文摘

的作用和确切机制TLR4在mitochondria-related氧化损伤和糖尿病肾病的肾小管细胞凋亡(DKD)尚不清楚。我们检查在肾活检组织TLR4的表达。糖尿病小鼠和Db / Db HK-2细胞培养在高葡萄糖(HG)作为体内和体外模型。进行了实时rt - pcr、免疫印迹和免疫组织化学检查TLR4的信使rna和蛋白质水平,NF -κΒ,PGC-1α、细胞色素C和caspase-3分开。ATP水平、活动的电子传递链复杂三世和抗氧化酶追究线粒体功能。电子显微镜(EM)和MitoTracker红CMXRos用于线粒体形态改变。她和TUNEL染色检测活性氧积累和细胞凋亡的检测。PGC-1α质粒被用于PGC-1的过度α在HK-2。TAK242和parthenolide用作TLR4和NF -κB受体阻滞剂,分别。结果表明TLR4是广泛表达在DKD患者的肾小管和db / db糖尿病老鼠,这是积极与肾小管间质损害得分和尿β唠叨的水平。在糖尿病小鼠,抑制TLR4可能扭转PGC-1的表达下降α,增加表达的细胞色素C和裂解caspase-3,线粒体功能障碍和变形,增加活性氧的积累,和激活的管状细胞凋亡。体外抑制TLR4或NF -κB显示一致的结果。PGC-1α超表达可以扭转线粒体功能障碍,增加caspase-3裂解,和细胞凋亡与HG HK-2细胞治疗。数据表明TLR4 / NF -κB信号通路可能是上游PGC-1的途径α的管状损害,促进DKD通过调制mitochondria-related氧化损伤和细胞凋亡。

1。介绍

toll样受体(通常)是模式识别受体,发挥着基础性的作用在先天和适应性免疫反应的激活1,2]。11中人类通常,TLR4与急性和慢性肾脏疾病的发病机制,如急性肾损伤(AKI),肾纤维化,DKD [3,4]。进一步研究报道,TLR4基因敲除小鼠糖尿病的表达减少MyD88 TRIF和NF -下降κB活动和炎性细胞因子的释放和肾纤维化5,6]。此外,汞被证明诱导的超表达TLR4通过NF -κB-dependent信号,导致足细胞活性氧的积累7),表明TLR4 NF -的重要作用κB信号DKD进展的机制。根据我们先前的研究中,肾小管氧化应激损伤和细胞凋亡发挥关键作用的进展DKD高葡萄糖(HG)条件8]。这些让我们推测的激活TLR4-NF -κB信号通路可能参与线粒体功能障碍和mitochondria-related氧化损伤的肾小管上皮细胞(RTEC)高血糖,逐渐产生极其重要的影响在DKD的进展。

的过氧物酶体proliferator-activated受体γ包括PGC-1 coactivator-1 (PGC-1)α,PGC-1β,中华人民共和国是归因于核转录激活因子和与物质代谢[亲密关系9]。PGC-1α证明刺激线粒体生物起源和呼吸通过感应解偶联蛋白2 (UCP-2)和核呼吸因子的调节(nrf) [10]。另外,我们之前的研究也证实,通过调节转录因子如nrf PGC-1α可以保护线粒体呼吸链的功能和抗氧化酶,以便维持线粒体结构和功能的稳定性(8]。此外,在心肌细胞,研究人员发现,NF -κB p65压制PGC-1α活动导致代谢失调是心脏功能障碍和衰竭(11]。然而,PGC-1的保护作用α在线粒体与TLR4 / NF -和它的关系κB信号路径在DKD并不完全清楚,需要进一步调查。

我们这项研究的目的是探讨TLR4的功能/ NF -κB通路mitochondria-related氧化损伤和细胞凋亡RTEC高血糖和调查PGC-1的角色αTLR4 / NF -κ在DKD B通路。

2。结果

2.1。TLR4表达调节DKD患者肾活检标本

DKD患者的临床特点和N-DKD控制在本研究如表所示1。PASM和PAS染色显示形态变化阻力指标方面,也许可以在肾小球和包括系膜区扩张(图1(一),B,箭头),焦肾小管萎缩、间质纤维化(图1(一)D DKD患者的箭头),相比之下,那些在non-DKD病人。N-DKD组明显,线粒体与组织一个细长的圆柱形状嵴被电子显微镜(图所示1(一)G)。然而,扩散线粒体碎片在DKD观察病人(图1(一)在EM H),线粒体变化量化(图1 (c)):在管状细胞中线粒体长度测量来确定细胞的百分比显示丝状线粒体不到长(> 2 1%μ米)。 相比之下,N-DKD组。一个显著地增强TLR4表达了包含IHC染色DKD患者的肾小管(数字1(一)、F和1 (b))。相关分析表明TLR4表达呈正相关,间质纤维化和肾小管萎缩(IFTA)分数和尿β唠叨水平管损伤标记(数字1 (d)和1 (e))。

2.2。抑制TLR4保护肾小管细胞通过调节Mitochondria-Related蛋白在糖尿病dbdb老鼠

的水平血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cr),尿蛋白(Upro)和尿白蛋白肌酐比值(ACR)在db / db组显著增加; 相比之下,db / m组。然而,面包、Cr和Upro TAK242治疗(表后明显减弱2), 相比之下,db / db小鼠组。这些结果表明,TAK242政府可以保护肾功能的db / db老鼠在某种程度上。

刷状缘和早期肾小管萎缩的损失被他发现与对照组相比,染色(图2(一),a - c)被注入TLR4抑制剂TAK242改善。的尿排泄β管损伤的唠叨,这是一个标志,反映了糖尿病dbdb显著增加小鼠,虽然大大降低了intrarenal注入TAK242(图2(b), B2)。

TLR4在dbdb增加小鼠免疫印迹(图2(c))。免疫组织化学和免疫印迹显示细胞色素C蛋白表达显著增加(数据2(一),A1、A3, G和H2(d)、D1, D4)和裂解caspase-3(数字2D-F (a), A1, A2,和2 (d), D1, D3)和PGC-1下降α(图2(d), D1, D2)。他们的变化明显逆转TAK242注射后。

2.3。抑制TLR4从Mitochondrial-Dependent保护肾小管细胞凋亡的调节线粒体结构和功能在糖尿病dbdb老鼠

ROS生产沾染了红色荧光ROS-sensitive至关重要的染料和增加尤其是在糖尿病dbdb老鼠的小管。在抑制TLR4的表达,ROS生成明显减少(图3(一个)a - c A1, A2)。此外,抑制TLR4表达显著减少细胞凋亡的程度糖尿病dbdb老鼠的管状细胞TUNEL分析(图3(一个)、A1、D-F A3)。管状细胞显示细长的线粒体有组织的嵴dbm老鼠(图3(一个),A1, G)(由星号标记);然而,dbdb组,多数线粒体表现出球面形状和cristolysis(图3(一个)A1, H),这在一定程度上减毒与TAK242治疗后(图3(一个)A1,我,A4)。

ATP生产(图的水平3 (b)),活动的电子传递链复杂III(图3 (c)),抗氧化酶的活性,过氧化氢酶(CAT)和锰超氧化物歧化酶(MnSOD)(数据3 (d)和3 (e)显著降低dbdb鼠标集团注入TAK242后可逆转。这些表明,抑制TLR4可能减弱糖尿病大鼠线粒体功能的抑郁。

2.4。NF - HG增加TLR4表达和激活κHG氛围下B p65 HK-2细胞磷酸化

如图4TLR4的蛋白质含量增加HK-2细胞浓度和时间的方式,和beta-actin作为加载控制(数字4(一)和4 (b))。此外,phospho-NF——的表达κB在HK-2 p65显著增加细胞治疗30毫米汞柱比控制(图2 h4 (c)),而TLR4抑制剂(TAK242 5μ米)(12)逆转HG-induced NF -κB p65磷酸化(图4 (e))为2 h和24 h(图4 (f)),这表明NF -κB是TLR4的下游信号分子。与蛋白质表达一致,NF -的mRNA水平κB p65增加HK-2细胞治疗30毫米汞柱2 h控制相比,虽然TAK242逆转HG-induced激活NF -κB p65磷酸化(图4 (d)),这表明TLR4 / NF - HG激活κB信号通路。

2.5。抑制TLR4 / NF -κB信号逆转PGC-1的表达α和Caspase-3 HG氛围下HK-2细胞中活性氧的生产

rt - pcr(图5(一个),A1, A2)和免疫印迹(图5 (b)b1b3)结果表明,信使rna和蛋白质水平的apoptosis-related蛋白质裂解caspase-3 HG集团(数字增加5(一个)A2和5 (b), B3),信使rna和蛋白质的表达PGC-1 mitochondria-related蛋白质α减少汞组(数字5(一个)、A1和5 (b), B2)。这一趋势被TAK242和NF -推翻κB -受体阻滞药(parthenolide 10μ米)。

测量的ROS, MitoSOX红试剂(红色)。细胞很低MitoSOX荧光细胞的细胞质(图5.5 Glu组5 (c),C1)。HG明显诱因增加线粒体超氧化物的形成(图5 (c)B, C1, C2)。TLR4和NF -κB拦截器可以防止HG-induced ROS生产( )。

这些数据表明TLR4 / NF -κB途径可能参与HG-induced mitochondria-related活性氧积累和细胞凋亡。此外,PGC-1的表达α在TLR4 / NF -增加κ这表明PGC-1 B阻塞组α可能是/ NF-KB TLR4信号通路的下游蛋白质HG-induced HK-2细胞的变化。

2.6。抑制TLR4 / NF -κB信号逆转线粒体细胞色素C的释放,线粒体形态、功能和HG氛围下HK-2早期凋亡细胞

30毫米葡萄糖的浓度,从线粒体释放细胞色素C细胞质在HK-2增加细胞免疫印迹(图6(一个)、a1a3),这表明一个了不起的HG-induced线粒体故障。干预的TLR4抑制剂(TAK242)和NF -κB -受体阻滞药(parthenolide),细胞色素C的易位是改善(图6(一)、a1a3)。ATP生产(图的水平6(b)),电子传递链活动的复杂的三世(图6(c)),猫和MnSOD(数据的活动6(d)和6(e)) HG组明显降低,这可能是逆转TAK242 + 30 Glu组和parthenolide + 30 Glu组。这些表明TLR4 / NF - HG激活κB信号影响线粒体功能。

如图6(f),线粒体被MitoTracker红色荧光染色,丝状的外观和线型是经常相互联系形成一个网络在对照组(图6F1 (f), f)。线粒体被分散成球体在HG治疗(图6(f), F1, B, G),而TAK242和parthenolide治疗逆转这一趋势(图6、F1、D、E、H、I, F2)。

此外,赫斯特33258染色显示,HG(30毫米)增加核破裂,这是一个提示早期细胞凋亡,而TAK242和parthenolide治疗逆转这一趋势(图6(g),箭头所示)。这些数据表明,HG诱导线粒体功能障碍和严重核分裂的早期凋亡细胞TLR4 / NF -通过激活κB信号通路。

2.7。过度的PGC-1α减少HG-Induced Caspase-3 HK-2细胞中表达的抑制下TLR4 / NF -κB信号通路

HK-2细胞被分成六组不同的治疗方法:(1)对照组与5.5毫米葡萄糖(Glu) 5.5,(2)高葡萄糖组30 mM葡萄糖(Glu) 30日,(3)PGC-1α质粒组与葡萄糖(PGC-1 30毫米α+ 30 Glu), (4) PGC-1α空质粒组30 mM葡萄糖(空向量+ 30 Glu), (5) PGC-1α质粒与葡萄糖和TAK242 (PGC-1 30毫米α+ TAK242 + 30 Glu)和(6)PGC-1α质粒与葡萄糖和parthenolide (PGC-1 30毫米α+ parthenolide + 30 Glu)。HG的表达增加caspase-3裂解,但PGC-1α超表达水平的降低裂解caspase-3 mRNA(图7(一)A2(图)和蛋白质水平7 (b)支持认为PGC-1 b1b3)α超表达参与HG-induced细胞凋亡。此外,结果还表明,phospho-NF -κB p65 HK-2细胞增加为2 h(图30毫米汞柱7 (c))和24小时(图7 (d)),而没有PGC-1下降α过表达细胞,进一步证明PGC-1α可能的下游蛋白质TLR4 / NF -κB信号通路HG-induced HK-2细胞的变化。

2.8。过度的PGC-1α恢复HG-Induced线粒体膜电位(△Ψ_米)改变和细胞凋亡在HK-2细胞的抑制TLR4 / NF -κB信号通路

通过流式细胞仪分析,线粒体的丧失检测到TMRM染色观察30毫米汞柱氛围下细胞发生凋亡早期,这是恢复到基线PGC-1的过度α(数据8(一个))。此外,凋亡率只有11.92%在5毫米葡萄糖HK-2细胞,但是达到68.1%的30 Glu集团(数字8 (b),B),同意文献报道,高葡萄糖导致细胞凋亡增加。然而,凋亡率分别52.27%”PGC-1α+ 30 Glu集团”,59.86%“PGC-1α+ TAK242 + 30 Glu集团”,47.12%“PGC-1α+ parthenolide + 30 Glu集团”,相比明显减少与30 Glu组。统计数据表明,PGC-1α超表达抑制HG-induced线粒体的损失在HK-2细胞和细胞凋亡。

3所示。讨论

最近,研究表明mitochondria-related氧化损伤和细胞凋亡中发挥关键作用的多因子的发病机理DKD患者(13,14]。此外,TLR4在高血糖诱导炎症状态前所述涉及肾tubulus体外和体内15,16),但它的作用在肾小管细胞氧化损伤和凋亡DKD仍不清楚。本研究描述了一个级联事件链接TLR4 / NF -κB激活mitochondria-related氧化损伤和细胞凋亡的PGC-1差别通过对这些α在肾小管细胞HG条件下。

越来越多的证据表明TLR4的意义发展的途径DKD [17]。然而,大多数人关注其阻力指标炎症反应(也许可以效应有关4,12]。在这项研究中,我们发现TLR4在管状细胞广泛表达患者的肾脏DKD兼顾支离破碎的线粒体。进一步分析发现TLR4表达与管状损伤之间的正相关关系。这些结果表明TLR4可能发挥重要作用在DKD mitochondria-related管状氧化损伤中,除了其炎症反应的激活效应。这个猜测是进一步确定糖尿病dbdb小鼠模型在我们的研究中。

许多研究报道TLR4激活NF -至关重要κB和后续生产的促炎细胞因子与疾病(18,19]。分子消声管状细胞TLR4的siRNA减毒HG-induced我κB / NF -κ激活,表明TLR4-NF -κB信号通路中起着重要的作用在糖尿病肾病20.,21]。在这项研究中,我们也证明了TLR4抑制剂能有效地减少phospho-NF——的表达κHG条件下B p65 HK-2细胞增加,表明NF -κB是在管状细胞TLR4的下游信号分子。

线粒体功能障碍已被证明是一个主要因素DKD[的发病机制22]。Mitochondria-related氧化损伤可能导致线粒体细胞色素c的释放和激活caspase-3,最终导致细胞凋亡(23]。为了探讨TLR4 / NF -的影响机制κB在高血糖mitochondria-related管状氧化损伤,抑制TLR4的表达或NF -κB体内和体外。我们观察到的部分救援HG-induced线粒体变形,抑制ATP生产、抑郁的线粒体呼吸和抗氧化酶的活性,并增加caspase-3细胞质和细胞色素c,这表明抑制TLR4 / NF -κB信号通路可以保护线粒体功能障碍在糖尿病大鼠的管状细胞和培养引起的管状细胞HG。这些有利影响对管状细胞逆转ROS生成和细胞凋亡和保护管状细胞氧化损伤HG体内和体外。

研究已经确定了线粒体碎片作为小说机制导致体内线粒体损伤和细胞凋亡在疾病的小鼠模型24]。在管状细胞中,线粒体的很大一部分线垂直于基底膜,做一个优秀的模型为研究线粒体碎片体内。小管的横截面通常显示10% - -20%纵向分段长线粒体,而出现短棒或球形片段在疾病病理细胞凋亡模型。线粒体碎片被发现re-fuse如果有害的压力是永久性损伤发生之前将引发细胞凋亡(25]。在这项研究中,我们观察到,大多数线粒体内受伤的小管中肾活检组织和糖尿病小鼠随机分散,有杂乱无章的细胞分布,这可能是通过抑制TLR4 / NF -逆转κB抑制剂,表明TLR4 / NF -κB信号通路诱导线粒体分裂,导致后续的管状细胞凋亡。

线粒体功能的主要监管机构,PGC-1α施加救助效果的物质代谢和氧化代谢调节线粒体生物起源和活性氧清除酶(26]。增加PGC-1α表达式可保护细胞免受氧化应激和氧化stress-mediated细胞凋亡(27,28]。在心脏细胞,先令等人表明TLR4的磷酸化和核易位激活可能导致NF -κB,引发心脏能量代谢重编程通过抑制基因编码PGC-1α的差别,TLR4废除LPS-induced缺席的情况下对这些PGC-1α,这表明PGC-1的抑制α被证明发生通过TLR4和NF -κB-dependent机制(29日]。在这项研究中,我们观察到PGC-1α降低糖尿病小鼠模型和抑制TLR4后被撤销在活的有机体内。在HK-2细胞,PGC-1超表达α抑制一系列HG-induced线粒体膜电位的差别,包括对这些变化,upregulation apoptosis-related蛋白裂解caspase-3,直接和细胞凋亡,验证PGC-1的防护功能α线粒体功能和细胞在HG生存条件。此外,PGC-1α超表达并没有减少HG-induced TLR4激活和NF -κB p65磷酸化,从而进一步确认PGC-1α是TLR4的下游蛋白质/ NF -κB,保护肾小管细胞HG-induced mitochondria-related氧化和细胞凋亡。

总之,TLR4在HG-induced线粒体功能障碍中起着重要作用,mitochondria-related氧化,细胞凋亡调节下游蛋白质PGC-1α在RTEC,希望能提供一个更好的理解和更有效的治疗方法DKD的预防和治疗。

4所示。材料和方法

4.1。主要试剂和材料

人类肾脏近端小管上皮细胞(HK-2)是一种细胞系购买来自美国文化(美国写明ATCC)集合。抗体来自以下方面:多克隆anti-TLR4从Abcam(美国)。单克隆anti-PGC-1α、单克隆anti-caspase-3和NF -κB p65来自细胞信号技术(美国波士顿)。多克隆phospho-NF -κB p65 (ser536)抗体来自Bioworld(美国),和多克隆anti-cytochrome C是从Proteintech(武汉,中国)。Beta-actin和所有二级抗体的免疫印迹和免疫荧光Proteintech(武汉,中国)。TAK242是从MedChem表达(美国),parthenolideσ(美国)。质粒含有pcDNA4 myc PGC-1α(pcDNA4 / PGC-1α)从Addgene购买(美国)。Lipofectamine 2000年MitoTracker红CMXRos MitoSOX,试剂盒购自英杰公司(美国)。PrimeScript™RT试剂盒gDNA橡皮擦和SYBR®预混料交货Taq™(核糖核酸酶H + Tli)从豆类(日本)。膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备是从Beyotime(上海,中国)。TMRM检测设备是从Genmed科学公司(美国)。其他试剂,包括DMEM / F12培养基,牛血清白蛋白的边后卫,和胰蛋白酶获得Gibco(美国)。

4.2。肾脏的形态分析

12 DKD患者和12 non-DKD控制(正常肾脏组织)参与了这个研究。人类从24例肾活检组织研究了PAS和PASM染色。一种半定量的评分系统阻力指标损伤指数,也许可以被用来评估和管状损害也得分(30.,31日]。所有程序都按照批准的指导方针。所有病人没有使用肾上腺皮质激素或免疫抑制。管理员的机构审查委员会和美国肾脏学第二湘雅医院批准了这项研究的协议。所有的参与者的知情同意了。

小鼠的肾脏组织定期处理,嵌入在石蜡,分段,2 - 3毫米厚度,deparaffinized,患者使用标准技术。老鼠的部分是沾hematoxylin-eosin染色(他)。

4.3。检查在肾组织和HK-2细胞线粒体碎片

线粒体的改变肾小管是由电子显微镜测量(EM)。线粒体有 和球形配置被确定为支离破碎。我们确定的百分比小于1%长丝状的细胞线粒体表明线粒体分裂的程度在病人和老鼠24]。

MitoTracker红色CMXRos用于评估在HK-2细胞线粒体形态。线粒体在细胞通常是丝状或分散。在混合线粒体形态的情况下,我们将细胞线粒体大多数(> 70%)的基础上,根据先前的研究。对于每一个样本,几个随机领域的细胞(≥100细胞/盘)进行评估32,33]。

4.4。动物实验设计

共有10个男性dbm老鼠和20只成年雄性小鼠dbdb 16周的年龄(体重32-40 g)被分成三组10动物。第一组是男性dbm老鼠,它作为控制。第二组dbdb小鼠仅接受腹腔内注射与车辆(dbdb组)。第三组包括dbdb老鼠收到腹腔内注射的TLR4抑制剂TAK242 7天(3毫克/公斤)。所有的动物被杀害在17周后管理。上述机构动物实验伦理委员会批准了动物实验协议。

4.5。细胞培养

人类肾脏近端小管上皮细胞(HK-2),一种永生化细胞系来自美国文化(美国写明ATCC)集合,被用于这项研究。HK-2细胞在DMEM / F12培养基培养补充10%的边后卫,青霉素1×10 5 U / L,链霉素100 mg / L。直到被播种在80 - 90%融合,细胞暴露于不同浓度的葡萄糖和TLR4 / NF -κB受体阻滞剂,具体的干预措施和分组如下:答:5.5毫米葡萄糖(Glu集团控制/ 5.5),B: 30毫米葡萄糖(Glu 30日集团),C: TLR4抑制剂(TAK242)和30 mM葡萄糖(TAK242 + 30 Glu集团)和D: NF -κB -受体阻滞药(parthenolide)和30 mM葡萄糖(parthenolide + 30 Glu集团)。

4.6。免疫组织化学(包含IHC)

从人类和小鼠肾组织切片免疫染色deparaffinized和水化。使用anti-TLR4抗体进行免疫组织化学(Abcam 1: 100年,美国),caspase-3(1: 100年,春秋国旅,波士顿,美国),和细胞色素c(1: 100年,春秋国旅,波士顿,美国)抗体作为主要抗体,后跟一个二级抗体。然后,幻灯片被使用可视化民建联检测设备根据制造商的指示,和组织标本被光学显微镜检查。

人类和小鼠组织部分,至少20个随机选择的字段的平均强度测量使用ImageJ软件(National Institutes of Health),马里兰州贝塞斯达)。

4.7。ATP测定

ATP水平测定细胞溶解产物从小鼠肾组织和HK-2细胞使用ATP测定工具包(Genmed、上海、中国)。分析运行根据制造商的指示。的值被表示为褶皱变化比控制。

4.8。第三呼吸链复杂活动

线粒体呼吸链复合物三世活动是通过使用分光光度计测量(Genmed、上海、中国)根据制造商的指示。的值被表示为褶皱变化相比,车辆控制。

4.9。线粒体酶活性

超氧化物歧化酶活性测定工具包(Alexis生化药剂)和过氧化氢酶活性比色/荧光测定试剂盒(BioVision Inc .)是用于检测Mn-SOD和过氧化氢酶活动,遵循制造商的指导方针。酶活性被显示为褶皱变化而控制。

4.10。测量过氧化物生成和细胞凋亡

她是用于检测体内线粒体超氧化物的生成。特定的线粒体超氧化物指标MitoSOX红(分子探针)是用于检测活性氧产量HK-2细胞体外。随机选择20场拍摄地点组织部分,和平均荧光强度计算通过使用NIH ImageJ软件和表示相对于控制(设置为1)。

TUNEL染色过程和赫斯特33258年被用来检测细胞凋亡后,制造商的指示。10个随机领域的细胞(大约100细胞/组织)的比例计算确定细胞发生细胞凋亡。

4.11。PGC-1α超表达

执行PGC-1α在HK-2细胞中表达,pcDNA4 myc PGC-1α从收购Addgene(美国)。然后,pcDNA4 myc PGC-1α利用质粒纯化工具包(美国试剂盒)。融合HK-2细胞被播种70%,收于2.5点μ克pcDNA4 myc PGC-1α引入或pcDNA4 myc HK-2细胞使用Lipofectamine 2000(美国表达载体)6-well文化菜根据制造商的指示。24小时培养后,细胞暴露于不同浓度的葡萄糖和TLR4 / NF -κB受体阻滞剂,具体的干预措施和分组如下:答:5.5毫米葡萄糖(Glu集团控制/ 5.5);b: 30毫米葡萄糖(Glu 30日集团);c: pcDNA4 myc PGC-1α葡萄糖和30毫米(PGC-1α+ 30 Glu集团);d: pcDNA4 myc和30毫米葡萄糖(空向量+ 30 Glu集团);艾凡:pcDNA4 myc PGC-1α30毫米,TAK242和葡萄糖(PGC-1α+ TAK242 + 30 Glu集团);和f: pcDNA4 myc PGC-1α30毫米,parthenolide和葡萄糖(PGC-1α+ parthenolide + 30 Glu组)。

4.12。实时逆转录聚合酶链反应(实时rt - pcr)

总RNA分离与试剂盒(英杰公司、美国),和1μg RNA用于逆转录生成模板的互补。相对mRNA水平决定通过fluorogenic定量PCR和β肌动蛋白基因作为一个内部参考。特定的引物的使用SYBR绿色如下:TLR4: 5-ACCTGTCCCTGAACCCTATG-3(向前)和5-TCTAAACCAGCCAGACCTTGA-3(反向);NF -κB: 5-AGCACAGATACCACCAAGACC-3(向前)和5-CGGCAGTCCTTTCCTACAAG-3(反向);PGC-1α:5-TGAGTCTGTATGGAGTGACATCG-3(向前)和5-ACTTGAGTCCACCCAGAAAGC-3(反向);和caspase-3: 5-TGCATACTCCACAGCACCTG-3(向前)和5-TTCTGTTGCCACCTTTCGGT-3(反向)。使用的引物序列设计引物5.0,寻找特异性。实时定量应用生物系统公司7300®系统上执行(美国ABI 7300)。PCR参数如下:95°C 30年代紧随其后40周期在95°C的变性5 s和退火60°C为31。定量PCR结果计算使用2^−ΔΔCt方法。

4.13。西方墨点法(WB)

里帕的冰冻的小鼠肾组织细胞裂解缓冲(Beyotime、上海、中国)随后在12000转离心4°C获得上层清液中细胞蛋白质。细胞溶解产物HK-2获得使用里帕缓冲(Beyotime、上海、中国)和鸡尾酒(罗氏诊断,曼海姆,德国)。细胞细胞质和线粒体的提取获得的分数是线粒体/胞质分离设备(美国Abcam)根据制造商的协议。蛋白质含量是量化采用BCA法(Beyotime、上海、中国)。然后,10%的样本分离SDS-polyacrylamide凝胶,转移到聚乙二烯二氟化物膜(微孔、马、美国),和孵化一夜之间在4°C主要抗体。隔夜孵化后,膜被洗了3次之后,他们孵化与二次抗体(anti-mouse免疫球蛋白,Proteintech,武汉,中国;Proteintech anti-rabbit免疫球蛋白,武汉,中国)1 h在室温和洗3次。这些墨迹被发现使用ECL(微孔、马、美国)。主要抗体用于这个实验是anti-TLR4抗体(Abcam 1: 1000年,美国),NF -κ中科B p65抗体(1:1000年,波士顿,美国),phospho-NF -κB p65 (ser536)抗体(Bioworld 1: 1000年,美国),细胞色素C(1: 1000年,春秋国旅,波士顿,美国),单克隆anti-PGC-1α(1:1000年,春秋国旅,波士顿,美国),和anti-caspase-3(1: 1000年,春秋国旅,波士顿,美国)。每个乐队的强度估计用NIH图像软件和规范化β肌动蛋白。

4.14。线粒体膜电位评估()

线粒体细胞被TMRM评估检测设备(Genmed科学Inc .)、美国)。镀HK-2细胞24-well文化菜胰蛋白酶化当他们被播种后收获70%融合,然后用TMRM细胞被染色的染色液体根据制造商的指示。20分钟在黑暗中潜伏在37°C,线粒体细胞是由一个FACSCalibur检查流式细胞分析仪(美国圣何塞BD生物科学)。TMRM荧光强度的监测在575海里。

4.15。流式细胞术分析细胞凋亡

细胞凋亡与膜联蛋白测定V-FITC凋亡检测装备(Beyotime、上海、中国)。根据制造商的指示,与195年细胞被孵化μ包含5 L绑定缓冲μL膜联蛋白V-FITC和10μL propidium碘在黑暗中在室温下为20分钟。分析了细胞凋亡在FACSCalibur流式细胞分析仪(美国圣何塞BD生物科学)。

4.16。数据分析

20使用SPSS软件进行统计分析。结果表示为的意思 平均误差(SEM)。统计组间差异分析单向方差分析,和双尾值报告。值小于0.05被认为是具有统计学意义。

信息披露

作者独自负责的内容和写这篇文章。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81300600,81300600,81300600,81470960,81770714),湖南省自然科学基金(2018 jj3728),自由探索的计划(2012 qnzt146),中南大学和湖南ZuoLi杯精英项目(0442016001)。