文摘
维持细胞内稳态的能力在很大程度上是依赖于细胞给一个适当的应对各种内部和外部的刺激。我们最近提出,生死决定的内质网(ER)应激反应定义为自噬之间的串扰,细胞凋亡,mTOR-AMPK通路,瞬态开关从autophagy-dependent生存到凋亡细胞死亡是由GADD34控制的。本研究的目的是调查的角色epigallocatechin-3-gallate (EGCG),绿茶的主要多酚,在促进autophagy-dependent生存和验证的关键作用在连接GADD34 mTOR-AMPK通路在长期ER应激。我们的研究结果,通过使用HEK293T细胞,显示,EGCG治疗能延长细胞诱导自噬的可行性。我们确认EGCG-induced自噬mTOR-dependent PKA-independent;此外,它还需要ULK1。我们表明,与EGCG预处理细胞减少的负面影响GADD34抑制自噬(胍那苄或siGADD34治疗)。EGCG能够延迟凋亡细胞死亡的移植autophagy-dependent GADD34生存即使没有。我们的数据表明小说作用EGCG通过转移在促进细胞生存的平衡mTOR-AMPK通路ER应激。
1。介绍
绿茶是一种传统的中国茶制成的茶树的叶子,它已被证实能拥有深刻的生物化学和药理活性,包括抗氧化、抗炎、抗癌的属性(1- - - - - -3]。绿茶含有几个多酚组件,例如,儿茶素,表儿茶素,epigallocatechin-3-gallate (EGCG)。最丰富的绿茶多酚EGCG的影响已被证明在不同病理生理条件下,包括胰岛素抵抗、内皮功能障碍、缺血再灌注损伤(4- - - - - -6]。许多科学报告提出,绿茶能够影响一些生物过程通过抑制端粒酶,增殖蛋白激酶(MAPK),激活蛋白1,或核因子- (NF)κB (7]。它也已经表明,EGCG能够显著延长寿命几个压力条件下推迟衰老和衰老相关疾病(8- - - - - -10]。
细胞内稳态是由进化保存cytoprotective可控细胞消化过程,称为自噬(11]。细胞有剩余自噬活动甚至在生理条件下;然而,这个过程会在各种压力事件(即更有效率。剥夺、饥饿和生长因子)12]。在自噬,细胞组件成为隔离成一个双层膜囊泡,然后其内容发送到和降解溶酶体(13,14]。由于自噬在维持细胞内稳态的关键作用,这自食的过程正是监管(11]。有趣的是,过度自噬水平也是导致细胞死亡(15]。
自噬的关键角色之一是维护基本细胞活动和生存能力有限的养分有效性(下13]。因此,自噬是严格控制两个传感器的营养条件,mTOR和AMPK16- - - - - -18]。mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶mTORC1复杂,它的主要成分是mTOR通路(18,19]。这个复杂的是一个主监管机构通过集成来自内部和外部的输入信号,如生长因子、氨基酸、葡萄糖、和能量状态,控制生长和新陈代谢20.]。除了mTOR, AMPK(活化蛋白激酶)也感觉细胞能量状态和有至关重要的作用在维护能源体内平衡21]。AMPK严格控制ATP-consuming流程,如糖原和蛋白质合成,产生ATP(即移植过程。糖酵解)(22,23]。AMPK能够促进通过磷酸化的ULK1自食,自噬体形成的主要诱发者(17,21]。然而,ULK1也是由一个mTOR-dependent抑制磷酸化营养条件下(21]。此外,AMPK通过磷酸化直接抑制mTORC1复杂(17,21)表明一个适当的平衡AMPK-mTOR通路在生理条件是至关重要的。
最近一直认为EGCG可能诱发cytoprotective自噬在各种压力事件。治疗EGCG促进自噬小体的形成主要牛内皮和人类肝癌细胞(HepG2) (24,25]。EGCG废除palmitate-induced积累的脂质滴通过促进自噬流量(24]。自噬增强对EGCG政府不利的乙型肝炎病毒复制,因此它被认为是一个潜在的治疗策略25]。EGCG也有神经保护作用通过激活自噬抑制巴克斯和细胞色素c易位在prion-protein-induced赔偿26]。尽管EGCG的积极作用在增强自我吞噬各种疾病已经建议,这种天然化合物引起的监管机制的细节尚未透露。
黄等人表明,EGCG上调AMPK活性剂量依赖性的方式,虽然mTOR通路被抑制肝癌细胞(27]。对接实验也表明,EGCG是mTOR的ATP-competitive抑制剂(28]。金等人建议,EGCG增强自噬通过AMPK-mediated机制(24]。EGCG AMPK和ULK1刺激,有趣的是,但不是mTOR,表明polyphenol-induced自噬是独立于mTOR通路(24]。这些结果表明,AMPK EGCG作为增强剂;然而,它的影响mTOR途径仍然是矛盾的。
最近,我们已经证实,激活自噬cytoprotective作用在高水平的内质网(ER)压力(29日,30.]。这种瞬态的自噬mTOR和upregulation AMPK差别的特点是对这些。因此,mTOR和/或AMPK催化剂(如雷帕霉素、白藜芦醇和甲吡酮)能够推迟凋亡细胞死亡在过度ER应激(29日,31日]。EGCG能够恢复Ca2 +体内平衡表明其cytoprotective效果在ER应激(32];然而,EGCG-modulated ER应激反应的详细机制有待阐明。
在这项研究中,我们调查EGCG-dependent自噬的机制及其在ER应激作用通过使用人类细胞系。我们建议cytoprotective自噬了EGCG通过mTOR和ULK1监管。我们还表明,EGCG-induced自食过程是独立于PKA。在这里,我们目前的EGCG影响mTOR-AMPK的平衡,延迟凋亡细胞死亡的上调自噬在ER应激。我们的数据展示小说的影响机制EGCG ER应激的生死攸关的决定。
2。材料和方法
2.1。材料
Thapsigargin (Sigma-Aldrich T9033),衣霉素(Sigma-Aldrich T7765),雷帕霉素(Sigma-Aldrich R0395)胍那苄(Sigma-Aldrich,危)H89 (Adipogen ag - cr1 - 0002)和儿茶素酸酯(Sigma-Aldrich E4143)购买。所有其他化学试剂级。
2.2。细胞培养和维护
人类胚胎肾细胞系(写明ATCC HEK293T, crl - 3216)被用来作为一个模型系统。这是维护在DMEM(生活技术,41965039)中补充10%胎牛血清(生活技术,10500064)和1%的抗生素/抗真菌的(生活技术,15240062)。文化菜肴和细胞治疗板保持在37°C湿润孵化器95%的空气和5%的有限公司2。
2.3。sds - page及免疫印迹分析
细胞收获细胞溶解和20毫米三,135毫米氯化钠,10%,甘油和1% NP40, pH值6.8。细胞溶解产物中的蛋白质含量测定用皮尔斯BCA蛋白质化验(热科学,23225),和等量的蛋白质被用于分析。sds - page是由使用Hoefer miniVE (Amersham)。0.45蛋白质被转移到微孔μM PVDF膜。免疫印迹进行使用TBS渐变(0.1%),含5%脱脂奶粉,1%牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich A9647),或凝胶缓冲区(Sigma-Aldrich G8327)屏蔽膜和抗体的解决方案。加载控制为GAPDH开发膜或死亡在所有实验用朱红色年代。至少有三个独立的测量进行了在每一个实验。以下抗体应用:antiLC3B (SantaCruz, sc - 16755), antiCaspase3 (SantaCruz, sc - 7272), antiPARP(细胞信号,9542年代),antiULK - 555 p(细胞信号,5869年代),antiULK(细胞信号,8054年代),antip70S6-P(细胞信号,9234年代),antip70S6 (SantaCruz, sc - 9202), anti4-EBP1-P(细胞信号,9459年代),anti4-EBP1(细胞信号,9644年代),antiGADD34 (SantaCruz, sc - 8327), antieiF2α- p(细胞信号,9721年代),antieiF2α(9722年代)细胞信号antiAMPK-P(细胞信号,2531年代),antiAMPK(细胞信号,2603年代)和antiGAPDH(圣克鲁斯,6 c5)和HRP-conjugated二级抗体(SantaCruz, sc - 2354和细胞信号,7074年代到7076年代)。乐队是观想使用化学发光检测设备(热科学,32106)。
2.4。RNA干扰
RNA干扰实验使用Lipofectamine RNAi马克斯(表达载体)GIBCO™Opti-MEM我(GlutaMAX™- I) reduced-serum介质液体(表达载体)和20 pmol /毫升核。的siGADD34寡核苷酸买来ThermoFisher (HSS177543)和siULK寡核苷酸买来Ambion (AM16708)。200000年HEK293T细胞在37°C孵化有限公司2孵化器antiobiotic-free中16小时,然后RNAi duplex-Lipofectamine™RNAiMAX(表达载体,13778 - 075)复合物添加到细胞的过夜。然后新鲜培养基添加到细胞,并进行适当的治疗。检查GADD34沉默的效率,采用免疫印迹和GADD34单克隆抗体(SantaCruz, sc - 373815)。
2.5。RNA提取和实时PCR
使用试剂盒提取细胞总RNA含量RNA分离试剂(表达载体)33]。使用执行Retrotranscription SuperScriptII第一链合成系统(表达载体)。核酸水平测量使用GenQuant pro RNA / DNA计算器。等量的cDNA被用于实时PCR检查GADD34沉默的效率。PCR反应和实时检测进行使用GoTaq (R) qPCR大师(Promega A6002)和混合STRATAGENE Mx3005P实时PCR检测系统。实时PCR thermocycles以下:95°C 10分钟(1 x), 95°C 30秒,58°C 45秒,30秒72°C (40 x) 95°C 5分钟,55°C 1分钟,97°C 30秒(1 x)。适当的正向和反向实时PCR引物被用于GADD34和GAPDH。
2.6。细胞生存能力分析
相对数量的可行的细胞被伯克钱伯斯计算。使用CellTiter-Blue测定细胞活力检测(Promega G8080)。细胞生长和治疗在96 -孔板和孵化和刃天青2 h在37°C。吸光度测量在任意单位的620海里,并表示,与细胞毒性。至少有三个平行的测量进行了这些实验。
2.7。统计数据
对于微密度分析,免疫印迹数据获得使用ImageJ软件。乐队的相对密度是显示和归一化一个合适的总蛋白质或GAPDH乐队作为参考(见补充信息在这里)。为每个实验中,三个独立测量。结果给出了平均值±道。并使用方差分析比较图基的事后多重比较检验。星号表示统计上的显著差异从适当的控制: ; 。
3所示。结果
3.1。EGCG在剂量依赖性的方式影响自噬和凋亡
EGCG的有益健康的作用已被广泛研究。它已经表明,低浓度的EGCG增强HepG2细胞的生存能力;然而,它的高度集中导致可行的细胞的数量明显降低(34]。实验数据也显示,EGCG能够增强自噬和凋亡35]。为了弄清楚这些细胞过程相关的细胞生存能力EGCG治疗期间,我们进一步探讨绿茶多酚的作用在细胞生命和死亡之间的决策过程。首先,人类胚胎肾细胞(HEK293T)处理不同浓度(10、20、40和80μ米)EGCG的24小时,我们监控相对可行的细胞数量和细胞生存能力(图1(一))。对应于已经发表的数据,我们可以确认EGCG的低浓度(即。、10和20μ米)导致在细胞生存能力略有增加,而过度的多酚(即。,80年μ米)的可行的细胞数量减少了≈50%。
(一)
(b)
检测激活配置文件或水平的自噬的关键指标(如LC3II和ulk - 555 p)和细胞凋亡(EGCG期间procaspase-3裂解PARP)治疗,免疫印迹(执行数据1 (b)和S1)。在低浓度的EGCG(即。、10和20μ米),高比率的LC3II / LC3I和密集的磷酸化ulk - 555 p观察表明细胞生存能力是由EGCG autophagy-dependent地维护在一个定义良好的浓度范围。然而,高浓度的EGCG (80μ米)稍微减少的自噬活动,伴随着procaspase-3减少。活跃capase-3能够打通PARP;然而,我们没有观察到任何PARP乳沟表明EGCG-dependent凋亡可能发生在更高浓度的多酚。有趣的是,ER应激已经观察到低浓度的EGCG(见eiF2α- p GADD34水平数据1 (b)和S1),尽管eiF2磷酸化的数量α减少过度水平的天然化合物。
众所周知,EGCG增强AMPK,但其负面影响mTOR尚未深入研究。调查的作用EGCG AMPK-mTOR修改细胞平衡的途径,我们检测到的关键标记AMPK (AMPK-P ulk - 555 - p)和mTOR途径(如4-EBP1-P和p70S6-P)通过免疫印迹(数字1 (b)和S1)。EGCG治疗显著增强AMPK(见AMPK和ULK的磷酸化状态数据1 (b)和S1),而mTOR成为灭活。这是被p70S6的去磷酸化,磷酸化群4-EBP1最低的外观(数字1 (b)和S1)。
总的来说,这些结果进一步证实EGCG-induced自噬是不危险的人类细胞,而是帮助维持细胞生存能力;然而,过度的这种多酚可能促进凋亡细胞死亡。低剂量的EGCG能充分激活AMPK和抑制mTOR表明EGCG具有关键作用的不平衡AMPK-mTOR通路。
3.2。EGCG通过mTOR-AMPK诱发自噬通路
进一步探索EGCG-induced自噬通过贡献AMPK-mTOR途径,我们使用各种药物来增强自我吞噬。众所周知,雷帕霉素(Rap)治疗诱发自噬通过[差别mTOR对这些19),而h - 89是一个mTOR-independent PKA抑制剂和促进自噬(36)(图S2)。为了理解EGCG-induced自噬,我们对待HEK293T细胞与说唱(100 nM, 2 h)或h - 89 (2.5μ米,2 h)和EGCG (20μ米,24 h)没有与随后的说唱/ (100 nM, 2 h)或h - 89 (2.5μ米,2 h)。
我们发现综合治疗(即。,H-89 + EGCG and Rap + EGCG) did not cause a remarkable decrease in either cell viability or the relative amount of viable cells (FigureS3)。接下来,自噬的主要标志,AMPK和mTOR通路,通过免疫印迹检测(图2)。说唱+ EGCG治疗没有造成任何添加剂对自噬诱导的影响,AMPK活化,,差别和mTOR对这些建议EGCG和说唱法案通过同样的途径诱导自噬。有趣的是,合并后的治疗EGCG和h - 89有一个重要的添加剂对自噬诱导的影响,表明EGCG和h - 89采用不同的途径来促进自噬。尽管h - 89本身没有修改AMPK-mTOR通路的平衡,EGCG能够激活AMPK(见AMPK在图的磷酸化2)和表达下调mTOR(见4-EBP1-P图2)联合治疗。
(一)
(b)
我们的组合治疗实验表明EGCG不激活自噬PKA-dependent的方式。类似于说唱,EGCG,而诱发自噬通过AMPK-mTOR通路失去平衡。
3.3。ULK1 EGCG-Induced自噬是至关重要的
众所周知,AMPK和mTOR调节自噬通过磷酸化ULK1,这个细胞过程的关键控制要素之一(21]。虽然AMPK刺激ULK1通过磷酸化的Ser - 555和Ser - 777, mTOR抑制自噬的磷酸化不同Ser残留ULK1(即。ser - 757) [21]。因此,进一步确认的角色AMPK-mTOR EGCG-induced自噬通路,EGCG的影响——(20μ米,24 h)诱导自噬检测存在与否的ULK1(图3)。我们进行说唱(100 nM, 2 h)和h - 89 (2.5μ米,2 h)治疗控制。ULK1击倒使用siULK并不影响相对数量的可行的细胞表明ULK损耗不诱导细胞死亡(图3(一个))。
(一)
(b)
(c)
损耗的ULK1废除EGCG-induced自噬(参见低LC3II /我在数据率3 (b)和3 (c))。类似于EGCG,说唱是无法促进自噬在ULK1缺席的情况下,虽然siULK并不影响h - 89诱导自噬(参见LC3II /我在数据率3 (b)和3 (c))。这些结果进一步证实AMPK-mTOR-regulated自噬是独立于PKA通路。
综上所述,我们可以得出这样的结论:ULK1参与EGCG-induced自噬和转移mTOR-AMPK通路之间的平衡。
3.4。EGCG延迟凋亡细胞死亡在过度的ER应激水平
我们最近发现各种药物(如甲吡酮和白藜芦醇),这些失衡mTOR-AMPK通路,从而导致ER autophagy-dependent生存压力(31日,37]。EGCG影响激活AMPK和mTOR以来,我们检查了EGCG是否也有一个积极的影响在ER应激细胞的生存。
为了验证在ER应激的作用EGCG, HEK293T细胞用EGCG预处理(20μ米,24小时),然后添加一个ER应激源,如thapsigargin (10μ米,2 h)或衣霉素(25μ米,2 h)。而thapsigargin (TG)破坏钙存储的呃,衣霉素(TM)抑制N-linked分泌和膜蛋白的糖基化ER (38,39]。我们已经表明,TM -或TG-induced ER应激发生的瞬态峰值autophagy-dependent生存其次是凋亡细胞死亡(29日]。探索是否EGCG能够维持细胞生存能力ER应激后,两个相对可行的细胞和细胞生存能力的相对数量时发现EGCG + TG或EGCG + TM治疗(数字4(一)和5(一个))。之前的EGCG TG或TM显著延长细胞生存能力和推迟甚至细胞死亡在连续治疗过度的ER应激。我们的结果表明,这种多酚能够提高细胞生存能力。
(一)
(b)
(一)
(b)
为了检测EGCG对ER应激的影响,自噬,细胞凋亡,AMPK, mTOR标记随访期间EGCG + TG或EGCG通过免疫印迹(数字+ TM治疗时间4 (b),5 (b),S4,S5)。一个非常高水平的LC3II /我认为自噬依然活跃甚至两个小时后TG TM治疗,而无论是procaspase-3下降还是观察PARP的乳沟。这些结果表明,EGCG能够推迟通过自噬诱导凋亡细胞死亡在过度的ER应激水平。
密集的磷酸化AMPK和ULK (ser - 555残渣)表明,AMPK得到刺激,仍然活跃在年底前联合治疗(数字4 (b),5 (b),S4,S5)。mTOR通路下调了ER应激时之前与EGCG 4-EBP1-P之外(见“数字4 (b),5 (b),S4,S5)。
这些结果表明,EGCG诱发自噬通过mTOR-AMPK通路,失去平衡,这意味着它延迟凋亡细胞死亡在ER应激。
3.5。添加EGCG可以拯救GADD34抑制ER应激
最近,我们已经表明,ER应激反应机制的关键元素之一,被称为GADD34(增长逮捕和DNA damage-inducible蛋白质)与PP1(蛋白磷酸酶1),构成机械的ER应激和mTOR激活(之间的联系37]。有人还建议GADD34促进autophagy-dependent生存通过ER的表达下调mTOR压力或压力引起的突变杭丁顿蛋白的表达中蛋白质(37,40]。抑制GADD34 PP1抑制剂(即。,guanabenz) or transfection with siGADD34 results in a downregulation of autophagy-dependent survival and a quick activation of mTOR pathway, followed by apoptotic cell death during ER stress [37]。雷帕霉素和白藜芦醇治疗能够减少的负面影响的差别GADD34对这些促进自噬诱导,AMPK upregulation,和抑制mTOR37]。自从EGCG mTOR-AMPK平衡似乎是一个潜在的监管机构在细胞压力,多酚可能保护细胞通过自噬诱导下的GADD34即使没有ER应激。
GADD34时蛋白质水平得到迅速激活ER应激之前是EGCG加法(数字4 (b),5 (b),S4,S5)。我们甚至发现GADD34水平仍然高2 h长治疗后TM和TG假设其重要作用EGCG-induced自噬对ER应激。
探索EGCG预处理能否拯救GADD34 downregulation-induced凋亡细胞死亡ER应激后,我们进行了一个综合治疗。首先,HEK293T细胞治疗GADD34抑制剂,称为胍那苄(悬颅μM, 1 h),其次是EGCG (20μ米)24 h。然后ER应激诱导了TG (10μ米,2 h)或TM (25μ米,2 h)。EGCG预处理能够延长细胞生存能力和增加的相对数量可行的细胞在GB-pretreated细胞ER应激(图S6)。
我们分析GADD34抑制的影响在ER应激结合/没有EGCG通过检测自噬,细胞凋亡,AMPK, mTOR标记免疫印迹(数字6和7)。的失活GADD34被eiF2检测α- p。没有EGCG, GB很快会使引发自噬和凋亡细胞死亡在ER应激。然而,当细胞被用EGCG预处理,LC3II /我的高比率表明自噬在年底前彻底的治疗;与此同时,细胞凋亡仍不活跃。procaspase-3损耗和PARP乳沟中检测出EGCG的存在。有趣的是,EGCG能够诱导AMPK(见AMPK和ULK1人物的密集的磷酸化6和7)和表达下调mTOR(见4-EBP1-P数字6和7期间,GB)即使GADD34抑制ER应激。
(一)
(b)
(一)
(b)
这些数据表明,EGCG能够维持细胞生存能力通过autophagy-dependent生存即使没有GADD34 ER应激。我们的实验表明,由GB GADD34抑制的负面影响可以抑制mTOR-AMPK EGCG-induced失衡的途径对ER应激。
3.6。GADD34沉默的siRNA GB治疗也有类似的影响对ER应激
确认EGCG推迟ER应激通过GADD34凋亡细胞死亡,ER应激源和EGCG的联合治疗是在细胞小干扰rna (GADD34沉默着数字8和S7)。首先,我们测试的效率siGADD34 mRNA(数据未显示)和蛋白质(图S7A)的水平。类似于GB, GADD34沉默大大减少可行的细胞在治疗TG的数量,而预处理20μ24 h M EGCG能够维持细胞生存能力(图S7B)。的TG HEK293T细胞表达siGADD34导致短期和倾倒自噬响应(参见LC3II疲软/我比和ULK1磷酸化在图8),而早期观察细胞凋亡诱导,也就是说,损耗procaspase-3和外观的裂解PARP已经发现长1.5 h TG治疗后。相比之下,EGCG预处理可以维持autophagy-dependent生存和延迟凋亡细胞死亡即使没有GADD34(图8)。LC3II / LC3I ulk - 555 p水平仍然很高;与此同时,没有注意到caspase-3激活。在这些治疗方法相结合,AMPK也保持活动状态(见不断磷酸化AMPK和ULK1图8),而mTOR通路仍然阻塞(见4-EBP1-P图8)。类似的效果观察,利用TM(数据没有显示)。
(一)
(b)
这些数据进一步证实GADD34沉默的负面影响在ER应激可以获救EGCG加法。这种天然化合物能够失衡AMPK-mTOR通路,促进autophagy-dependent没有GADD34生存。
4所示。讨论
ER维持细胞内稳态的关键功能,包含一些主要监管元素的生死攸关的决定。因此,ER应激损失出现在很多不同的人类疾病如神经退行性疾病、肥胖、2型糖尿病、和许多其他41- - - - - -43]。使用这两种分子生物技术和理论,我们先前已经表明,凋亡细胞死亡之前总是autophagy-dependent生存在过度的ER应激水平(29日,31日]。因此,新发现自噬诱导物在未来可能成为有效的药物被推迟的有害影响ER应激。我们最近证实,自噬可以扩展的“生存窗口”通过预处理mTOR和/或AMPK催化剂(如甲吡酮和白藜芦醇)在ER应激(31日,37]。在这里,我们介绍一个新的候选人延长细胞的生存能力,也就是说,epigallocatechin-3-gallate (EGCG)。植物多酚类物质,包括绿茶黄烷醇,具有多效性的影响;然而,他们的许多特定分子靶点最近确认。黄烷醇被广泛称为抗氧化剂,但在某些情况下(例如,在三价铁)像prooxidants [44]。因为他们行为主要在细胞膜上,绿茶黄烷醇已知调制各种功能的ER (45),包括腔的酶活性(46,47)、膜运输过程(48,49),和氧化还原内稳态47]。还演示了,EGCG显著延长预期寿命,这是由于要么减少氧化应激和炎症(10]或诱导活性氧的生产(50]。然而,AMPK的参与/ SIRT1 FOXO轴似乎牢固确立。
我们的数据表明,低浓度的EGCG能够诱导自噬(数字1 (b)和S1)与细胞生存能力上升,表明自食的激活过程中引起的多酚是无害的细胞(图1(一))。与低浓度的EGCG预处理之后的ER应激源(TG或TM)可以延长autophagy-dependent生存(数字4 (b),5 (b),S4,S5);与此同时,细胞生存能力没有改变(数字4(一)和5(一个))和细胞凋亡(例如,PARP劈理)对ER应激(数据没有被观察到4 (b),5 (b),S4,S5)。安等人指出,有趣的是,过度的EGCG的细胞毒性效应是由于ER应激反应蛋白质的表达,如排骨、GADD34, ATF3 [34]。在这里,我们表明,翻译起始因子,eiF2α磷酸化,即使在低水平的EGCG(数字1 (b)和S1)。尽管eiF2α- p在关闭全球有关键作用的蛋白质翻译ER应激时,没有观察表明,激活细胞死亡的ER应激反应机制不是致命的。而这eiF2α引起的磷酸化作用EGCG上调GADD34水平至关重要。在这项研究中,我们假设GADD34水平增加平行于自噬诱导EGCG治疗(数据1 (b)和S1在绿茶),表明其重要作用polyphenol-induced细胞生存。
以前,我们已经表明,通过GADD34 mTOR表达下调与ER应激反应(37]。我们最近证实,阻塞GADD34结果快速激活mTOR通路和凋亡细胞死亡;同时,AMPK表达下调和autophagy-dependent生存期间要短得多在ER应激(37]。我们也认为GADD34损耗的负面影响是成功抑制mTOR和/或AMPK催化剂(如雷帕霉素和白藜芦醇)在ER应激(37]。进一步证实EGCG在mTOR-AMPK失去平衡的作用途径,药理抑制剂(GB)或的siRNA被用来阻止GADD34然后细胞用EGCG预处理之后添加一个ER应激。在这项研究中,我们表明,24小时长的预处理与低浓度的绿茶多酚后跟TG或TM除了能够延长细胞生存能力通过强化激活AMPK和自噬;与此同时,mTOR和ER stressor-induced凋亡细胞死亡是表达下调(数字6,7,8)。在这里,我们表明,EGCG治疗成功修改mTOR-AMPK通路的平衡,因此GADD34损耗的负面影响是有效地抑制。这些结果进一步证实EGCG-dependent微调mTOR-APMK途径维护有重要影响的精确平衡压力ER生死攸关的决定。
自从EGCG对mTOR通路的影响似乎矛盾的文献中,EGCG治疗结合要么mTOR-dependent(雷帕霉素)或PKA-dependent (h - 89)自噬启动子识别哪些通路参与自噬诱导的EGCG(图2)。自噬有同样增强EGCG和EGCG +说唱治疗显示,EGCG和说唱调节自食过程通过mTOR途径相同。然而,EGCG结合h - 89显著促进自噬而简单的h - 89治疗(图2),这表明不PKA-dependent EGCG-induced自噬。类似于雷帕霉素治疗,转染siULK大大抑制自噬在EGCG治疗(图3)确认绿茶多酚诱发自食过程通过ULK1-AMPK-mTOR监管网络。自从AMPK会使mTOR通过直接磷酸化途径,我们不能排除,EGCG既有直接或间接(通过AMPK) mTOR的负面影响。因此,还需要进一步的研究来确定EGCG的具体目标。
总之,预处理的积极作用EGCG的精确选择浓度实现人类细胞系通过促进autophagy-dependent生存。因此,绿茶消费或使用EGCG-loaded纳米粒子或胶囊治疗作用可能在不久的将来不仅在改善病人的症状遭受ER应激相关疾病,调节体重的热量限制模仿,但同样是没有独立于前者影响扩展寿命的人。我们有趣的发现强调EGCG延长寿命的潜在贡献mTOR-AMPK通路通过GADD34 ER应激。
缩写
| EGCG: | Epigallocatechin-3-gallate |
| mTOR: | 哺乳动物雷帕霉素靶 |
| AMPK: | 5活化蛋白激酶 |
| 说唱: | 雷帕霉素 |
| GB: | 胍那苄。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。
确认
作者感谢m . Marton。这项工作是支持的男爵异想天开的计划部门的医疗化学、分子生物学和Pathobiochemistry Semmelweis大学的布达佩斯,由unkp - 17 - 4 - iii - se - 75的新国家卓越计划人力能力,由国家研究、开发和创新办公室(K 112696、124813和125201年),和MedInProt格兰特匈牙利科学院。
补充材料
图S1: EGCG诱发自噬浓度的方式。图S2: h - 89治疗的影响细胞的生存能力。图S3: mTOR通路对EGCG-dependent自噬诱导至关重要。图S4: EGCG预处理延伸autophagy-dependent生存TG-induced ER应激。图S5: EGCG预处理延伸autophagy-dependent生存TM-induced ER应激。图S6: EGCG-dependent失衡mTOR / AMPK救援GADD34抑制ER应激。图S7: EGCG-dependent失衡mTOR / AMPK救援GADD34损耗对ER应激。(补充材料)