAR兔子anti-3-nitrotyrosine抗体检测γ。一个HRP-conjugated VeriBlot IP检测试剂用于排除的干扰抗体重型和轻型链。

2.8。PPARγdna结合蛋白测定

PPARγ活动被PPAR量化γdna结合蛋白测定使用敏感和特定TransAM PPARγ转录因子分析工具包(活动主题,卡尔斯巴德、钙、美国),当我们描述(13]。这个试验措施PPAR的能力γ绑定到一个包含特定的过氧物酶体扩散国寡核苷酸探针响应元件(PPRE),固定在96孔板。核与核蛋白质分离的蛋白质提取工具包(活动主题)在启动后6 h PPAR的治疗γ受体激动剂。10μ克核提取蛋白应用于井和被允许绑定到PPRE。绑定PPARγ然后发现通过添加具体anti-PPARγ主要抗体,HRP-conjugated二级抗体,合基板解决方案和分光光度计阅读(450海里)。的特异性试验证实了野生型和突变共识寡核苷酸。野生型共识寡核苷酸可以防止PPARγ绑定到探测器,而突变共识寡核苷酸对PPAR几乎没有影响γ绑定。

2.9。免疫组织化学

用来进行部分彩色3 nt为我们描述(13]。简而言之,部分是permeabilized 0.3% (v/v在PBS) Triton x - 100 30分钟,1%(挡着w/v)在PBS BSA 1 h,然后孵化与鼠单克隆抗体3 nt(1: 200)在一夜之间在4°C。与PBS冲洗后,部分是孵化若丹明异硫氰酸盐(TRITC)山羊anti-mouse抗体标记为1小时37°C在黑暗中。荧光显微镜下观察荧光图像。双标签,部分孵化第一抗体的小鼠anti-nitrotyrosine(1: 200)紧随其后的是一个特定的神经元标记抗体的兔子anti-NeuN(1: 200)或兔子anti-PPAR抗体γ(1:200)。在PBS三洗之后,免疫复合物与德克萨斯红可视化共轭anti-mouse免疫球蛋白g(1: 500)和FITC共轭anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 500)。的特异性染色证实了替代的主要免疫球蛋白抗体与多发地控制或消除的主要抗体。

2.10。海马注射和治疗

所有动物实验进行了根据一个制度批准协议,按照美国国立卫生研究院的指导的实验室动物保健和使用,并被批准天津医科大学动物保健和使用委员会制度。男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(军事医学科学院、北京、中国)体重从280年到330 g被安置和照顾动物资源中心在12 h明暗周期和允许免费获取食物和水。所有动物进行了操作在灯阶段(0700 - 1900 h)。简单地说,麻醉老鼠放在一个立体定位器和3μ在PBS l SIN-1(25毫米)注入到正确的使用以下坐标:海马前囱4.0毫米后,2.0毫米侧中线,4.0毫米硬铝表面以下。上面的程序是在无菌条件下完成,青霉素(200000 U,肌内)注射预防感染。SIN-1被选中的用量根据先前发表的研究中,中剂量25毫米被发现是最有效的诱导蛋白质硝化的海马注射(17]。对照组注射同样体积的车辆。体温维持在37°C使用加热垫在整个手术过程,直到动物苏醒。此后,动物们回到家里笼子,允许自由获取食物和水。

HSYA溶解在PBS通过尾静脉注射静脉注射的剂量1 5或10毫克/公斤SIN-1治疗前30分钟。我们先前的实验表明HSYA注入的神经保护效应在这个范围的用量在缺血/再灌注大鼠2]。的能力HSYA穿过血脑屏障(BBB)静脉注射后政府先前已被证实(19]。在24 h与SIN-1海马注射后,10μ克15 d-pgj2 10μl PBS的管理intracerebroventricularly (ICV) 1的速度μl / min使用注射泵如我们之前所述研究[13]。车辆没有任何药物的效果进行试点实验,观察,没有影响。

2.11。统计分析

实验数据表示为均值±SEM、和SPSS 11.0软件包用于数据处理。单向方差分析被用来比较不同组的方法。比较两组进行t以及。一个值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。从SIN-1-Induced HSYA保护神经元细胞毒性

模型nitrosative损伤,主要海马神经元(d 9)暴露在SIN-1,著名的过氧亚硝基捐赠者,24 h。正如所料,神经元接受SIN-1表现出细胞毒性损伤,由LDH释放到媒体和MTT测定细胞生存能力(图1 (b)),赫斯特33258染色法测定凋亡细胞核(图1 (c)),或者蛋白质nitrative修改基于3 nt的形成(图1 (d))。

观察在SIN-1-induced HSYA细胞毒性的影响,不同浓度的HSYA被添加到媒体一起有毒SIN-1水平。如图1 (b),包含HSYA导致减少LDH释放SIN-1引起的。类似的结论证明HSYA的神经保护作用生成通过MTT试验(图测量1 (b)33258染色(图),赫斯特1 (c))和(图3 nt积累1 (d))。

3.2。HSYA抑制SIN-1-Induced PPARγ硝化和失活

寻找一个可能的机制来解释HSYA的有益作用,我们考虑PPARγ这是一个重要的因素在与氧化损伤的神经细胞防御机制(8,20.]。PPARγ被描述进行修改和灭活的硝化酪氨酸残基在nonneuronal细胞(21]。来确定神经元PPARγ对硝化反应的敏感性,PPAR的水平γ在硝化形式检测24小时后接触SIN-1有或没有HSYA。硝化PPAR的存在γ(nitro-PPARγ)是研究通过免疫沉淀反应与anti-PPAR从细胞中提取的蛋白质γ抗体,然后PPARγ免疫沉淀反应和anti-3-NT抗体免疫印迹(图2(一个))。同时,互惠的实验是由免疫沉淀反应蛋白质与3 nt抗体,然后与PPAR免疫印迹γ抗体(图2 (b))。在这两个实验的结果,导致增加PPAR SIN-1治疗γ硝化,逆转的cotreatment HSYA浓度的方式。然而,PPAR的丰度γ蛋白质不受SIN-1单独或结合HSYA。

可以离开PPAR Nitrative修改γ成为耐火材料激活的激活剂(21]。然后,我们评估是否SIN-1暴露PPAR的反应的影响γ其配体刺激。神经元在文化与15 d-pgj2孵化,PPAR的天然配体γ,6 h后24小时接触SIN-1单独或结合HSYA。PPARγdna结合活性被暴露于15 d-pgj2增加约2倍,仅表明PPAR的激活γ(图2 (d))。SIN-1 PPAR治疗抑制15 d-pgj2-induced抬高γdna结合活性,恢复的存在HSYA(图2 (d),在类比)。结果15 d-pgj2 HSYA也恢复了PPARγ罗格列酮的激活,合成为PPAR激动剂γ在SIN-1-treated神经元文化(图2 (d)B)。值得注意的是,PPAR的显著减少γ活动之后发现SIN-1单独接触,建议PPAR的损失γ对内源性配体,而治疗HSYA SIN-1完全弥补这个SIN-1-induced障碍(图2 (d),酒吧)。总的来说,HSYA-mediated PPAR的保护γ活动与改善神经损伤是相一致的。

最后,HSYA对PPAR的影响γ也观察到在正常神经元。PPAR都没有显著变化γ蛋白表达和dna结合活性检测(数据未显示),这表明HSYA本身并没有成为PPAR的直接诱导物γ活动。

3.3。HSYA恢复PPAR的保护作用γ受体激动剂对SIN-1-Induced细胞毒性

确定PPARγ活动中扮演着关键角色防御SIN-1-induced nitrosative压力,PPARγ特殊受体激动剂或拮抗剂添加到文化治疗前24小时SIN-1的毒性水平。作为显示在图3(一个),PPARγ受体激动剂(15 d-pgj2或罗格列酮)预处理明显减毒SIN-1-induced LDH释放,这被PPAR的copretreatment逆转γ拮抗剂GW9662。或者,预处理与GW9662独自加剧SIN-1-induced神经损伤(图3(一个))。这些结果表明PPARγ激活能增加抗SIN-1细胞毒性而PPARγ失活导致神经元SIN-1-induced侮辱更加敏感。

在另一项实验中,cotreatment PPARγ与SIN-1受体激动剂(15 d-pgj2或罗格列酮),然而,未能激活PPARγ(图3 (b))或保护神经元免受SIN-1-induced细胞毒性(图3 (c)),这表明preactivation PPARγ需要由SIN-1抑制神经元的侮辱。另外,PPAR的硝化反应γ引起SIN-1可以防止PPARγ激活,因此PPAR的神经保护γ受体激动剂。核实这最后的假设,神经元受到HSYA,轻快的高频的浓度,PPAR在一起γ受体激动剂+ SIN-1。在数据显示3 (b)和3 (c),HSYA和PPAR的综合治疗γ兴奋剂不仅救了PPARγ应对其激活剂(图3 (b)),但提供额外保护SIN-1-induced细胞侮辱罪与HSYA +相比(图组3 (c))。这些发现表明HSYA不仅本身具有神经保护能力,可以帮助恢复PPARγagonist-based保护SIN-1-induced侮辱。

3.4。HSYA抑制PPARγ硝化和损失的活动SIN-1-Injected老鼠的海马

对PPAR HSYA是否也有类似的影响γ体内,我们使用一个动物模型基于海马注射SIN-1 nitrosative压力。确认生产的过氧亚硝基SIN-1-injected海马体,3 nt表达以SIN-1注射后24小时。图4(一)显示SIN-1诱导时间增加3 nt富足,这是高出三倍比观察控制老鼠,24-hour-treated老鼠。HSYA管理明显改善3 nt SIN-1-injected海马体(数据表达和免疫反应性4 (b)和4 (c))。

然后我们检查nitro-PPAR HSYA的效果γ表达和PPARγ活动。如图5(一个),HSYA抑制nitro-PPARγ代由SIN-1注入剂量依赖性的方式(图5(一个))。PPARγ蛋白表达是不受SIN-1单独或与HSYA coinjection(图5(一个))。减少PPAR一致γdna结合蛋白SIN-1-injected海马活动被发现,由HSYA逆转治疗(图5 (b))。HSYA也恢复了PPARγ应对其配体15 d-pgj2 SIN-1-injected海马(图5 (b))。nitro-PPAR的细胞分布γ在海马体也为特征。如数据所示5 (c)和5 (d)3 nt的免疫反应性主要被发现在神经元与神经细胞标记表示其colocalization NeuN,暗示,诱导蛋白质硝化可能是由于神经元响应SIN-1注入。与此同时,PPAR的明显的叠加γ信号与3 nt信号,代表nitro-PPARγ观察到在大多数3-NT-positive细胞的细胞质,nitro-PPAR暗示γ也优先发生在海马的神经元。

相比之下在培养神经元SIN-1-induced侮辱,没有明显的细胞损失或apoptosis-like形态学观察大鼠注射SIN-1单独或与HSYA coinjected,所评估的赫斯特33258染色(图5 (e)),这表明单一注射SIN-1并不足以引起细胞损失和细胞凋亡。此外,空间记忆保留的差异不显著,与海马相关过程,可以发现在莫里斯水迷宫测试(数据不包括)。这些结果与以前的报告一致的SIN-1-injected海马(17]。PPARγ损失函数的神经元,然而,已被证明是与易感性增加有关氧化应激,这是bcl - 2抗凋亡蛋白的差别反映在对这些8]。因此,在海马体bcl - 2蛋白表达决心。PPAR发生变化γ和upregulation bcl - 2蛋白表达的差别类似的活动,对这些观察SIN-1-injected HSYA-coinjected老鼠,分别(图5 (f)),建议增加SIN-1-injected容易损伤海马和HSYA减少的潜在属性这一倾向。

独自管理HSYA正常大鼠无显著影响的测量指标(数据不包括)。

4所示。讨论

我们的实验表明,SIN-1-induced神经元损伤或增加了草药HSYA脆弱性明显减少。这种神经保护效应成立于两个神经元nitrosative文化和动物模型的压力。我们进一步证明HSYA的神经保护作用可能与抑制PPARγ硝化和SIN-1引起的失活。接下来,支持上述声明,PPAR的至关重要的作用γ在神经元防御nitrosative压力被显示PPAR的证据证实γ受体激动剂减毒SIN-1-induced神经元损伤但PPARγ拮抗剂加剧SIN-1-induced神经元损伤。最后,我们假定HSYA PPAR会增强γ介导的神经保护效应PPAR的抑制γ失活后与PPAR HSYA的综合治疗γPPAR激动剂获救的影响γ激活和PPARγ防止SIN-1-induced细胞毒性。

证据证明,PPARγ对氧化损伤神经元自卫是很重要的。例如,在PC12神经元细胞,PPARγ损失函数的增加对H₂O₂——或者β淀粉样蛋白(一个β-)诱导氧化毒性,而PPARγ超表达可以防止H₂O₂——或者一个β全身的活性氧产量和细胞的侮辱8]。一致,增加脑损伤和氧化应激在神经元PPAR观察γ击倒(N-PPARγko)小鼠大脑中动脉闭塞在回应20.]。同时,主要从N-PPAR神经元γko小鼠更容易受到氧化损伤,尽管PPAR不足γ不影响基线神经健康(20.]。支持这个概念,我们的研究表明,PPARγ也可能导致神经元的防御机制对nitrosative压力显示,PPAR吗γ受体激动剂减毒SIN-1-induced细胞毒性但PPARγ拮抗剂增强SIN-1-induced细胞毒性。事实上,在我们的研究中,一定程度的PPARγ活动展示了在控制神经元细胞和海马,暗示PPAR的激活γ通过内生天然受体激动剂,如15 d-pgj2或氧化脂质,在大脑的正常设置。PPAR SIN-1-induced减少γ活动在我们的研究中表明PPAR的损失γ这些内源性配体反应。持续、外生15 d-pgj2管理局,其生产已被证明是增加了SIN-1 [22),是PPAR无法增长γSIN-1-treated神经元和海马的活动。因此,我们推测SIN-1-induced PPARγ失活可能抑制PPARγ介导的防御系统,增加神经易受伤害,而HSYA PPAR的抑制γ失活可以保护你的防御系统,从而赋予更多阻力nitrosative强调神经元。

除了内生产生受体激动剂时,PPARγ也成为耐火材料的刺激体内受体激动剂在SIN-1失活后补充道。这可能有助于解释PPAR的一些发现γ对nitrosative agonist-based治疗压力,表明PPARγ没有PPAR受体激动剂有行动γ激活。它已被证明在MPP⁺注射/ MPTP药物模型PPAR的帕金森病γ活动是重要的注射防止MPTP药物毒性。然而,只有non-PPARγ介导的神经保护效应的观察罗格列酮MPTP-treated老鼠,这些行动的罗格列酮PPAR的upregulation没有联系γ目标基因和PPAR cotreatment无法逆转的γ拮抗剂(23]。一直在脑创伤模型,其发病机制还包括nitrosative压力,PPARγ受体激动剂吡格列酮证明通过机制与PPAR有益的功能γ激活(24]。2216年同意这些发现,NCX PPAR的非甾体抗炎药类γ通过PPAR激动剂,控制小胶质激活γ端依赖和PPARγ独立操作。长期治疗的小胶质与NCX 2216可以诱导PPAR文化γ硝化反应。硝化后,2216年NCX再也不能证明与PPAR相关联的影响γ激活;然而,它的PPARγ独立的影响仍在观察小胶质文化中(25]。在我们的研究中,PPARγ受体激动剂显著抑制SIN-1-induced特定PPAR在神经元细胞毒性而γ对手阻止这种抑制,表明效果被PPAR介导γ。然而,PPARγ介导的效果观察PPAR的预处理方案γ受体激动剂而不是cotreatment方案。我们推测cotreatment可能由于PPAR的无效γ硝化和随后的失活,自cotreatment HSYA结合PPARγ对PPAR激动剂表现出协同的影响γ激活和cytoprotection。需要进一步调查证实这是否协同作用HSYA PPAR的抑制有关γnitrative修改,从而允许更有效的PPAR的激活γ受体激动剂。

在我们的在活的有机体内研究中,SIN-1-induced PPARγ提出了硝化和失活主要发生在海马的神经元。一致与我们的结果,τ蛋白已被确定为目标之一的过氧亚硝基和硝化τ蛋白也建议有很强的神经签名(17]。同样,peroxynitrite-induced 3 nt表达式也被证明是主要积累在神经元在脑缺血/再灌注损伤的急性期(26),虽然没有评估目标蛋白质硝化。蛋白在神经元的原因容易nitrative修改过氧硝酸盐可能与低浓度的抗氧化剂在神经元胶质细胞(27]。需要特别注意的是低浓度的减少谷胱甘肽(GSH)。细胞的敏感性过氧亚硝基毒性已被证明的数量很大程度上取决于细胞内谷胱甘肽(28]。谷胱甘肽浓度在星形胶质细胞、神经元是1/2的活动γ-glutamylcysteine合成酶,谷胱甘肽合成的关键酶,大约是几折低比星形胶质细胞的神经元。(27]。这么低的抗氧化潜力可能倾向于神经PPARγ过氧硝酸盐硝化和失活反应损伤。另一方面,严重依赖于它们的代谢耦合神经元与星形胶质细胞对抗氧化应激。星形胶质细胞产生和秘密保护神经元以及谷胱甘肽为神经元提供前体合成谷胱甘肽(14,29日]。没有抗氧化剂星形胶质细胞的支持,高易感性的神经元氧化损伤(14,29日]。这可能会提供一个可能的解释在我们的研究显示,观察有SIN-1-induced neuron-enriched文化系统中重要的细胞损伤而没有毒性(细胞凋亡或细胞损失)细胞SIN-1-injected观察海马。

bcl - 2抗凋亡蛋白已被证明是一个关键的下游PPAR的目标γ信号的神经元免受氧化应激(8,30.,31日]。PPARγ损失函数的差别导致了对这些bcl - 2蛋白在神经元,从而使细胞受到氧化的侮辱(8]。PPARγ受体激动剂保护神经元免受氧化损伤通过增强bcl - 2表达(8,30.]。此外,假定的PPARγ响应元件(PPRE)已经被报道在3未翻译的bcl - 2基因(32),这表明PPAR的依赖γ。一直,在我们的研究中,PPARγ硝化和失活是伴随着一个平行SIN-1-injected马体bcl - 2表达下降。这个数据可能会提供一个额外的链接到我们的猜测SIN-1-induced PPARγ硝化和失活在活的有机体内可能反映在脑损伤的脆弱性增加。与此同时,由SIN-1差别bcl - 2抑制对这些支持HSYA的保护作用。进一步的研究是必要的确认PPAR之间的关系γ和bcl - 2在我们的研究中。

在神经系统中,蛋白质酪氨酸硝化代表一个主要的细胞毒性通路在peroxynitrite-mediated nitrosative压力。然而,其他PPAR的共价修饰γ不能排除来解释我们的一些观察。例如,PPARγ是修改通过磷酸化丝氨酸残基(33]。研究已经证明,过氧亚硝基,作为信号分子,调节增殖蛋白激酶(MAPK)调解的信号转导通路。PPARγ包含一个MAPK网站,磷酸化细胞外signal-regulated激酶(ERK)——1/2导致PPAR的抑制γ活动(33]。据报道,过氧亚硝基强有力地激活ERK1/2在各种细胞类型,包括神经细胞(34,35]。因此,PPARγ可能是容易的磷酸化改性nitrosative条件。我们假设增加酪氨酸硝化SIN-1治疗后是PPAR的失活的主要原因γ。然而,可以肯定的是这种假设,PPAR的程度γ硝化没有改变其他氨基酸必须决定在将来的研究中。此外,特定的PPAR酪氨酸残基γ硝化是还需要确定。

实际上,许多额外的转录因子表现出敏感活性氧和氮oxide-related物种,例如,NF -κB AP-1和p53。转译后的改造起着重要的作用在调节转录因子的活动在氧化和nitrosative压力。例如,研究表明NF -κB驻留在细胞质中一个不活动的复杂的抑制剂κ废话,在细胞质中促进NF -氧化条件κB激活。磷酸化的我κB蛋白代表一个收敛点对大多数信号转导途径在氧化条件下导致NF -κB激活(36]。最近的数据也透露过氧亚硝基刺激NF -κ我通过硝化酪氨酸的激活κB,从而增加我κB降解[37]。有人推测转译后的修改转录因子是一种机制,细胞氧化还原变化(38]。因此,PPARγ硝化反应和随后的失活可能为神经元提供一个信号传感nitrosative条件神经元。

尽管HSYA亲水性药物口服生物利用度较低,HSYA穿过血脑屏障的能力之前已经确认后静脉HSYA管理局(19]。此外,由于血脑屏障破坏大脑的不同程度在许多病理条件下,如中风或创伤性脑损伤,它不应该构成重大障碍HSYA交付这些设置。事实上,证据已经证明,HSYA吸收的脑组织创伤性脑损伤后大鼠口服接种与HSYA [12]。这些数据验证HSYA的作用可能源于其中央效应在我们的研究中。

在我们之前的研究中,我们已经表明,HSYA深刻地防止酪氨酸硝化引起真正的过氧硝酸盐在无细胞系统中,指示HSYA作为一个过氧亚硝基清道夫的作用[2]。因此,我们推测HSYA可能通过直接清除过氧硝酸盐和/或其衍生自由基抑制nitro-PPARγ形成SIN-1-induced神经元。HSYA的结构是quinochalcone c-glycoside [39]。群芳香酮类化合物,与抗氧化活性有关。此外,化合物会直接与过氧亚硝基反应(40]。可能HSYA可以作为底物竞争peroxynitrite-triggered反应,因此保护自由酪氨酸和酪氨酸残基的蛋白质从nitrative修改。是否HSYA专门进行过氧硝酸盐,但不超氧化物或没有,需要确定。最近,HSYA证明大脑的调节内源性抗氧化防御系统通过增加抗氧化酶的活性,包括超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT),以及谷胱甘肽(GSH)的比例/二硫化谷胱甘肽(GSSG) [12]。这种效应可能也参与其机制PPAR的抑制γ硝化反应。

我们目前的数据和其他表明PPARγ对神经元的防御机制是至关重要的对nitrosative压力和氧化应激,这两种作用在许多神经退行性疾病的发病机理。因此,保持PPARγ功能活跃可能成为尤其重要的神经元退行性疾病。HSYA PPAR的防范SIN-1-induced负调控γ活动可能有助于在其余nitrosative压力的控制和治疗神经退行性疾病提供了新的治疗机会。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者没有利益冲突。

作者的贡献

李太阳和Yan-Wei徐贡献同样这项工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(号。81571201,81401023,81601039),天津市科学技术委员会(zczdsy01900 13号和14 jczdjc35400),天津市教育委员会(没有。131年创新人才团队训练项目2016年)。

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