文摘

目的。这项研究的目的是开发一个模型,允许调查正是低级激光治疗的效果(低)对血小板聚集和验证假说对一氧化氮(NO)生物利用度的作用在调节血小板聚集和血小板活化标志物。方法。共41岁健康志愿者21-45年进行调查。起初,血小板聚集,以应对三个受体激动剂(陷阱、ADP和胶原蛋白)评估后以前接触不同剂量的激光辐射(λ= 662海里)评估剂量反应的效果。随后,血浆血小板活化水平标记(PF4-platelet 4和sP-selectin)和一氧化氮合酶的底物,精氨酸,其竞争性抑制剂(ADMA-asymmetric dimethylarginine和SDMA-symmetric dimethylarginine)测量。结果。所有剂量的激光辐照显著降低聚合。然而,最明显的效应观察19.7 J /厘米²。血小板活化标志物的水平没有显著差异,也在nitric-oxide-metabolic-pathway化合物分析组之间。结论。我们演示了在建立在体外实验模型的低强度可再生的方式降低了全血血小板聚集无论任何生物利用度和血小板活化标志物的变化。

1。介绍

众多研究表明,低水平激光疗法(低)在人类细胞中调节生物过程。最重要的变化在细胞代谢包括胞内酶的激活增加参与呼吸链的DNA和RNA合成的增加以及调节细胞凋亡(1]。结果,低能激光辐射已经发现许多应用程序在日常临床实践。

越来越多的在过去几年已经注意低心血管治疗的一部分。最近,我们已经表明,与低能量激光血管内照射在经皮冠状动脉介入(PCI)减少再狭窄的大小,可以调节血管壁的炎症过程(2,3]。尽管这种方法已经被证明是一个安全的治疗选择,低强度对血小板活性的影响尚不清楚。进行了迄今为止的研究结果不一致。其中一些建议增加血小板活动后暴露在低能量激光。霍夫曼和梦露表明低强度可以增强血小板激活(4]。另一方面,汉et al。5]指出减少血小板反应低。也观察到类似的结果灵族等。6布里尔)和et al。7]。

有几个因素提出修改血小板活性和炎症反应,其中一氧化氮(NO)是一种最著名的(2- - - - - -7]。低能量激光照射暴露增加了生产的一些实验模型在体外和在活的有机体内(8,9]。然而,这种现象的确切机制是未知的8,10]。一氧化氮降低血小板粘附和聚集11]。

因此,我们旨在调查没有是一个潜在的发射机是否低强度调节血小板活性。为了探讨低强度对血小板活化的影响,等离子体水平PF4和sP-selectin测量后的样品在基线和激光辐照。

2。材料和方法

所有实验和批准按照当地生物伦理学委员会的指导方针,遵守赫尔辛基宣言的原则和标题45岁的美国联邦法规,46岁的一部分保护人类受试者(2001年修订后的11月13日,有效的12月13日,2001年),和所有的病人登记签署了知情同意参与这项研究。

只有21至45岁健康志愿者参与了这项研究。受试者没有使用的药物可能会影响结果,如阿司匹林和其他非甾体类抗炎药(宽限期是10天),和荷尔蒙避孕法(洗脱期3个月)。病人服用药物,一氧化氮代谢的影响,包括磷酸二酯酶抑制剂、膳食补充剂含有精氨酸,和硝酸盐,也排除了这个实验。

研究分为两个阶段。第一阶段旨在确定辐射剂量导致最有效的生物效应(剂量反应曲线的分析)。它是由变化的评估选择受体激动剂引起的全血血小板聚集(凝血酶受体激活肽(诱捕试验),ADP (ADP-test)和胶原蛋白(COL-test))。五种不同剂量的辐照应用。捐赠后,全血(500μl)搬到特殊塑料点20毫米直径(用于日常实践执行血型测试),随后用5种不同的能量剂量辐照。什么是重要的,在辐射,控制(从同一个病人获得未照射全血)也在点和下一个聚合使用阻抗测定凝集计(多平台®分析器,Dynabyte医疗、德国)配对分析。在第一阶段的研究中,研究小组组成九个科目(5男4女,平均年龄为28.9±4.7 y)九配对分析。

在第二阶段,只有最有效的辐射剂量应用。相同的受体激动剂被使用,和相同的辐照条件下,紧随其后的是额外的生化分析包括血小板活化标志物和代谢物进行一氧化氮代谢途径(见下文)。之后,血小板聚集在相同条件下执行上述规定。这部分的研究涉及到41 participants-20女性和21岁男性(平均年龄27.5±7.2 y)。

2.1。血液采集

血小板聚集检测,整个血液被收集到Sarstedt S-Monovette水蛭素管(04.1944.001数量)。与柠檬酸或肝素,水蛭素可防止血液凝结通过直接抑制凝血酶,使血小板功能诊断在原生状态。

为了获得等离子体测定sP-selectin, PF4,精氨酸,ADMA, SDMA实验的第二部分,血液收集Sarstedt S-Monovette(1.6毫克EDTA /毫升血液)管和后30分钟内收集,这是离心机在1000 g×15分钟在4°C和储存在−20°C到分析。

2.2。激光源和验证

在这项研究中,一个半导体激光器(Optel®,波兰),二极管的光与光纤连接(“梳辫子的”)。光学系统是放置在一个15厘米的距离从血液样本。扩散系统位于远端引起的光纤散射激光的一个圆的直径2厘米。设备发出的辐射的波长为662 nm,和设置辐照度为0.050 W /厘米²辐射暴露剂量。在实验的第一阶段,我们计划用五种不同剂量在几何级数增长,即2 J /厘米²4 J /厘米²8 J /厘米²16 J /厘米²和32 J /厘米²。

由于重要的方法论的差异研究到目前为止,我们决定验证实验模型。辐照血液样本之前,激光辐射到达的确切参数的验证测试样品。为了这个目的,我们使用一个手动计PMD100D(美国新泽西州Thorlabs有限公司)。测量在同一个地方的血液样本进行辐照。结果表明,精确测量辐射暴露剂量2.4 J /厘米²4.9 J /厘米²9.9 J /厘米²19.8 J /厘米²和39.5 J /厘米²。

激光的辐照度也验证,达到0.053 W /厘米²。为了验证辐射的波长半导体激光源,我们使用日本横河- aq - 6370 c光学频谱分析仪(日本)。波长光谱的分析,这是专门的实验,证实了单色光(峰值波长的λ= 662.3海里)。

2.3。聚合

全血聚合使用阻抗测定凝集计(多平台分析仪、Dynabyte医疗、德国)。在分析,sample-reagent混合物搅拌可废弃的聚四氟乙烯-(聚四氟乙烯)涂层电磁搅拌器(800 U /分钟)。预热至37°C盐水(300μl)放入测试细胞的实际上全血(300μl)和搅拌在37°C;测量开始通过增加20倍μl适当的受体激动剂:凝血酶受体激活肽(诱捕试验、猫。数量6675883190,罗氏诊断)的最终浓度10.5μ米,ADP (ADP-test猫。数量6675794190,罗氏诊断)的最终浓度3.2μM,胶原蛋白(COL-test猫。数量6675832190,罗氏诊断)的最终浓度1.05μ克/毫升。阻抗的变化由血小板粘附和聚集在电极导线不断被探测到。两者的平均值决定表达在任意单元(AU)。

2.4。血小板活化标志物

sP-selectin / CD62P的血浆浓度基线以及低后由夹心酶免疫分析法测定技术,使用商业ELISA试剂盒(欧洲猫:BBE6、研发系统有限公司,英国)的灵敏度0.5 ng / ml,根据制造商的指示。光密度450/620纳米测量与BioTek吸光度与软件Gen5标。intra-assay简历少6%,interassay简历少10%。

为了测量PF4的浓度在等离子体(基线以及低后),我们使用了商业测试人类PF4 ELISA试剂盒(猫:ELH-PF4 RayBiotech Inc .,乔治亚州,美国)的敏感性20 pg / ml,根据制造商的指示。光密度450纳米测量与BioTek吸光度与软件KC4标。intra-assay简历少10%,interassay简历少12%。

2.5。一氧化氮代谢途径的代谢产物

评价LLLT-dependent一氧化氮的变化分析了可用性评估PRMT-L-Arg / ADMA-DDAH轴。血浆精氨酸(没有合酶的底物)及其甲基衍生物(非对称和对称dimethylarginine-ADMA SMDA,一氧化氮合酶的竞争性抑制剂)测定的高效液相色谱法(HPLC)。血浆样品和标准提取固相萃取筒与SCX50列(美国瓦里安公司)。洗出液derivatized了o-phthaldialdehyde (OPA)和由权力平等主义的反相色谱对称C18柱(150×4.6毫米,5μ米粒子大小;美国水域Corp .)。磷酸钾缓冲(50毫米,pH值6.6)包含12%乙腈作为流动相的流速1.1 ml / min。荧光检测进行励磁340海里和发射波长450纳米。在电脑上执行的测试是由明星色谱工作站软件(版本6.3);该装置是由瓦里安(美国纽约)。

2.6。热效果

为了排除可能的热效应的重要性低聚合结果,我们决定在辐射测量温度增加。测量是使用一个AX5002 AXIOMET临时公司(瑞典)的测量精度±0.1°C。温度测量进行了接触的整个时期,一直持续到血液温度回到基线值(图1)。

我们观察到在激光辐照最小的热效应。在辐射剂量的主要阶段研究中使用(19.8 J /厘米²),血液温度的绝对增加1.5°C从一开始的辐照(开始)(图1)。返回预曝光水平后150秒后停止辐照(停止)(图1)。

2.7。能量剂量

根据可用的文学我们选择五个不同的辐射暴露剂量照射血液(2.4 J /厘米²4.9 J /厘米²9.9 J /厘米²19.8 J /厘米²和39.5 J /厘米²)。辐照后立即、聚合进行了测试。

2.8。统计分析

数据表示为平均±标准差。Shapiro-Wilk常态分布的验证与测试,列文的方差的统一测试,是合适的。在定量参数变量的情况下,我们使用学生的t以及。

对于非参数变量,Mann-Whitney分析,适当的。进行了分析使用Statistica 10.0 (StatSoft)软件。

3所示。结果

第一阶段的实验证明,每个引起的辐射剂量应用显著降低血小板聚集与未照射对照组相比,无论受体激动剂。

观察对于陷阱,最大的减少剂量的4.9 J /厘米²。显著但不明显降低聚合也获得了剂量的2.4 J /厘米²9.9 J /厘米²19.8 J /厘米²和39.5 J /厘米²(图2)。

最大的减少聚合观察胶原蛋白和ADP的辐射照射剂量19.8 J /厘米²( 胶原蛋白和 ADP,职责。)(数据3和4)。没有统计上显著的差异在不同的辐射剂量之间的聚合反应。只有大antiaggregatory观察效果的剂量9.9 J /厘米²比39.5 J /厘米²对ADP受体激动剂。因为获得了最大的生物效应与剂量的19.8 J /厘米²在第二阶段中,我们使用一个(数字3和4)。

第二阶段的研究涉及到41 participants-20健康年轻女性和21人。所有受体激动剂(ADP、陷阱和胶原蛋白),聚合结果在低强度显著相比不辐照控制(非辐照)(表样例1)。

为了验证潜在的分子机制的参与的低强度影响血小板聚集,我们分析了改变血小板活化标志物水平以及一氧化氮的生物利用度的水平标记(L-arginine-a一氧化氮合酶的底物,以及竞争inhibitor-ADMA SDMA特征不明显抑制属性)使用的能量剂量19.8 J /厘米²。没有统计上显著的差异在精氨酸浓度,ADMA、SDMA两组辐照一分析和控制不低(表1)。类似的结果观察关于血浆血小板激活markers-no在统计上有显著差异的水平PF4与sP-selectin辐照与未照射血液观察(表1)。

4所示。讨论

最好的据我们所知,这是第一个人类研究探讨全血血小板聚集在严格控制和低能量激光照射后可再生的体外模型。在此前进行的一些研究利用激光辐射,很难定义显然血液所遭受的辐射参数(4- - - - - -8]。大多数作者认为辐射发射激光源直接到达血液样本没有任何损失。然而,模型具有一定的局限性,特别是当使用半导体激光器时,已证明了哈迪et al。12]。这种简化使得个人实验的结果无法比拟的。为了避免偏见,测量激光辐射到达血液样本进行。我们知道测量的准确性可能稍微不同于实际的辐射剂量。这种现象应该与半径的差异(10毫米和20毫米),测量系统的手动计PMD100D和塑料井用于存储期间血液暴露。然而,考虑到分散激光束的直径(20 mm),在辐照血液样本的中心位置,< 1毫米薄血层,这是第一个试图准确地描述实验模型使它在后续研究中可再生的。一个有效的辐射剂量可以认为坚持一个衡量我们。比这些辐射值是不同的预期,已确定的基础上的理论计算。由于不同的辐射剂量低用于研究到目前为止(4- - - - - -8)和缺乏证据支持使用一个特定的剂量,我们是第一个执行最初的实验使用这种宽量程辐射剂量的一部分,后来允许我们选择最有效的辐射剂量,并说明剂量反应的效果。

由于使用低能量激光辐射在日常临床实践(2,13,14),我们决定测试的全血血小板聚集反应。因为学习小组是均匀的,我们获得的模型“生理”血液反应低强度的行动。选择健康志愿者的允许限制潜在影响因素的数量获得结果。在这项研究中,我们使用的波长λ= 662海里。可用的数据显示(15这两个波长范围λ= 600 - 700 nm和λ= 800 - 900 nm用于修改血小板功能。这些波长的辐射是在低强度的“治疗窗口”。它的特点是规模较小的吸收水分子,促进血液组件上的动作。辐射的热效应时不出现辐照度低于100 mW /厘米²(在我们的研究中,辐照度53 mW /厘米²使用和绝对增加了1.5°C在血液的温度,在3分钟内恢复到基线值)。考虑到多平台的温度在分析凝集计达到37°C,我们假设上面提到的增加1.5°C观测结果的影响可以忽略不计。

聚合的结果表明低能激光辐射降低血小板聚集反应测试剂量使用的能源和所有三个受体激动剂(ADP、陷阱和胶原蛋白)。值得注意的,我们是第一个表明低能激光辐射的抗血小板效应也适用于整个血液制剂。最新公布的研究(4- - - - - -7)进行了富含血小板血浆(PRP)。布里尔et al。7]显示减少血小板聚集活性低强度(λ0.4 - -4.2 J = 632.8 nm和能源)当以古典光学凝集计响应陷阱。有趣的是,这种效果是剂量和time-elapsing-from-exposure-dependent。Mohan et al。5)(λ= 1060 nm和能源10 - 50 J)观察到类似的产出时作者显示聚合反应胶原蛋白的减少,ADP和瑞斯西丁素。

我们的数据站在反对霍夫曼和梦露的研究4),它已经表明,低强度不修改血小板凝血酶反应。作者假设增加血栓形成和增加的力量能够绑定某些凝血因子低后血小板表面。应该注意的是,PRP和孤立斑块以及辐照度剂量(12 J /厘米²波长650 nm)是如何使用的,这可能严重影响结果。

有趣的是,聚合的调制低强度之间的各种受体激动剂有关。这种关系已经证明陷阱和ADP之间。进行的分析表明,该修改的全血血小板聚集反应低强度的陷阱也预测ADP-induced聚合的变化,这可能会导致细胞内信号转导途径之间的相声源于这两个受体激动剂。目前研究和实验结果可能表明改性聚合反应与低能量激光照射后最有可能发生的结果变化直接导致血小板或旁分泌nonmorphotic等离子体组件的影响。因此,等离子体辐照前后血小板活化标志物水平进行了分析。测量显示PF4之间没有显著差异和sP-selectin水平在两组。提出数据似乎不相容的一个布里尔et al。7后),减少P-selectin低强度。在我们的研究中,我们研究了可溶性部分P-selectin等离子体和布里尔关注P-selectin分数位于表面的血小板。要仔细考虑,它可以假定低修改血小板细胞膜的成分,但不影响等离子体释放的因素。

一氧化氮是一种有效的抗血小板因子。低能量激光辐射修改细胞色素的功能,从而导致增加一氧化氮产量(8,9]。在我们的研究中,没有明显的变化水平精氨酸,ADMA, SDMA后低强度相比基线值。因此,这些数据表明,低强度不会改变一氧化氮的合成。然而,考虑到这些结果,我们不能排除,没有负责降低血小板聚集。不可能直接增加释放血细胞(例如,从nitroso-hemoglobin (Hb-NO)) (8,16负责修改的聚合。然而,在我们的研究中,我们不确定这部分没有水平。这将需要测定硝酸或cGMP水平的变化作为第二信使。

5。结论

这是第一次人类研究证明在严格的条件下,低能量激光照射降低全血血小板聚集在一个在体外模型机制独立一氧化氮代谢和没有显著影响血小板活化标志物的释放。

数据访问

本研究在EudraCT注册数据库。EudraCT没有。2014-001609-41已发布协议代码。POIG.01.01.02-02-001/08project19。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。资金的来源(研究)没有导致任何利益冲突有关出版的手稿和客观的数据。

确认

项目是由欧盟资助的操作下的欧洲区域发展基金项目创新经济2007 - 2013 POIG.01.01.02-02-001/08 Wrovasc-Integrated心血管医学中心的一部分。