文摘

为了研究硫化氢的保护机制(H2在sepsis-associated急性肾损伤(SA-AKI),十AKI患者和10名健康对照组被录取。在安琪患者肌酐(Cre)、尿素氮(BUN)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和interleukin-1β(il - 1β)和髓过氧化酶(MPO)活动以及浓度的丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)相比显著增加与控制。然而,等离子体水平的H2减少和线性相关程度的Cre和面包。之后,一个阿基小鼠模型,腹腔内脂多糖(LPS)注射了在活的有机体内研究。在安琪小鼠H2年代与3-MST活动的下降和表达水平下降;相似的变化被观察到在上面提到的其他指标。然而,TLR4的表达的蛋白质,NLRP3, caspase-1显著增加小鼠肾组织后6 h有限合伙人注入。硫氢化钠能改善肾功能和肾组织病理学变化,减弱LPS-induced炎症和氧化应激,抑制TLR4的表达,NLRP3, caspase-1。我们的研究表明,内生H2年代参与SA-AKI的发病机制和外生H2年代发挥保护作用对LPS-induced阿基通过抑制炎症和氧化应激通过TLR4 / NLRP3信号通路。

1。介绍

阿基是一种临床综合症是由各种因素引起肾功能迅速下降。脓毒症是最常见的原因阿基(40% - -50%)在危重患者中,和SA-AKI的死亡率高达70% (1,2]。SA-AKI的发病机制很复杂,包括炎症、凝血级联激活,氧化应激,microcirculatory干扰,肾灌注不足,肾静脉阻塞(3,4]。尽管阿基的病理生理机制的理解,增长AKI的药理治疗的发展毫无进展。

有限合伙人是一个正常的组成部分,大多数革兰氏阴性细菌的细胞壁,它可以引发细胞因子合成、分泌,和随后的炎症过程。先前的研究已经表明,有限合伙人是脓毒症的最重要原因之一,参与SA-AKI的发病机制,这可能会导致“细胞因子风暴”,加剧了氧化应激,低血压,肾灌注不足,最后在肾功能逐渐下降5- - - - - -7]。toll样受体(通常)是最重要的模式识别受体,在先天免疫起着关键的作用。有限合伙人的主要受体TLR4 [8,9有限合伙人绑定后],它被激活,导致下游信号级联以及炎性细胞因子的表达(10]。Nucleotide-binding域和富亮氨酸重复蛋白质3 (NLRP3) inflammasome是其中最重要的nod样受体(NLR)家族的成员,包括NLRP3,适配器蛋白质ASC和半胱氨酸蛋白酶caspase-1。Abderrazak et al。11]发现NLRP3 inflammasome参与炎症过程,可能是脓毒症的发展的关键和阿基。激活NLRP3 inflammasome能促进成熟和释放促炎细胞因子il - 1β和地震。另一项研究发现,NLRP3 LPS诱导表达剂量和时间,但未能引起NLRP3表达在细胞TLR4的缺席12]。

H2年代被认为是有毒的很长一段时间,直到内生H2年代被发现在老鼠大脑13]。H2由两个pyridoxal-5年代主要是提取l -半胱氨酸的合成 磷酸- (PLP)依赖酶,即胱硫醚β合酶(CBS)和胱硫醚γ裂合酶(CSE),和一个phosphate-independent酶,3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (3-MST) [14]。最近,一个新的H2S-synthesis通路从D-cysteine 3-MST随着分子酸氧化酶(DAO)被发现;此外,D-cysteine表现明显优于半胱氨酸,尤其是肾脏和小脑(15]。众多研究表明,H2年代可能有一个潜在的治疗效果在缺血/再灌注损伤(IRI)在多个器官和代谢疾病通过抑制炎症和氧化应激(16- - - - - -21]。黄等。16)表明,H2年代可以防止高glucose-induced炎症和细胞凋亡抑制TLR4 / NF -κB通路和NLRP3 H9c2心肌细胞的激活。Zhang et al。19建议治疗H2年代可以减弱endotoxin-induced肺部炎症通过抑制一氧化氮合酶(间接宾语)诱导表达和一氧化氮(NO)的生产。涩谷等。15D-cysteine)报道称,政府可能增加H2年代水平从IRI肾组织和保护肾功能。Ahmad et al。20.和汉族等。21)也表明,外生H2年代加速肾脏修复后IRI通过抑制氧化应激和炎症。尽管各种效果的H2年代的疾病被发现,H的角色2在脓毒症的炎症过程一直是一个有争议的问题很长时间了。是否H2年代保护肾脏功能通过调节炎症和氧化应激在SA-AKI仍不清楚。

该试验的目的是检查H的效果2在肾功能在脓毒症和H的潜在机制2在SA-AKI年代。

2。材料和方法

2.1。患者和血液样本集合

十安琪(阿基组)患者招募从河北医科大学第四医院ICU在中国从2016年6月到2016年11月,和十个健康的捐助者(对照组)是从年龄人口选出来的。阿基的定义是一个突然的肾功能下降(在48 h)的定义和诊断急性透析质量倡议组织(22]。所有AKI患者感染革兰氏阴性细菌(包括2例鲍曼不动杆菌2例,铜绿假单胞菌2例,克雷伯氏菌,3例大肠杆菌,1例艰难梭状芽胞杆菌),肾损伤引起的肾和postrenal因素被排除在外。没有一个病人用药物治疗引起肾脏损害。18岁以下的患者,怀孕,或慢性肾功能障碍被排除在外的历史。所有参与者的一般条件和病史记录。血液样本前瞻性从每个参与者获得录取;在4000转离心10分钟后,上层清液被冻结在−80°C。每个病人提供书面知情同意前研究。伦理委员会批准的协议是河北医科大学第四医院(石家庄,中国)和执行符合所有适用的法律、法规、和指导方针在中国(包括良好的临床实践指南),这是有关保护人类受试者的志愿者。这项研究符合赫尔辛基宣言的发表的规定。

2.2。药物和化学物质

有限合伙人和硫氢化钠从σ(美国Sigma-Aldrich)。硫氢化钠使用前准备30分钟。肿瘤坏死因子-检测试剂盒α和il - 1β水平从Xinbosheng购买生物工程(中国深圳)。检测为MDA工具包,H2O2和MPO活动得到从建成生物工程(中国南京)。Dihydroethidium(她)获得Beyotime生物技术(上海,中国),在使用之前,溶解在二甲亚砜(DMSO)所需的浓度。Bicinchoninic酸(BCA)试剂购自Generay生物技术(上海,中国)。

2.3。动物和治疗

雄性野生型C57BL / 6 J小鼠(8 - 10周)从至关重要的购买河实验室(中国,北京),随后安置和培育标准条件(12 h光/暗周期)在恒定的温度下(22°C±2°C)和湿度(60%),并给予免费的食物和水。

两周后,24小鼠随机分为3组( ):控制、有限合伙人和有限合伙人+硫氢化钠(50μmol / L)组。有限合伙人和有限合伙人+硫氢化钠组腹腔注射LPS(5毫克/公斤);在对照组,老鼠收到同等体积的生理盐水(i.p)。有限合伙人治疗后三个小时,有限合伙人+硫氢化钠组硫氢化钠(50μ摩尔/公斤,i.p。);LPS组注射同等体积的生理盐水(i.p)。老鼠的血液和肾脏组织收集后6 h有限合伙人的待遇。血样立即旋转10分钟4000 rpm,冻结在−80°C。左肾组织与多聚甲醛固定(4%)和右肾组织冻结在−80°C。所有动物研究的指导下进行护理和使用实验动物(1985年NIH)伦理委员会审查后的河北医科大学实验动物保健和使用。

2.4。组织学分析

肾脏组织与多聚甲醛固定(4%),48小时后,石蜡包埋,分为4μ米厚,然后处理苏木精和伊红染色())和评估使用光学显微镜(奥林巴斯BX40、东京、日本)。肾组织学改变得分与前面描述的研究[23双盲的方式和评估。肾脏损害约为5外髓质中的随机选择字段,和管状损伤被定义为细胞变性和液泡化,减少刷状缘上皮、管阻塞,形成。根据以下标准:0 =正常;1 =伤害不到25%的管状区域;2 =损失25%到50%的管状区域;3 =损失50%到75%的管状区域;和4 =损失75%到100%的管状区域。

2.5。测量等离子体的Cre和包子水平

等离子Cre和病人和老鼠的发髻水平测量使用一个自动生化分析仪(Cobas 6000、罗氏、瑞士)。

2.6。血浆中炎性细胞因子的测量

酶联免疫吸附试验(ELISA)包被用来确定血浆TNF -α和il - 1β水平的病人和老鼠。

2.7。测量的MPO活性和MDA和H2O2浓度

病人的血浆和肾组织收集的老鼠如上所述。MPO活性和MDA和H2O2浓度与比色检测试剂盒测定。

2.8。测量活性氧(ROS)水平

肾组织ROS水平是衡量染色与她的新鲜冷冻的部分。安装使用新鲜的肾组织Tissue-Tek O.C.T.块分为5μ米厚片,洗两次准备PBS,孵化与她30分钟(10μmol / L)。由此产生的颜色反应是立即测量荧光显微镜(德国徕卡)。

2.9。CSE测量和CBS和3-MST活动

CSE和CBS和3-MST活动在肾组织测量根据前面的研究描述(24]。从冰冷的PBS也准备了肾组织匀浆;在4°C的12000 rpm离心后20分钟,浮在表面的测量和分离蛋白质浓度由BCA量化分析。代数余子式的pyridoxal-5 磷酸(2更易/ L)和酶底物L -(10更易/ L)被合并到上层清液;孵化后30分钟,混合物被用来检测CSE和哥伦比亚广播公司的活动。的α酮戊二酸(2更易/ L)和半胱氨酸(10更易/ L)将上层清液;孵化后30分钟,混合物被用来检测3-MST活动。这些活动的H2通过测量H S-generating酶进行了计算2浓度在反应体系和H2每个蛋白质微克每小时产生的年代。

2.10。测量H2年代的水平

H2发现了年代水平在血浆和肾组织根据先前描述的方法(25]。从肾组织匀浆准备使用冷Tris-HCl(100更易/ L, pH值8.5);在4°C的12000 rpm离心后20分钟,浮在表面的测量和分离蛋白质浓度由BCA量化分析。30μL上层清液或等离子体,80年μL monobromobimane(黑带大师,Sigma-Aldrich)和10μL氨(0.1%)混合,在室温下颤抖的1 h, 10μL甲酸(20%)被添加到停止反应。10分钟后离心(15000 rpm, 4°C),清晰的浮层被冻结在−80°C的检测。H2年代水平测定使用曲线与硫化钠(0-40形成的μmol / L)标准。等离子体H2被表示为年代水平μmol / L、H2在肾组织的表达为年代水平μ摩尔/ g蛋白质。

2.11。免疫印迹分析

右肾冷冻标本分散机械在寒冷里帕缓冲区。蛋白质由BCA上层清液中提取并量化分析。10% sds - page凝胶电泳后,被玷污的蛋白质聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore-Upstate)。在脱脂牛奶(5%)阻塞后40分钟在室温下,细胞膜在4°C 12 - 18小时孵化与抗体CSE, CBS, 3-MST, TLR4 NLRP3 caspase-1,β肌动蛋白(CSE从Proteintech和哥伦比亚广播公司,美国;美国3-MST和TLR4从Abcam获得;从Abnova NLRP3得到,中国;和β肌动蛋白是来自欧文,美国)。与TBST洗涤三次后,细胞膜与二次孵化抗体(美国Proteintech)在室温下2 h。屁股被发现有增强化学发光检测系统(圣人创造,北京)。带强度量化使用ImageJ软件。

2.12。统计分析

所有数据分析使用SPSS软件版本21.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。结果表示为均值±S.E.M.比较两组以上的,单向方差分析(方差分析),其次是Student-Newman-Keuls测试多重比较,应用。比较两组进行评估t以及。统计学意义是定义为一个 值< 0.05。

3所示。结果

3.1。H2年代的水平与Cre和包子水平SA-AKI患者

10健康的捐赠者和10阿基的特点,患者如表所示1。两组之间没有统计学意义差异比较通用的特性。与控制相比,等离子Cre(图1(一))和包(图1 (b))水平明显高于SA-AKI患者,而H2年代水平降低(图1 (c))。此外,有显著负相关关系的水平2年代和Cre(图1 (d))或包(图1 (e))。这表明,H2年代水平下降在SA-AKI的病理变化。

表1
控制和SA-AKI患者的特征。
(一)
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(d)
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(e)
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(j)
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图1
H2的S含量降低了SA-AKI患者。等离子体(a) Cre水平的控制和SA-AKI病人。(b)包级别的等离子体控制和SA-AKI患者。(c) H2年代水平控制的等离子体和SA-AKI病人。(d)之间的相关性2年代和Cre。(e)之间的相关性2年代和面包。(f) TNF -α患者的血浆水平。(g) il - 1β患者的血浆水平。(h)病人血浆中MPO的活动。(我)的浓度2O2等离子体的病人。(j)病人血浆MDA的含量。结果意味着±SEM。
3.2。炎性细胞因子,氧化应激增加SA-AKI患者

血浆肿瘤坏死因子-α和il - 1β阿基组水平增加而与控件(数字1 (f)和1 (g))。此外,MPO活性和血浆H2O2病人和MDA浓度测定。结果如图1 (h)- - - - - -1 (j)。MPO活性和H2O2和MDA浓度增加SA-AKI组与对照组相比。

3.3。H2在LPS-Induced AKI年代发挥了作用

在LPS-induced阿基老鼠,H2年代在血浆和肾组织水平明显低于对照组(数字2(一个)和2 (b))。H2CBS所产生的年代,CSE 3-MST酶;因此,这三种酶的活性和表达是肾脏测量样本。3-MST活动明显减少肾组织的LPS-induced阿基老鼠相比,在控制,但是没有CBS和CSE活动(数据的差异2 (c)和2 (d))。3-MST的表达显著减少LPS-induced阿基老鼠相比,在控制,而没有CBS和CSE表达式(数据的差异2 (e)- - - - - -2 (h))。然而,用硫氢化钠治疗(50μ摩尔/公斤)显著增加LPS-induced减少H2血浆和肾组织(年代水平数据2(一个)和2 (b)),它是伴随着等离子Cre和包子水平下降(数字2(我)和2 (g))。另外,硫氢化钠治疗显著改善肾病理变化引起的有限合伙人。(数据2 (k)和2(左))。

(一)
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(左)
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图2
H2的S含量降低了小鼠LPS-induced阿基,外生H2年代可以减弱肾脏功能障碍。H (a)2年代在等离子体水平。(b) H2年代在肾组织的水平。(c) 3-MST肾组织的活动。(d) CBS&CSE肾组织的活动。(e)代表西方的屁股3-MST, CBS, CSE表达在肾组织。β肌动蛋白是用作内部控制。(f−h)的定量分析3-MST, CBS, CSE表达在肾组织。(我)Cre在等离子体水平。(g)包在等离子体水平。(k)代表HE-stained右肾部分(比例尺= 250μ米)。(l)肾小管损伤分三组。
3.4。外生H2年代的炎性细胞因子,氧化应激小鼠LPS-Induced阿基

符合性能SA-AKI病人,血浆TNF -α和il - 1β水平,MPO活性,ROS水平,和H2O2和肾组织MDA浓度显著增加小鼠LPS-induced AKI。然而,外生H2这些变化可能大大减弱(数据3(一个)- - - - - -3 (f))。

(一)
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图3
外生H2年代的炎性细胞因子,氧化应激小鼠LPS-induced阿基。(一)TNF -α在小鼠的血浆水平。(b) il - 1β在小鼠的血浆水平。(c)在小鼠的肾脏组织MPO的活性。(d)的小鼠的肾脏组织中ROS水平。(e)荧光在小鼠的肾脏组织。(f)的浓度2O2在小鼠的肾脏组织。(g)在小鼠的肾组织MDA的含量。结果意味着±SEM。
3.5。外生H2年代减毒的形成NLRP3 LPS-Induced AKI小鼠的肾组织中

的外生影响H2年代TLR4、NLRP3 caspase-1表达式与免疫印迹检测分析。TLR4的表达,NLRP3 caspase-1 LPS组相比明显增加控制。然而,外生H2年代显著减少蛋白质TLR4的表达,NLRP3, caspase-1(图4)。

(一)
(一)
(b)
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(c)
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图4
外生H2年代减毒的形成在老鼠inflammasome LPS-induced阿基。(a)代表西方的屁股TLR4 NLRP3, caspase-1表达在肾组织。β肌动蛋白是用作内部控制。(b−d) TLR4的定量分析,NLRP3, caspase-1肾组织蛋白表达。

4所示。讨论

许多研究表明,H的保护作用2年代不同的病理过程中(16- - - - - -21]。我们的研究探讨肾脏功能障碍是否在脓毒症与降低H2年代的水平和其他可能的机制。后评估这项研究的结果,我们发现(1)有限合伙人内生H水平下降2年代和减少3-MST活动和表达在肾脏和(2)外源性补充硫氢化钠改善肾脏功能障碍的通过抑制炎症反应和氧化应激通过TLR4 / NLRP3信号通路。这些发现表明内生H2年代有助于SA-AKI的发病机制,而外生H2年代起着保护作用。

脓毒症是感染导致的全身炎症反应综合征,常常发生在重症监护病房。相关的多个器官功能障碍是危重患者死亡的主要原因。肾脏是最脆弱的器官在脓毒症,和死亡率SA-AKI可能达到70%2]。SA-AKI的发病机制尚不完全清楚。三大变化,已经承认在这种疾病过程中炎症,microcirculatory功能障碍,和细胞代谢反应脓毒症(26]。LPS诱导炎性细胞因子的释放(特别是TNF -α和il - 1β)通过TLR4信号通路和导致氧化应激,从而激活肾小管上皮细胞,导致这些细胞功能损伤,随后主要从事微循环障碍引起肾灌注不足,最终导致SA-AKI [26- - - - - -28]。AKI的诊断主要依靠临床表现、尿液体积,和血液生化指标。Cre包子是传统和肾功能的重要指标。MPO中性粒细胞活性的一个标志,而H2O2和MDA是常见的氧化应激的标记。在这项研究中,我们发现Cre和包子水平,TNF -α和il - 1β水平、MPO活性和H2O2的等离子体和MDA浓度显著增加SA-AKI患者。LPS-induced AKI的小鼠模型是用来模拟致病的阿基的过程,和类似的观察上述指标的变化。这些数据与先前的研究结果一致(6,7,10]。

在各种研究表明,H2肾系统扮演了一个至关重要的角色,在生理和病理状态,和H2年代水平下降在各种肾脏疾病(15,20.,21]。到目前为止,三个酶和四个途径参与生产的H2已报告。木村的团队(14,29日]表明H的形成2从l - S CBS, CSE 3-MST加上半胱氨酸转氨酶(猫);此外,3-MST连同DAO可以产生H2从D-cysteine年代。此外,他们发现这三个酶是丰富的肾脏,但CBS和CSE本地化在细胞质中,而3-MST主要在线粒体和H的途径2年代生产从D-cysteine 3-MST /刀只存在于肾脏和大脑。解释的影响内源性H2SA-AKI过程中,我们测量了水平的H2年代的病人和老鼠SA-AKI;类似于证明之前(15,20.),H2年代水位显著下降,肾功能呈负相关。探索H下降的原因2年代的水平,我们测量三种酶的活性及其表达小鼠的肾组织中,发现的活动和表现CBS和CSE LPS刺激后的肾脏没有明显改变,但3-MST活动明显减少;此外,3-MST表达下调,这可能导致的减少H2美国虽然实验研究[20.,21]表明,蛋白质的表达CBS和CSE减少肾脏功能障碍引起的IRI模型,SA-AKI的发病机制并不完全缺血再灌注的一样。从木村的报告29日),我们也发现,肾脏D-cysteine能生产60倍的H2与半胱氨酸,D-cysteine更有效保护肾功能。因此,我们推断,有限合伙人可能会影响H2年代生产主要通过D-cysteine /刀/ 3-MST途径,虽然的机制仍不清楚,需要进一步的研究。

上述研究结果的基础上,我们评估的潜在的治疗效用外生H2SA-AKI年代。硫氢化钠,H2捐赠,广泛应用在各种动物模型的肾IRI和证明改善肾脏损害(21,30.]。基于先前的研究和preexperimental结果,我们管理的硫氢化钠(50μ摩尔/公斤)有限合伙人注射后3小时以内。硫氢化钠已经证明,增加了H2年代水平在血浆和肾组织LPS-induced AKI的老鼠和H2年代水平接近正常范围。硫氢化钠后肾脏功能和组织学的变化也有所改善管理,减少所示Cre和等离子体包水平以及肾损伤分数。这些结果类似于陈et al。31日),发现等离子体H2年代水平较低与SA-AKI来源于兔尿道,硫氢化钠和治疗可能改善H2年代水平,肾脏功能和病理变化。

炎症反应是一个SA-AKI发病机制的基石。作为一个最重要的模式识别蛋白,TLR4作为有限合伙人的主要受体。坎宁安et al。8)发现,LPS结合TLR4在肾脏和诱导促炎细胞因子的释放,尤其是TNF -α和il - 1β在阿基,它起着关键作用。傅et al。32)表明,抑制TLR4可能缓解LPS-induced肾损伤。与此同时,罗et al。33)表明,NLRP3是另一个重要的炎症调节器sepsis-induced器官损伤。NLRP3可以激活caspase-1,随后,乳沟和促炎细胞因子(il - 1的分泌β和地震)晋升。Alfonso-Loeches et al。34]表明TLR4之间的串扰和NLRP3发现激活NLRP3和炎性细胞因子的分泌主要消失在慢性alcohol-fed TLR4基因敲除小鼠,这表明NLRP3激活取决于TLR4的功能。多年来,各种研究表明H的关键作用2年代作为调停者各种炎症的临床设置。涩谷等。15)表明,H2年代抑制高glucose-induced心肌细胞TLR4通过抑制炎症/ NF -κB通路和NLRP3激活。此外,谭et al。35]还发现了内源性保护作用的H2在肾IRI通过抑制炎症反应的抑制TLR途径。Zhang et al。19)表明,H2年代可以减弱LPS-induced急性肺损伤通过减少氧化应激和抑制炎症。相似的结果也出现在李et al。36),测试的作用2在小鼠急性肺损伤,发现外生H2年代减少肺渗透通过抑制氧化应激和炎症。陈等人。31日)透露,通过抑制NF -κB、H2年代能降低血浆TNF水平α并增加il - 10水平。调查H的抗炎机制2年代,我们观察到的影响H2年代TLR4 / NLRP3信号通路和发现,有限合伙人可以增加TLR4 NLRP3,和caspase-1表达在肾组织中,伴随着等离子海拔下游炎症因子(TNF -α和il - 1β)和氧化应激的标记(MPO、H2O2和MDA)。此外,我们的结果表明,硫氢化钠治疗50μ摩尔/公斤可以保护肾脏功能通过抑制炎性细胞因子的释放和氧化应激,以及TLR4 NLRP3, caspase-1表达式。

5。结论

总之,我们的研究表明,内生H2年代参与SA-AKI的发病机制和外生H2年代发挥保护作用通过抑制炎症和氧化应激通过TLR4 / NLRP3信号通路。这些研究结果将揭示H的角色2作为肾疾病的治疗剂。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

宇鸿盛陈和金的贡献同样这项工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(批准号。31171098,31171098,31671185),中国河北省自然科学基金(H2017206269),专业研究基金会对中国高等教育的博士项目(没有。20121323110008),河北省创新人才支持计划(格兰特LJRC017),和办公室的中国河北省教育基金会(QN2016144)。