文摘

适度饮用咖啡与心血管疾病死亡率呈负相关;然而,这种因果效应机制尚不清楚。咖啡醇、二萜中发现咖啡,有各种属性,包括抗炎性质。本研究调查的影响咖啡醇cyclic-strain-induced炎性分子在血管内皮细胞分泌。细胞培养在静态或循环应变条件下,分泌的炎症分子决心使用酶联免疫吸附试验。咖啡醇的影响在增殖蛋白激酶(MAPK)、血红素oxygenase-1 (HO-1)和sirtuin蛋白1 (Sirt1)信号通路研究利用免疫印迹和特定的抑制剂。咖啡醇减毒cyclic-strain-stimulated细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1)、单核细胞化学引诱物蛋白- 1 (MCP),和白介素- 8 (IL)的分泌。咖啡醇抑制细胞外signal-regulated cyclic-strain-induced磷酸化的激酶和p38 MAPK。相比之下,咖啡醇调节cyclic-strain-induced HO-1, Sirt1的表情。添加锌原卟啉IX、sirtinol或Sirt1沉默(转染Sirt1 siRNA)显著减毒cafestol-mediated调节影响cyclic-strain-stimulated ICAM-1, MCP-1,引发分泌。 This is the first study to report that cafestol inhibited cyclic-strain-induced inflammatory molecule secretion, possibly through the activation of HO-1 and Sirt1 in endothelial cells. The results provide valuable insights into molecular pathways that may contribute to the effects of cafestol.

1。介绍

心血管疾病(CVD)全球死亡率高,已成为一个重要的健康问题,尤其是在考虑人口老龄化。流行病学研究表明,适度饮用咖啡逆相关死亡是由于心血管疾病(1]。然而,研究评估机制之间的良好关系咖啡消费和减少心血管疾病的风险因素是极其有限的。内皮炎症与心血管不良事件的风险高(2,3),在心血管疾病的发展中扮演着重要角色4]。等天然化合物存在于咖啡、酚类化合物、黄酮类化合物,已报告和咖啡酸衍生物,具有抗炎性质(5]。这抗炎性质可能负责咖啡消费之间的良好关系和心血管疾病死亡率较低6,7]。在天然化合物中,咖啡醇,二萜分子发现的樱桃Coffea阿拉比卡拥有各种属性,包括抗炎(8,9)和反血管增生属性(10,11]。然而,咖啡醇对血管内皮细胞的影响仍有待澄清。

慢性炎症在内皮细胞产生各种炎症介质,加重内皮功能障碍(12]。内皮功能障碍引起的炎症在心血管疾病的发病机制中起着主导作用,包括动脉粥样硬化、高血压、和diabetes-induced血管病变和血管重建13,14]。血管内皮细胞是永久暴露于机械拉伸。机械拉伸,尤其是循环应变,调节血管内皮细胞的功能通过调节许多基因的表达。在血管内皮细胞中,循环应变被证明能增加活性氧(ROS)生产,导致upregulation细胞粘附分子和细胞因子(15,16]。此外,循环应变的内皮细胞激活几个蛋白质参与基因表达的调控,包括增殖蛋白激酶(MAPK) [17]。MAPK家族包括细胞外signal-regulated激酶(ERK) c-Jun NH2终端激酶(物),和p38,这被认为是proatherogenic炎症基因表达的主要监管机构中内皮细胞。粘附分子和炎症细胞因子由循环应变已确定在内皮细胞,包括细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1)、单核细胞化学引诱物蛋白- 1 (MCP),和白介素- 8 (IL) (15,16,18]。粘附分子和炎症细胞因子可能发挥关键作用在心血管疾病的发病机制19]。然而,咖啡醇cyclic-strain-stimulated炎性分子生产的影响尚不清楚。

许多天然膳食化合物被认为提供防止氧化应激的保护,已报告和一些化合物诱导基因在抗氧化防御核E2-related的激活因子2 (Nrf2)或sirtuin蛋白1 (Sirt1) [20.,21]。MAPK家庭中扮演着重要的角色在细胞外信号转导细胞反应通过磷酸化的级联事件(22]。循环应变刺激Nrf2表达,导致后续的抗氧化酶的表达,如血红素oxygenase-1 (HO-1),在拉伸内皮细胞(23]。的转录因子Nrf2减轻cyclic-strain-induced引发表达的上调表达HO-1 [24]。我们最近报道说,咖啡醇抑制urotensin II-induced引发表达和细胞增殖通过Nrf2 / HO-1-dependent机制在内皮细胞(25]。此外,Sirt1是人类直接同源的酵母沉默信息监管机构2 (Sir2)蛋白质扩展寿命低等生物的26]。通过与几个交互目标蛋白质,Sirt1执行各种细胞功能包括内皮保护血管疾病(27]。Sirt1发挥抗炎作用的调制人类脐静脉内皮细胞的细胞因子水平(HUVECs) [28]。几种天然和合成化合物Sirt1激活,促进内皮细胞内稳态(27,29日]。然而,咖啡醇对MAPK的影响,在cyclic-strain-activated HO-1, Sirt1表达血管内皮细胞仍有待确定。在这项研究中,我们调查的影响调制的咖啡醇cyclic-strain-stimulated炎性细胞因子的生产和确定的细胞内机制可能负责咖啡醇的假定的影响。

2。材料和方法

2.1。抗体和试剂

纯咖啡醇(溶解在二甲亚砜)和所有其他化学试剂级的获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。所有的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自Abcam(英国剑桥)。Antibody-directed磷酸化ERK、磷酸化p38和磷酸化物抗体从细胞信号获得生物技术(美国贝弗利,MA)。从Sigma-Aldrich Anti-MCP-1购买。Anti-ERK、anti-p38 anti-JNK、anti-HO-1 anti-Sirt1, anti-GAPDH抗体购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。

2.2。内皮细胞培养

HUVECs取自PromoCell(德国海德堡),如前所述[30.]。本研究中使用的所有内皮细胞从第三到第四个段落。

2.3。在体外循环压力培养内皮细胞

膜内皮细胞培养在一个灵活的基础受到循环应变产生的正弦负压的计算机控制的应用,如前所述[31日]。

2.4。ELISA的促炎的分子

肿瘤坏死因子的检测α(肿瘤坏死因子-α)、ICAM-1 MCP-1、il - 6和引发上层清液,细胞治疗,没有咖啡醇12 h,然后循环应变处理24 h。在1000转离心10分钟后,上层清液收集测量TNF -αICAM-1 MCP-1, il - 6,引发水平细胞媒介ELISA。商用ELISA试剂盒(Abcam,剑桥,英国)是根据制造商的使用协议(30.]。

2.5。细胞内ROS分析

使用荧光探针2细胞ROS进行了分析 ,7 -dichlorodihydrofluorescein二醋酸盐(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国),被动扩散进入细胞裂解和氧化2 ,7 二氯荧光素(DCF),如前所述32]。

2.6。RNA提取和定量聚合酶链反应分析

从血管内皮细胞总RNA提取使用试剂盒制造商推荐的方法根据协议(热费希尔科学)。提取的RNA被用来合成单链DNA互补(c)通过使用高容量cDNA逆转录工具包(美国应用生物系统公司,培育城市,CA),如前所述[30.]。HO-1信使RNA (m)量化使用TaqMan基因表达主人(应用生物系统公司)与特定的引物组合ABI 7300实时PCR系统(应用生物系统公司)。TaqMan基因表达分析工具包包含特定的引物HO-1 GAPDH和从应用生物系统公司获得。特定的引物GAPDH是用来标准化样本的数量。在三个独立的实验样本量化一式三份。

2.7。免疫印迹分析

每次实验后,细胞被洗两次150年冷PBS和收获μL(裂解缓冲(10毫米Tris-HCl, pH值8.0,0.1% Triton x - 100, 320毫米蔗糖,5毫米EDTA, PMSF 1毫米,1 mg / L亮抑酶肽1 mg / L抑肽酶,和2毫米二硫苏糖醇)。细胞匀浆离心机在10000 g×20分钟在4°C。得到的上层清液被用作细胞蛋白质。样本包含40μ解决了g细胞蛋白质电泳,然后转移到硝化纤维膜。免疫印迹分析如前所述[30.]。蛋白质的乐队在西方的屁股量化的数据使用ImageJ微密度分析软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

2.8。Sirt1短干扰(si) RNA转染

Sirt1核小干扰rna从圣克鲁斯和控制使用Lipofectamine转染试剂,如前所述的和实验(24]。

2.9。统计分析

所有实验至少重复三次。给出的数据 错误的意思。使用学生的统计分析t以及方差分析,在适当的地方,其次是Dunnett的多重比较检验,通过使用Prism 3.0版本Windows (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。一个 < 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。咖啡醇对ICAM-1 MCP-1,引发分泌在Cyclic-Strain-Treated HUVECs

内皮细胞培养在弹性膜生产基地受到变形应变的平均水平(−20 kPa, 1 Hz)。细胞因子释放到培养基的水平测量。图1(一)用ELISA测量显示了平均水平的细胞因子在三个独立的实验。肿瘤坏死因子的水平α和il - 6没有受到治疗24小时循环应变的影响。相比之下,引发的水平,ICAM-1, MCP-1显著增加循环应变的应用后24 h与静态控制细胞。评估的影响咖啡醇炎性蛋白表达在cyclic-strain-treated HUVECs, MCP-1蛋白表达检测采用免疫印迹分析。如图1 (b)循环应变治疗增加MCP-1蛋白表达,咖啡醇(3和10μ米)减毒这MCP-1蛋白表达增加。接下来,我们评估的影响咖啡醇分泌的炎症蛋白质MCP-1 ICAM-1,利用ELISA引发。如数据所示1 (c)- - - - - -1 (e),与咖啡醇预处理(3和10μ米)12 h显著抑制cyclic-strain-induced ICAM-1,引发,MCP-1蛋白质分泌。

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图1
咖啡醇抑制cyclic-strain-induced HUVECs炎症分子的分泌。HUVECs种植在Flexcell板块受到循环应变24 h。控制细胞在静态条件下。(一)循环应变的影响(−20 kPa)申请24小时在细胞因子的生产。值 ( )。 与静态控件。(b) MCP-1表达检测利用免疫印迹分析与相应的抗体。GAPDH染色被用作标准化控制。上面的面板是代表三个独立的实验。较低的面板:条形图显示了折叠蛋白表达增加与静态控制细胞。可溶性MCP-1 (c), ICAM-1 (d),并引发文化传媒(e)生产使用ELISA是评估; , 与静态的对照组。 与循环应变小组。
3.2。抗氧化效果的咖啡醇Cyclic-Strain-Induced ROS、ICAM-1 MCP-1,引发生产

ROS增加产量以应对循环应变在HUVECs被描述15,16,31日]。因此,我们研究了活性氧产量HUVECs为了应对循环应变。暴露于循环应变为2 h导致细胞内活性氧的积累。验证后cyclic-strain-dependent DCF荧光,我们评估是否cyclic-strain-induced ROS生产和炎性分子蛋白质分泌可以减少通过抑制ROS咖啡醇。如图2(一个)诱导活性氧的生产,避免了循环应变与抗氧化剂预处理N乙酰半胱氨酸(NAC)和咖啡醇。此外,预处理与南汽和咖啡醇阻止炎症分子的生产,包括引发,ICAM-1,和MCP-1应对循环应变(图2 (b))。这些结果表明,咖啡醇抑制cyclic-strain-induced引发,通过抑制ROS ICAM-1, MCP-1生产。

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图2
抗氧化效果的咖啡醇cyclic-strain-induced ROS生产和HUVECs炎症分子的分泌。细胞用咖啡醇预处理(10μ米)12 h或NAC(10毫米)2 h,然后暴露于循环应变24 h。(一)ROS生产化验使用贴现。(b)蛋白表达水平使用ELISA检测。条形图显示了折叠蛋白质分泌增加而控制细胞。结果显示为 ( )。 与未经处理的控制; 与细胞暴露于循环应变。
3.3。咖啡醇抑制Cyclic-Strain-Activated MAPK信号通路

内皮细胞激活的循环应变一些蛋白质,包括MAPK,这被认为是在炎症基因表达的主要监管机构(33]。HUVECs循环应变处理不同时期,与特定的抗体和细胞溶解产物免疫印迹。如数据所示3(一个)- - - - - -3 (c),循环应变诱导ERK的磷酸化,物和p38峰值在HUVECs 30分钟。研究咖啡醇如何影响cyclic-strain-induced MAPK磷酸化,HUVECs服用10μM咖啡醇循环应变前12 h治疗30分钟。图3 (d)表明咖啡醇治疗(10μ米)显著预防cyclic-strain-induced磷酸化ERK和p38。这些结果表明,抑制MAPK信号通路可能与调节效应有关的咖啡醇cyclic-strain-treated HUVECs。

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图3
(a - c)循环应变对MAPK磷酸化的影响。代表西方滴phosphospecific和总ERK (a),物(b),和p38 (c)从细胞溶解产物收集在指定的时间后循环应变处理。光密度测量得到确定的相对数量磷酸化MAPK规范化的各自总MAPK。的值( , )表明磷酸化的褶皱变化相对于静态控制为每个单独的实验。 从静态控件显示显著差异( )。(d) MAPK的咖啡醇对cyclic-strain-induced磷酸化的影响。上面板:西方滴phospho-ERK, phospho-JNK, phospho-p38 HUVECs用咖啡醇预处理(10μ米)12 h,然后循环应变处理30分钟。较低的面板:定量分析MAKP stretch-induced磷酸化。结果四个人实验和表达为代表 ( )。 与未经处理的控制; 与细胞暴露于循环应变。
3.4。咖啡醇提高HO-1 Cyclic-Strain-Treated内皮细胞中表达

天然产物已经演示了激活HO-1抑制cyclic-strain-induced引发表达血管内皮细胞(24]。我们研究了咖啡醇如何影响HO-1表达式的循环应变。图4(一)表明循环应变处理稍微刺激HO-1 mRNA表达,与咖啡醇预处理(10μ米)增强HO-1 upregulation。图4 (b)显示结果中观察到平行mRNA表达,治疗与循环应变HUVECs 12 h稍微调节HO-1蛋白质表达和咖啡醇增强HO-1表达式。进一步调查是否减少炎性分子蛋白表达在cafestol-pretreated细胞依赖HO-1活动,HUVECs服用锌原卟啉IX (ZnPP)的有力竞争抑制剂HO酶活性,30分钟,其次是咖啡醇接触前12 h为24小时循环应变。图4 (c)显示添加ZnPP (1μ米)减毒cafestol-mediated调节的效果。这些结果表明,HO-1活动可能参与咖啡醇的抑制作用cyclic-strain-induced引发,ICAM-1和HUVECs MCP-1生产。

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图4
咖啡醇对HO-1表达的影响的循环应变处理。HUVECs服用咖啡醇12 h循环应变治疗前12 h。(a)的mRNA水平分析了HO-1通过qPCR GAPDH和规范化。(b)免疫印迹HO-1和执行GAPDH和乐队使用ImageJ量化。数据代表 三个独立的实验。 与未经处理的控制; 与细胞暴露于循环应变。(c)的影响抑制HO-1在蛋白质表达水平使用ELISA检测。与Znpp HUVECs经过了30分钟,咖啡醇(10μ米)然后添加循环应变前12 h治疗24小时。数据代表了 四个独立的实验。 与未经处理的控制; 与细胞暴露于循环应变。 与细胞暴露于循环应变+咖啡醇治疗。
3.5。影响Sirt1激活的咖啡醇,Sirt1在Cyclic-Strain-Induced抑制炎症分子的蛋白质分泌

越来越多的证据表明,Sirt1在心血管细胞功能中扮演着关键角色在衰老和疾病27]。最近的一项研究表明,Sirt1表达减少年龄和动脉粥样硬化血管在活的有机体内(34]。在这些结果的基础上,我们研究是否炎症分子的调制的咖啡醇生产cyclic-strain-stimulated细胞由Sirt1介导。咖啡醇调节Sirt1蛋白水平cyclic-strain-treated HUVECs(图5(一个))。相比之下,Sirt1抑制剂sirtinol减毒Sirt1的感应循环应变但ICAM-1的表达增强,引发,MCP-1蛋白质(图5 (b))。Sirt1的角色在ICAM-1循环应变表达式的抑制,引发,MCP-1咖啡醇也检查了Sirt1的沉默。细胞转染Sirt1核,紧随其后的是咖啡醇治疗(10μ米、12 h)、废除咖啡醇的抑制作用的循环应变表达式ICAM-1,引发,MCP-1分泌。相比之下,控制核(100海里)未能阻止咖啡醇的抑制作用。这些结果表明,咖啡醇的影响与调节Sirt1的表情,和咖啡醇的抑制作用在cyclic-strain-induced ICAM-1,引发,MCP-1蛋白质分泌内皮细胞至少部分取决于Sirt1。

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图5
影响咖啡醇,Sirt1抑制剂sirtinol HUVECs cyclic-strain-induced炎性分子蛋白表达。(一)咖啡醇对Sirt1表达的影响。细胞用咖啡醇预处理对12 h或sirtinol 2 h,然后暴露于循环应变24 h。蛋白表达是研究利用免疫印迹。的数据是代表三个独立的实验。条形图显示了折叠蛋白表达与控制细胞的增加。(b)的影响抑制sirtinol Sirt1的蛋白表达水平上使用ELISA检测。HUVECs是用咖啡醇预处理前12 h或sirtinol 2 h循环应变治疗24小时。(c) Sirt1 siRNA对蛋白表达水平的影响,用ELISA检测。转染细胞使用10μM咖啡醇12 h,然后接受治疗24小时循环压力。数据代表了 四个独立的实验。 与未经处理的控制; 与细胞暴露于循环应变。 与细胞暴露于循环应变+咖啡醇治疗。

4所示。讨论

根据文献综述,适度饮用咖啡似乎是安全的,与中性的有利影响的大多数研究健康结果(35]。咖啡的主要天然产品,部分解释它的有利影响是双萜,如咖啡醇(36]。天然产物与强有力的抗炎效应等优势和高可用性得到了相当大的关注近年来(37]。炎症性疾病通常涉及许多复杂的机制和途径;因此,只有一种药物是不足够的治疗炎症。使用的药物是一种实用和有益的方法。天然产物通常有多个目标相互作用和有强烈的治疗效果;因此,天然化合物的组合将是有用的治疗急性和慢性炎性疾病在实践中(38]。血流动力学部队在心血管疾病的发病机制的作用受到越来越多的关注。因为趋化因子ICAM-1 MCP-1,引发调节免疫细胞与内皮细胞粘附和集成过程(39),他们可以成为潜在的治疗靶点。我们的实验表明,在一些细胞因子检查,机械拉伸增强引发的生产,MCP-1, ICAM-1人类内皮细胞。MCP-1活动有力的单核细胞的趋化作用,被认为是一个关键分子参与心血管疾病(40]。增加表面表达的ICAM-1 cyclic-strain-activated引发的血管内皮细胞和当地生产可能引起白细胞趋化性的特大的地区船舶和脉管系统造成额外的伤害,导致血管损伤的恶化(41]。这些观察结果可能会提供一个解释早期血管壁的机械拉伸之间的联系和CAD的预测风险。在这项研究中,我们观察到咖啡醇作为一种强有力的抑制剂cyclic-strain-stimulated ICAM-1, MCP-1,引发生产在内皮细胞。这些发现进一步支持咖啡醇的抗炎效果。

循环应变诱导活性氧的生产在体外(15,16,31日]。在当前的研究中,我们发现咖啡醇和南汽,谷胱甘肽的合成前体,阻塞cyclic-strain-mediated ROS生产,以减少DCF荧光。我们还发现,咖啡醇减毒的cyclic-strain-induced磷酸化ERK和p38。循环应变诱导活性氧的生产和随后导致激活MAPK信号(42]。因此,它是合理的推测咖啡醇变弱cyclic-strain-induced MAPK磷酸化的抑制活性氧的生产。除了直接的抗氧化活性,天然产品,包括咖啡醇,也可以激活细胞内信号通路,比如Nrf2 / HO-1途径,延长细胞防御反应(24,25]。HO-1催化血红素降解的病原反应步骤,导致胆绿素的生成和CO .)胆绿素和胆红素、胆绿素还原酶的作用,形成强有力的抗氧化剂。此外,有限公司的主要产品HO-1活动,起着保护的作用在生理和病理条件下(43]。在目前的研究中,循环应变仅只有弱或无关紧要的诱导HO-1表达式。然而,咖啡醇预处理增强HO-1水平的增加,证实了HO-1的调节作用的竞争性抑制剂Znpp。这些结果提供进一步的证据表明咖啡醇提高HO-1表达式,从而进行清除多余的自由基产生的循环应变。此外,目前的数据表明,咖啡醇的抗炎作用,至少在一定程度上,由于其诱导HO-1表达式。

到目前为止,一些天然和合成物质,已报告说ergothioneine, Sirt1激活和促进内皮细胞内稳态(29日,44]。此外,许多研究支持心血管作用sirtuin活化剂(例如,白藜芦醇),以及其他新兴调节器的蛋白质乙酰化作用,包括姜黄素,和厚朴酚,oroxilyn,槲皮素,epigallocatechin-3-gallate, bakuchiol,酪醇,和小檗碱和sirtuin-activating化合物的发展,如保健品、慢性病管理近年来吸引了相当多的研究兴趣(45]。我们还发现,咖啡醇增强Sirt1的表达式在cyclic-strain-treated HUVECs。sirtinol Sirt1抑制剂的存在或Sirt1的沉默,没有观察到cafestol-mediated的抑制作用在cyclic-strain-induced ICAM-1,引发,MCP-1蛋白质分泌。这些结果表明,咖啡醇抑制cyclic-strain-induced ICAM-1,引发和MCP-1蛋白质分泌,可能通过调制Sirt1的表情。然而,额外的调查需要充分描述Sirt1之间的交互和cyclic-strain-induced炎性蛋白表达。

5。结论

咖啡醇抑制的分泌ICAM-1 MCP-1,引发和抑制ERK的磷酸化,p38 MAPK在cyclic-strain-treated HUVECs。咖啡醇的作用机制似乎与HO-1 upregulation, Sirt1的关联。我们的研究结果的基础上,咖啡消费可能被认为是心血管疾病的预防策略。这项研究的结果可能只是“冰山的一角”,和额外的研究需要了解咖啡消费的多样化和相互关联的角色在疾病预防。咖啡醇似乎减少炎症分子的总表达内皮细胞通过多种机制。这项研究提供了新的见解咖啡醇的抗炎作用。这项研究的结果支持咖啡醇对inflammation-dependent障碍的潜在应用。的upregulation HO-1 Sirt1表达和抑制cyclic-strain-induced ICAM-1, MCP-1,引发分泌咖啡醇可能是一些可能的机制负责咖啡醇对心血管系统的保护作用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Po-Yuan Chen Tzu-Hurng Cheng Hung-Hsing曹国伟,Ju-Chi刘的构思和设计实验;Wen-Rui郝进行实验;Wen-Rui, Po-Yuan陈,Tzu-Hurng程分析数据;Li-Chin唱、Chun-Chao陈和陈Jin-Jer贡献试剂和材料;和陈Po-Yuan Tzu-Hurng Cheng Hung-Hsing曹国伟,Ju-Chi刘写了论文。

确认

这项工作是支持部分由科学技术部(most105 - 2320 - b - 038 - 030和most106 - 2314 - b - 038 - 068 - my3)和新光吴Ho-Su纪念医院(skh -计算- 100 - 13博士和skh - 8302 - 100 - 04),台北,台湾。这手稿被华莱士编辑学术编辑。