文摘
目标。异丙酚是一种流行的麻醉神经保护药物。然而,异丙酚对海马神经保护机制仍然是难以捉摸的。本研究旨在调查异丙酚在海马神经元的神经保护作用和机制暴露在缺血再灌注(I / R)损伤。方法。Hypoxia-reoxygenated (H / R) HT-22细胞被用来模拟I / R损伤海马体外。MTT分析是用来确定细胞的可行性。细胞凋亡通过TUNEL分析,流式细胞术检测细胞凋亡测定。表达水平的蛋白质被西方墨点法测量。细胞内钙被Fura-2 / AM染色评估。流式细胞仪是用于确定线粒体膜电位(MMP)。Coimmunoprecipitation被用来评估的稳定性FKBP-RyR复杂。钙调磷酸酶酶活性测定比色法。YAP核易位被免疫荧光染色检测。结果。H / R诱导HT-22细胞可行性抑郁,和细胞凋亡被异丙酚治疗逆转。异丙酚可以缓解H / R-induced胞内钙积累和MMP的损失通过抑制钙调磷酸酶活性和FKBP12.6-RyR离解作用浓度的方式。此外,YAP表达异丙酚的关键保护HT-22从H / R损伤细胞凋亡。异丙酚可以通过脱磷酸化激活狂吠。激活YAP刺激Bcl2基因的转录,促进细胞的生存。我们的数据也表明,异丙酚通过RhoA-Lats1通路激活YAP没有大G蛋白质或MST参与。此外,我们表明,钙调磷酸酶信号之间没有互动和笨蛋在HT-22细胞活化。结论。异丙酚保护海马神经元从I / R损伤通过两个独立的信号通路,包括钙调磷酸酶/ FKBP12.6-RyR /钙超载通路和RhoA / Lats1 / YAP / bcl - 2通路。
1。介绍
缺血性中风已经成为全世界发病率和死亡率的主要原因(1]。治疗缺血性损伤,恢复血液供应的缺血区域是最有效的方法2]。然而,脑缺血再灌注(I / R)损伤后突然恢复血液供应,导致功能障碍的神经元,神经胶质细胞,和大脑血管,仍有可能中风患者的生存3]。先前的研究表明,神经细胞凋亡是I / R损伤的相关机制,和锥体神经元被发现是最脆弱的神经细胞I / R创伤性细胞凋亡(4]。近几十年来,许多研究防止海马神经元进行I / R损伤。其中,已经提出麻醉药物对脑I / R损伤的神经保护效应通过抑制细胞凋亡(5- - - - - -7]。
异丙酚,也称为2 6-disopropylphenol一直是广泛使用的静脉注射短效麻醉代理自1980年代末。据报道,除了其好处当作麻醉剂,异丙酚也产生许多nonanesthetic效果,包括免疫调节作用,镇痛效果,抗焦虑效果,神经保护属性(8]。先前的研究表明,异丙酚能减少缺氧/复氧(H / R)诱导细胞凋亡的细胞,上皮细胞和神经元9,10]。提到的几种机制,如线粒体功能障碍,m - tor途径凋亡诱导因子易位,通路(7,11]。最近,异丙酚也显示出抑制大鼠海马神经元细胞凋亡,抑制钙超载(6]。值得注意的是,异丙酚能调节多种细胞内信号通路(8]。异丙酚的机制在海马神经元的神经保护作用需要更多的探索。
YAP (Yes-associated蛋白)是一种转录辅激活负监管的河马通路,最初被确定器官功能监管的发展和规模12]。后来的研究验证YAP在神经细胞增殖的影响,生存、分化、和神经发生在中央和周边神经系统(13- - - - - -17]。与此同时,细胞内的信号调节YAP激活(被广泛的讨论18- - - - - -21]。然而,细胞外的监管者和狂吠声信号在海马神经元的详细机制本质上是未知的。目前,激活YAP最著名的是由多个磷酸激酶和磷酸酯酶(22,23]。因为异丙酚可以调节激活磷酸激酶和磷酸酶5,24),我们假设异丙酚在I / R损伤,神经保护作用可能通过激活YAP信号。
在这项研究中,我们使用hypoxia-reoxygenated海马神经元体外模拟I / R损伤海马然后旨在确认异丙酚可以防止海马神经元缺氧/复氧(H / R)诱导细胞凋亡减少calcineurin-induced钙超载。此外,角色和YAP信号机制在异丙酚减轻H / R-induced海马神经元细胞凋亡也探索。与此同时,我们旨在澄清是否有相声calcineurin-calcium通路和YAP信号之间海马神经元。
2。材料和方法
2.1。试剂
异丙酚是购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。以下抑制剂被用于这项研究:百日咳毒素(PTX;表达载体,宏伟的岛,纽约,美国),Y27632(美国BioVision苗必达,CA), C3-exoenzyme(美国丹佛市细胞骨架),和环孢霉素(Selleckchem,休斯顿,德克萨斯州,美国)。废话,phospho-YAP (Ser127) phosphoLats1 (Ser909)和phospho-MST1 (Thr183) / MST2 (Thr180)抗体购自细胞信号(美国波士顿)。伯灵顿,GAPDH caspase-3 caspase-9,生存素,Bcl2抗体购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。Alexa萤石二级抗体购自生活技术,大岛,纽约,美国。占主导地位的底片(dn)的大型和小型G蛋白结构来自UMR cDNA资源中心(罗拉,密苏里州,美国)。
2.2。细胞培养和治疗
HT-22细胞,来源于永生的小鼠海马神经元文化,被写明ATCC提供。细胞培养与杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM Gibco,热费希尔科学、上海、中国)补充10%胎牛血清(的边后卫,Gibco热费希尔科学、上海、中国)和抗生素混合(HyClone,通用电气医疗集团,宾夕法尼亚州匹兹堡,美国)在湿润细胞孵化器有限公司为5%2和95%的新鲜空气在37°C。
2.3。Hypoxia-Reoxygenation协议
执行的协议是按照先前的研究25]。简单地说,文化板块被转移到一个湿润hypoxia-controlled孵化室(1%啊2,5% N2,94%的公司2在37°C) 6小时。然后,这些细胞暴露在复氧在湿润孵化器提供的气氛中含5%股份有限公司2在37°C和95%新鲜空气6小时。
2.4。细胞生存能力分析
MTT试验是用于本研究评估神经元的生存能力。短暂治疗后,细胞被播种在威尔斯96 -文化板块。MTT被加入到细胞最终浓度为0.5毫克/毫升和孵化4小时37°C。添加DMSO溶液是溶解形成甲瓒晶体。标仪(Bio-Rad大力神,加利福尼亚,美国)被用来确定在490 nm的吸光度值。
2.5。细胞凋亡的评估
细胞凋亡的评估是通过末端转移酶- (TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定在这项研究中。治疗后,细胞被固定与多聚甲醛(4%)在室温下30分钟。然后,特里同x - 100 (0.1%, Solarbio)被用来permeabilize细胞在室温下30分钟。TUNEL分析工具包(美国罗氏,印第安纳波利斯)被用来可视化凋亡细胞。程序执行都是按照制造商的指示。荧光显微镜用于观察TUNEL-positive细胞。
2.6。流式细胞仪细胞凋亡测定
细胞凋亡测定,细胞收获后指定的治疗,与PBS洗两次,resuspended在绑定缓冲(BioLegend、圣地亚哥、钙、美国)。细胞培养和πFITC-Annexin V(美国BioLegend,圣地亚哥,CA) 30分钟,凋亡细胞的比例是通过流式细胞术分析。三个独立重复实验。
2.7。Coimmunoprecipitation
治疗后,裂解缓冲(0.1 Triton x - 100, 100更易/ l氯化钠,50更易与l盐酸三10 l更易与EDTA, 10 l更易与氟化钠,10%的甘油,更易与0.5 l phenylmethylsulfonyl氟化物,1更易/ l二硫苏糖醇,和10更易与l焦磷酸钠)被用来溶解细胞。离心后120005分钟,protein-G琼脂糖(Beyotime、上海、中国)孵化与特定抗体RyR(美国细胞信号,波士顿,MA)在上层清液和旋转为12小时。FKBP12.6特殊抗体(美国细胞信号,波士顿,MA)是用于免疫印迹。招聘分子的计算基于密度检测。
2.8。细胞内钙的评估
钙指标,Fura-2 / AM(美国纽约表达载体,大岛),是用于这项研究。治疗后,细胞被孵化Fura-2 / 10μ在室温下mol / l 30分钟。洗后,荧光逆显微镜用于观察细胞在340 nm和510海里后兴奋的图片被蔡司生理学分析软件(v3.2,蔡司)。平均荧光强度(MFI)是用于分析细胞内钙浓度。
2.9。线粒体膜电位(MMP)的决心
MMP的决心MMP的检测指标,罗丹明123年,通过流式细胞仪按照描述从先前的研究。治疗后,细胞被洗和孵化与罗丹明123解决方案(Beyotime、上海、中国)的最终浓度1μmol / l在37°C在黑暗室30分钟。一个流式细胞仪血细胞计数器(BD生物科学、钙、美国)是用于检测罗丹明123在529海里的荧光信号。
2.10。质粒和shRNA转染
6-Well盘子被播种5×104细胞/在转染前2毫升媒体24小时;细胞汇合的80% - -90%。细胞转染shRNA (100 pmol /)或质粒DNA (4μg / 2000)使用Lipofectamine试剂(美国纽约生活技术,大岛屿)根据制造商的指示。转染48小时后,细胞被用于进一步的实验。所有的成分都是购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。
2.11。免疫荧光染色
细胞被播种在室幻灯片。治疗后,细胞被固定为4% paraformaldehyde-PBS 15分钟。阻塞后5%山羊血清0.3% Triton x - 100在PBS 60分钟,细胞被孵化YAP主要抗体(1:100稀释)一夜之间在4°C。与PBS三洗后,细胞被孵化与Alexa萤石488或555共轭二次抗体(表达载体,1:500稀释)在室温下2小时。幻灯片洗了三次,然后安装。免疫荧光检测使用打印大师Retiga 2000 r相机(萨里,公元前,加拿大)40 x放大。冷冻组织,5μ米部分是准备和接受所述免疫染色。
2.12。西方墨点法
治疗后,里帕细胞裂解缓冲(美国圣克鲁斯,CA)是用来溶解细胞。总蛋白提取的一种蛋白质提取设备(Beyotime、上海、中国)和核和胞质蛋白提取使用Nuclear-Cytosol提取工具包(临时任务、生物技术有限公司、北京)根据制造商的指示。蛋白质样本进行sds - page后,分离蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。非特异性结合与阻断缓冲区被孵化。然后,特定抗体伯灵顿,caspase-3 caspase-9,狂吠,pYAP, MST1/2, pMST1/2, Lats1, pLats1,和GAPDH是用来孵化膜,然后用荧光二次孵化抗体(IRDye800CW-conjugated或IRDye680-conjugated antispecies免疫球蛋白,LI-COR生物科学,林肯,东北,美国)。荧光信号被捕获的奥德赛红外成像系统(美国东北LI-COR生物科学,林肯)在700年和800年纳米通道。盒子是手工放置在每个感兴趣的乐队,和原始的软件返回的近红外荧光值强度与背景减法(奥德赛3.0分析软件,LI-COR生物科学,林肯,NE,美国)。
2.13。钙调磷酸酶活性测定
酶活性的钙调磷酸酶与比色法测量和计算的总蛋白提取细胞治疗。钙调磷酸酶活性测定工具包(默克公司)使用,按照制造商的指示。
2.14。定量实时聚合酶链反应
shRNA转染48小时后,细胞被洗冷PBS和收集的试剂盒RLT裂解缓冲(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)。RNA提取的RNeasy迷你包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)和反向转录M-MLV逆转录酶。定量实时PCR进行光周期计480(罗氏,印第安纳波利斯)SYBR绿色我主人混合(罗氏,印第安纳波利斯)。信使rna丰富GAPDH规范化。消极的控制中不含成绩单或逆转录酶。RNA从三个独立的细胞球每次治疗进行了分析。相对基因表达计算使用方法应用生物系统公司提供的用户公告2号(P / N 4303859 b),与不属预定目标的shRNA-treated细胞作为控制在每一个数据集。引物对用于本研究如下:GAPDH: F, 50-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-30 / R, 50-GAAGATGGTGATGGGATTTC-30;生存素:F, 5-GGACCACCGCATCTCTACAT-3/ R, 5-GCACTTTGCCAGTTTCC-3 ;和Bcl2: F, 5-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3/ R, 5-TGCATATTTGTTTGGGGCAGG-3 。
2.15。统计数据
数据在这项研究中提出了收购意味着±SEM。数据通过SPSS软件分析(v17.0 SPSS)。组之间的差异通过方差分析或学生的评估测试。值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。异丙酚减轻Hypoxia-Reoxygenation - (H / R)诱导海马神经元生存抑郁和细胞凋亡
麻省理工是用来评估细胞的可行性。H / R治疗后,海马神经元的细胞生存能力被显著地抑制。然而,异丙酚预处理显著改善的可行性HT-22细胞浓度的方式(图1(一))。我们进一步测试了异丙酚的影响细胞凋亡诱导的H / R。如数据所示1 (b)和1 (c)H / R海马神经元的凋亡率显著升高使用TUNEL分析(图1 (b))和流式细胞术细胞凋亡测定(图1 (c))。然而,细胞凋亡抑制的神经元接受异丙酚治疗。一致,细胞凋亡的蛋白表达水平标记,即伯灵顿,caspase-3,和caspase-9显著升高H / R神经元和恢复时使用异丙酚(图1 (d))。
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3.2。异丙酚减轻H / R-Induced胞内钙积累和MMP的损失通过抑制钙调磷酸酶活性和FKBP12.6-RyR分裂
因为细胞内钙超载被认为是细胞凋亡的发起者26),我们发现HT-22细胞胞内钙含量的变化受到H / R有或没有异丙酚。如数据所示2(一个)和2 (b)H / R治疗显著增加细胞内钙和MMP受损。然而,在propofol-treated神经元,钙积累和MMP的损失都是减毒浓度的方式。我们进一步研究了机制propofol-inhibited H / R-induced胞内钙积累。因此,H / R治疗显著增加钙调磷酸酶活性,逆转的异丙酚浓度的方式(图2 (c))。此外,co-IP试验发现了FKBP12.6与RyR3分离后H / R治疗。然而,当神经元服用异丙酚,FKBP12.6分子招募与RyR3绑定(图2 (d))。
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3.3。Downregulation YAP受损引起的海马神经元凋亡的保护作用的异丙酚H / R
潜在YAP参与异丙酚从H / R-induced保护海马神经元细胞凋亡进行了测试。建立了稳定HT-22细胞低表达YAP使用成分(图3(一个))。因此,YAP击倒显著异丙酚抑制HT-22受损细胞凋亡引起的H / R(图3 (b))。
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3.4。Propofol-Induced脱磷酸作用和核易位HT-22狂吠的细胞
我们测试了异丙酚是否影响的去磷酸化YAP Ser127 (dpYAP)在海马神经元。异丙酚诱导剂量和时间的方式dpYAP HT-22细胞,4人力资源的最大效应,15岁μM(图4(一))。与此同时,异丙酚诱导YAP核易位(图4 (b))。激活YAP刺激基因的转录促进细胞存活,如生存素和Bcl2 [12,27,28]。我们进一步测试了异丙酚的角色在生存素的表达和Bcl2。如图4 (c),异丙酚显著增加Bcl2 mRNA和蛋白表达水平。然而,并没有改变HT-22异丙酚治疗后存活素表达的细胞。
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3.5。异丙酚激活通过RhoA-Lats1狂吠
通过河马确定异丙酚行为调节YAP磷酸化途径的核心组件,我们研究异丙酚对磷酸化的影响MST1/2 (phospho-MST1 (Thr183) / MST2 (Thr180))和Lats1 (phospho-LATS1 (Ser909))。我们发现,异丙酚在HT-22 MST1/2磷酸化细胞没有可检测的影响。然而,异丙酚脱去磷酸Lats1(图5(一个))。G蛋白信号以来证明调节背阔肌的激活,我们进一步测试的角色在propofol-induced G蛋白去磷酸化的Lats1 (dpLats1)和YAP (dpYAP)具体药理抑制剂和显性负(dn)形式的G蛋白。如图5 (b)百日咳毒素(PTX Gi蛋白抑制剂),dn-Gq dn-G12,dn-G13并不影响propofol-induced dpLats1 dpYAP。有趣的是,propofol-induced dpLats1ρ抑制剂和dpYAP被废除,C3转移酶,以及由ρ激酶(岩石)抑制剂,Y27632 HT-22细胞。我们进一步确定哪些ρ激酶参与了。结果从细胞转染不同dn LPA-induced所需形式的ρ表明RhoA dpLats1(图5 (c))。
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3.6。钙调磷酸酶和YAP激活之间没有交互观察海马神经元
钙调磷酸酶属于蛋白质磷酸酶(PP),也叫蛋白磷酸酶2 b (PP2B)。先前的研究表明,YAP激活可能是由页,如PP1和PP2A [29日,30.]。因此,我们旨在澄清是否存在钙调磷酸酶和YAP激活海马神经元之间的相互作用。如图6钙调磷酸酶的表达,抑制和激活并不影响YAP激活有或没有异丙酚治疗,这说明独立角色的磷酸酶和YAP异丙酚保护海马神经元从H / R-induced细胞凋亡。
4所示。讨论
海马体是中枢神经系统由于其功能重要的至关重要的作用在人类的记忆和学习能力。因此,海马神经细胞受到I / R损伤可能导致关键的神经功能障碍(31日]。最近,异丙酚的神经保护作用已被证明在I / R模型。然而,较少的研究旨在探讨异丙酚能否保护海马神经元从I / R损伤。在这项研究中,刺激I / R损伤hypoxia-reoxygenation模型用于治疗海马神经元。结果表明,异丙酚治疗显著抑制hypoxia-reoxygenated海马神经元的凋亡。
细胞内钙超载被认为是细胞凋亡的发起者26]。相信I / R损伤可能引起细胞内钙的积累32]。最近的一项研究表明,异丙酚可以减轻海马神经元损伤诱导的I / R通过抑制钙超载6]。异丙酚的一致,我们的结果显示一个类似的机制在保护海马神经元从I / R损伤。细胞内钙离子浓度是由钙离子通道如肌浆网钙腺苷三磷酸酶(SERCA的),阿诺定受体(RyRs)和l型钙通道高瓦斯)。钙调磷酸酶活性变化是参与调节细胞内钙通过调整开放RyR通过影响FK506-binding蛋白质12.6 (FKBP12.6) [33,34]。当遇到特定的刺激,钙调磷酸酶的活性调节促进FKBP-RyR分裂的复杂(35]。因此,RyR通道打开释放钙诱导钙超载。在目前的研究中,异丙酚被证明减少钙调磷酸酶的酶活性在hypoxia-reoxygenated海马神经元,导致脱离FKBP12.6从RyR3关闭通道,降低细胞内钙超载。
异丙酚作为一种广泛使用的静脉注射短效麻醉,是调节多种细胞内信号通路(8]。因此,我们提出假设其他信号通路可能参与异丙酚的神经保护作用。有趣的是,我们表明,表达YAP异丙酚保护海马神经元细胞凋亡的关键从H / R损伤。此外,异丙酚可以通过脱去磷酸激活YAP狂吠,促进核易位。转录辅激活,激活YAP能促进干细胞/祖细胞自我更新,推动细胞迁移和增殖,抑制细胞凋亡主要通过绑定,而在细胞核27]。最近的全基因组测序导致多个目标基因狂吠。其中,生存的基因(例如,生存素和Bcl2) proliferation-associated基因(如Ctgf, Cyr61,原癌基因,Foxm1,和mir - 130), differentiation-associated基因(如Oct4、Nanog Cdx2,和Pax3),和迁移/ invasion-associated基因(如Ctgf、Cyr61 Zeb2)排序(27]。异丙酚以来证明促进海马神经元生存和抑制细胞凋亡在我们的研究中,在此,我们进一步发现异丙酚可以诱导表达Bcl2(而不是生存素),这是专门作为一个重要的凋亡蛋白。
狂吠是一种转录辅激活PDZ-binding图案。其脱去磷酸形态可以把进入细胞核绑定而广泛的转录因子家族和诱导表达的基因(27]。YAP激活最初确定被河马负调控通路通过Ser127磷酸化的激酶,从而导致YAP 14-3-3绑定,胞质保留和退化(36]。先前的研究表明,YAP磷酸化可能是由细胞接触,机械信号、压力信号,细胞极性/架构,和细胞周期。然而,细胞外的可溶性监管者YAP鲜为人知,直到玉等人发现生物活性脂质,LPA, sphingosine-1-phosphate (S1P)在乳腺细胞外的监管者YAP细胞系(37]。此外,证明了激素调节狂吠,如肾上腺素、雌激素和胰高血糖素38]。在目前的研究中,我们表明,异丙酚作为另一个细胞外可溶性狂吠的监管机构。异丙酚可以脱去磷酸Ser127狂吠,这导致YAP激活和核易位。主要是可溶性因子调节通过河马YAP通路的同源G-protein-coupled受体和相关蛋白亚基进行小gtpase RhoA,和岩石,导致改变的激活Lats1/2 [38]。坚持,我们的数据表明异丙酚脱去磷酸Lats1/2并通过RhoA YAP部分和岩石。然而,大G蛋白质,胃肠道,《Gq》、G12/13独立,没有涉及,这表明异丙酚G-protein-coupled受体的调节YAP活动。因此,异丙酚的细节小gtpase海马神经元的监管需要更多的探索。
在古典河马通路,Lats1/2直接由MST1/2监管。最近,研究发现几个磷酸激酶和磷酸酶视为上游Lats1监管者,MST1/2平行,如PKA、NF2 MAP4K4, AMPK。有趣的是,一项研究改变HT-22细胞法定量分析了全球组织磷酸化蛋白质组异丙酚治疗后显示,异丙酚可以调解NF2的磷酸化和MAP4K439]。我们的数据显示,propofol-induced去磷酸化的Lats1/2 RhoA YAP部分被抑制。因此,我们推测,异丙酚可以通过NF2-Lats1/2和MAP4K4-Lats1/2通路激活狂吠。
5。结论
我们的研究结果表明,异丙酚可以保护海马神经元从I / R损伤通过两个独立的信号通路,包括钙调磷酸酶/ FKBP12.6-RyR /钙超载通路和RhoA / Lats1 / YAP / bcl - 2通路。这项工作进一步支持异丙酚对I / R的潜在治疗作用的神经系统。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。另外,数据也可以从相应的作者要求((电子邮件保护))。
的利益冲突
作者没有利益冲突的声明。
作者的贡献
李小和李姚明贡献同样这项工作。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金的资助中国没有。81502295)。