文摘
神经变性在多发性硬化症与氧化应激有关。富马酸二甲酯(DMF)是一种有效的口服治疗选项可以减少疾病复发缓和多发性硬化患者的活动和进展。DMF激活转录因子核因子红细胞两个相关因子2 (NRF2)导致增加合成的主要细胞抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)和杰出的神经保护在体外。我们之前证明DMF能够提高谷胱甘肽水平即使谷胱甘肽合成受到抑制时,建议增强谷胱甘肽循环。这里,我们确实发现DMF诱发谷胱甘肽还原酶(GSR),一个homodimeric黄素蛋白,催化GSSG还原谷胱甘肽利用NADPH作为减少辅助因子。击倒的GSR使用池大肠杆菌核糖核酸酶III-digested siRNAs或药理GSR的抑制,然而,也诱导抗氧化反应使其无法核实DMF-mediated神经保护的疑似衰减。然而,cystine-free中,谷胱甘肽合成是废除,药物抑制GSR大大降低了回收DMF对谷胱甘肽的影响。我们得出结论,DMF增加谷胱甘肽循环通过感应的谷胱甘肽还原酶。
1。介绍
虽然越来越多的治疗选择开发防止急性炎症侮辱在多发性硬化症(MS)迫切需要一个有效的治疗慢性神经变性之后发生。这是特别重要的,因为这退化被认为是一个主要因素驱动这些患者的长期残疾的发展。一个有前途的治疗干预的目标是氧化应激在[女士积极参与神经退化1- - - - - -3]。富马酸二甲酯(DMF)是一种有效的口服治疗,降低患者的疾病活动和进展复发缓和女士(4和牛皮癣5]。DMF及其活性代谢物单甲延胡索酸酯(MMF) [6- - - - - -8]起到一些免疫调节作用涉及细胞凋亡增加T细胞刺激与白介素- 2 (IL)或anti-CD3抗体(9),抑制易位的细胞核核因子kappa B1 / p50 (NF-kB1)诱导细胞因子肿瘤坏死因子α和il - 1α(10],增加保护的生产辅助T 2细胞因子il - 4和IL-5 CD2 / CD8单克隆antibody-stimulated外周血单核细胞(11]。除了这些免疫调节行动,DMF有突出的抗氧化活性;它首先引发短暂的氧化应激通过清除主要细胞内抗氧化剂谷胱甘肽(GSH) (12- - - - - -15]。这导致稳定和提高水平的转录因子核因子红细胞两个相关因子2 (NRF2)通过Kelch-like ECH-associated蛋白1 (KEAP1)通常目标NRF2泛素化和退化但失去这种能力以应对亲电试剂和氧化剂16,17]。NRF2然后把原子核并结合抗氧化反应等保护性基因的启动子元素heme-oxygenase-1 [18)和NADPH-quinone-oxidoreductase-1 (NQO1) [19]。这反过来又增加了细胞内的谷胱甘肽浓度(18,19),使细胞抗氧化应激。
我们最近调查的浓度和时间依赖性DMF-mediated保护神经细胞,表明神经保护的DMF浓度抑制细胞因子生产没有施加的脾细胞凋亡。神经保护研究内生氧化应激模型,在细胞外谷氨酸块glutamate-cystine逆向转运系统导致剥夺胱氨酸及其简化型半胱氨酸、谷胱甘肽的合成的病原反应底物。随后的谷胱甘肽耗竭导致活性氧的积累和细胞死亡的氧化应激(最近了20.])。在这些神经保护化验,活性代谢物MMF同样有效,但需要更长的潜伏期时间变得活跃(21]。我们的研究结果表明,低剂量的DMF和MMF可能带来抵抗氧化应激和免疫调节T细胞凋亡的必要性。本研究的一个重要的发现是,DMF还能够提高谷胱甘肽水平,当病原反应酶在谷胱甘肽合成,glutamate-cysteine连接酶,抑制或系统活动废除了孵化cysteine-free介质(22]。因此DMF仍然可以发挥保护,当新创谷胱甘肽合成受阻,建议增强谷胱甘肽循环。
谷胱甘肽的关键酶,这种酶介导回收是谷胱甘肽还原酶(GSR),一个homodimeric黄素蛋白,催化GSSG还原谷胱甘肽利用NADPH作为减少辅助因子。GSR子包含抗氧化剂反应元素(23),使其成为可能的观察效果。在这个贡献,我们量化GSR感应DMF和评估GSR击倒的效果和药物抑制细胞死亡引起的内源性氧化应激。
2。材料和方法
2.1。材料
DMF得到从西格玛奥德里奇和可溶性二甲基亚砜(DMSO)。细胞培养菜来自他一一Bio-One。DMEM细胞培养基、无菌磷酸盐缓冲盐水、青霉素、链霉素、L-glutamic酸、谷酰胺200毫米(100 x),丙酮酸钠10 mM, Opti-Mem®(1 x)来自Gibco生命技术。从Promega细胞浓度测定蓝。Lipofectamine®RNAiMAX™试剂被生活从表达载体技术和(S)从TOCRIS 4-carboxyphenylglycine。
2.2。细胞培养、可行性分析以及谷胱甘肽测量
我们使用了海马鼠标细胞系HT22缺乏ionotropic谷氨酸受体。细胞系的最初生成的subclone HT4线(24)选择更高的对谷氨酸毒性的易感性(25]。HT22细胞培养所描述(26后24 h)和生存能力量化细胞谷氨酸之外的效价蓝色(施)试验(Promega)和车辆治疗的规范化。总谷胱甘肽酶学测定如前所述[26)和归一化细胞蛋白质的bicinchoninic酸碱度(皮尔斯)方法。谷胱甘肽释放到细胞培养基也用数量来表示酶4 h后cystine-free介质和归一化细胞总蛋白;1,3 -二[2-chloroethyl] 2-nitrosourea (BCNU;卡莫司汀)在乙醇可溶性,也用作车辆控制。氢氧化钠(S) 4-carboxyphenylglycine可溶性,也用作车辆控制。Cystine-free中准备使用DMEM,高葡萄糖,w / o谷氨酰胺,蛋氨酸、胱氨酸补充丙酮酸钠为1%(100毫米),L-methionine谷酰胺(200毫米)的2%和3%。
2.3。核转染
任务®esiRNA对鼠标KIF11,美国人,和鼠标GSR, L-methionine, BCNU从西格玛奥德里奇获得。转染是执行Lipofectamine根据制造商的协议(生命技术)。简单地说,细胞转染1600 ng esiRNA 24-well盘子和山肩48 h后的密度每到96 - 2500细胞板。
2.4。免疫印迹
如前所述(执行免疫印迹26)使用抗体GSR (n项)抗体(1:1000;Antikoerper-online.de ABIN406391)和anti-actin抗体(1:4000;微孔MAB1501)。二次抗体是anti-rabbit免疫球蛋白(H + L) (DyLight™800共轭)和anti-mouse免疫球蛋白(H + L) (DyLight™680共轭)从细胞信号技术™(1:30000)。
2.5。定量实时聚合酶链反应
RNA提取、逆转录定量实时PCR进行如前所述[26)使用Fam / Dark-quencher探针从普遍调查图书馆™(罗氏)或单独设计Fam / Tamra探针(MWG)。Beta-actin和产生HPRT作为内生控制基因和与DMF孵化后没有显示出微分表达式。引物和探针序列可以从作者获得。
2.6。统计分析
统计分析了使用电子表格(Microsoft Excel)和棱镜(Graphpad)软件。多个组进行了分析与双向方差分析和Bonferroni或Dunnett事后与双尾测试,比较两组以及。值< 0.05被认为是重要的。
3所示。结果与讨论
3.1。Cytoprotective DMF浓度诱导谷胱甘肽还原酶的表达
我们第一次复制我们的发现DMF防止谷氨酸毒性,发现5和10μM DMF诱导在24 h(图一个健壮的保护1(一))如前所述。这种保护参与谷胱甘肽含量的增加甚至在不能合成谷胱甘肽的条件,因为缺乏必要的构建块胱氨酸(图1 (b))。这表明谷胱甘肽观察的增加是由于增加谷胱甘肽循环。符合这一点,我们确实观察到丰富的GSR的增加与防护的DMF浓度,细胞治疗5和10μ如图所示,通过免疫印迹抗体特定GSR,相比β肌动蛋白作为加载控制(图1 (c))。DMF因此诱发的表达关键酶参与谷胱甘肽循环,GSR。
(一)
(b)
(c)
3.2。小干扰rna对GSR的识别
澄清GSR的贡献为DMF赋予的保护我们决定降价GSR endoribonuclease-prepared小干扰抑制RNA (esiRNAs)和池siRNAs造成长双链RNA的乳沟大肠杆菌核糖核酸酶III。我们与esiRNA转染HT22细胞攻击GSR或荧光素酶作为控制。24小时后,10μM DMF或车辆再次添加后24 h蛋白溶菌产物被用于与GSR或肌动蛋白抗体免疫印迹加载控制。Untransfected细胞DMF处理或车辆作为额外的控制。esiRNA对GSR确实完全废除GSR表达式(图2(一个))。DMF无法诱导GSR表达式的GSR-specific esiRNAs而GSR仍表达esiRNA针对荧光素酶的存在。我们的结论是,esiRNA-induced击倒可以作为一个工具来阐明GSR的贡献对氧化应激DMF-mediated保护。
(一)
(b)
(c)
3.3。击倒的GSR促进DMF的保护作用诱导协同的抗氧化反应的基因
我们与esiRNA转染的细胞对GSR和控制esiRNA 6-well-plates。24 h后细胞再次接受DMF或车辆和24小时山肩到96 -好盘子,然后接触到10毫米谷氨酸为额外的24小时。我们观察到的两件事;首先,esiRNA GSR诱导保护本身和第二,这甚至提高了10赋予的保护μM DMF(图2 (b))。我们假设缺乏GSR超过48小时的额外治疗前与谷氨酸可能诱发的抗氧化反应协同DMF增加核Nrf2蛋白质含量(21]。
澄清的观测协同效应的组合DMF和GSR击倒,我们量化的表达基因属于抗氧化剂反应电池在DMF -和siGSR-treated细胞和各自的控制。这确实证明治疗导致一组协同的抗氧化剂成绩单的感应。只有glutamate-cysteine连接酶的催化亚基(GCLC)和酶类在两组1 (PRDX1)是调节,而谷胱甘肽年代转移酶ω1 (GSTO1)和血红素加氧酶1 (HO-1)在siGSR-treated DMF-treated表达下调,但调节细胞。NADPH-quinone-oxidoreductase-1 (NQO1)和xCT(也称为SLC7A11)显示了相反的模式(图2 (c))。
3.4。药物抑制谷胱甘肽还原酶也保护当Preincubated 24 h
BCNU(卡氮芥)是一种抗肿瘤,DNA-alkylating剂,抑制细胞谷胱甘肽还原酶活性(27]。理论上药理代理人应当及时抑制GSR,允许更精确的分析的谷胱甘肽的贡献回收DMF的保护作用与重要告诫的特异性,因为大多数抑制剂抑制多个酶。BCNU concentration-dependently HT22细胞引起细胞死亡的LD50约200μM(图3(一个))。正如所料,10 - 100的浓度要低得多μ(图米再次引起了保护3 (b))再由一些抗氧化的感应记录,最显著的cystine-glutamate逆向转运xCT (SLC7A11) HO-1, NQO1(图3 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
然后我们试图减弱DMF预培养的保护作用,同时细胞谷氨酸的接触,在这些细胞抑制胱氨酸进口,因此导致谷胱甘肽耗竭,以及BCNU。我们只观察到一个非常小,而不是显著减少在100细胞治疗的可行性μM BCNU。未使用DMF的细胞但暴露于谷氨酸和BCNU,相比之下,更易于细胞死亡(图3 (d))。这意味着DMF甚至防止联合攻击抑制的一个代理新创谷氨酸合成谷胱甘肽,谷胱甘肽循环,BCNU,建议另外,没有已知的DMF引起的保护机制。200年,在BCNU的浓度更高μ米,盛行一种抗增殖效果(图3 (d))。
3.5。药物抑制谷胱甘肽还原酶抑制DMF的积极影响在Cystine-Free谷胱甘肽循环介质
我们从这些实验得出的结论,我们只能研究BCNU的抑制作用在DMF-mediated谷胱甘肽循环条件下(1)新创谷胱甘肽合成受到抑制,(2)BCNU的孵化时间是不足以让基因转录的感应。因此我们进行预处理细胞10μM DMF增加谷胱甘肽浓度正常培养基和cystine-free中如图1 (b)正如之前报道(21]。BCNU的存在为4 h cystine-free介质,然而,完全废除了谷胱甘肽循环由DMF(图4)。这些实验证明的一部分积极的DMF对谷胱甘肽含量的影响确实是通过增加谷胱甘肽介导的回收。
4所示。结论
我们的主要发现是,DMF确实增加谷胱甘肽循环GSR的感应。我们的研究是受这一事实击倒和抑制GSR诱导一个强大的抗氧化剂反应本身。研究GSR抑制对谷胱甘肽的影响仅回收,孵化cystine-free介质可以用来阻止新创谷胱甘肽的合成,避免混淆GSR抑制的影响。
缩写
| BSO: | Buthionine sulfoximine |
| 施: | 细胞浓度测定蓝 |
| DMF: | 富马酸二甲酯 |
| DMSO溶液: | 二甲亚砜 |
| GCLC: | Glutamate-cysteine连接酶,催化亚基 |
| 谷胱甘肽: | 谷胱甘肽 |
| 女士: | 多发性硬化症 |
| NF -κB: | 核因子k B |
| Nrf2: | 红色的两个相关因素2 |
| NQO1: | NADPH-quinone-oxidoreductase-1 |
| S4-CPG: | 4-carboxyphenylglycine(年代)。 |
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
菲利普·阿尔布雷特和阿克塞尔Methner构思研究并参与其设计和协调,进行统计分析,写的手稿。克里斯蒂娜·霍夫曼、Ann-Kathrin赫尔曼和特蕾莎沙赫特细胞可行性分析,进行免疫印迹,迈克尔•迪特里希谷胱甘肽的测量和定量实时PCR实验。所有作者批判修订和批准最后的手稿。菲利普·阿尔布雷特和Axel Methner同样特约作者。
确认
这个工作是由一个无限制的研究资助生原体Axel Methner。