文摘
氧化还原平衡发展的慢性肾病的发病机理中起着重要的作用。以前,我们表明,微rna - 382 (mir - 382)导致了TGF -β1-induced失去上皮细胞极性在人类肾脏上皮细胞,但其作用的发展阻力指标纤维化也许可以肾仍然未知。在这项研究中,我们发现,7天的单侧输尿管梗阻(UUO)在老鼠中,大量的mir - 382在梗阻性肾显著增加。与此同时,蛋白表达热休克蛋白60 (HSPD1), mir - 382的预测目标,经过7天的UUO减少。表达3-nitrotyrosine (3 nt)是调节,但硫氧还蛋白的表达(硫氧还蛋白)表达下调。反mir - 382治疗抑制upregulation mir - 382,减毒梗阻性肾肾间质纤维化,HSPD1 /硫氧还蛋白和差别,扭转了对这些upregulation UUO后3 nt。此外,在体外研究显示,过度HSPD1显著恢复TGF -硫氧还蛋白表达和逆转β1-induced钙粘蛋白的损失,而体内的研究发现,直接siRNA-mediated抑制HSPD1 UUO肾脏促进氧化应激尽管mir - 382封锁。我们的临床数据表明,upregulation miR-382/3-NT HSPD1 /硫氧还蛋白的差别,对这些也观察到IgA肾病患者肾间质纤维化。这些数据支持一种新的机制,mir - 382目标HSPD1和导致的氧化还原平衡肾纤维化的发展。
1。介绍
阻力指标纤维化(TIF)是一个著名的也许可以肾病理特征的慢性肾脏疾病(CKD)和途径导致终末期肾病。它涉及细胞外基质蛋白的过量积累在肾间质和与炎性细胞浸润,肾小管细胞的损失,和纤维母细胞积累(1- - - - - -4]。在我们之前的研究中,我们发现,微rna - 382 (mir - 382)导致了TGF -β1-induced失去上皮特征在培养人类肾脏上皮细胞(HK2) (5]。蛋白质组学和生物信息学分析表明热休克蛋白60 (HSPD60 HSPD1)是一个目标基因mir - 382 (5]。HSPD1是一个关键的蛋白质,维持线粒体的完整性和细胞的活动,从而帮助保护细胞不受氧化应激的线粒体蛋白质折叠和抑制细胞凋亡6- - - - - -9]。自增强氧化应激和氧化还原平衡已经被证明与肾脏功能障碍(10,11),mir - 382或HSPD1可能作为先进治疗CKD的新目标。因此,本研究的目的主要是验证mir - 382和HSPD1之间的互补关系,以及进一步探讨mir - 382的角色发展的阻力指标纤维化。也许可以肾
2。材料和方法
2.1。细胞培养和药物治疗
人类肾脏上皮(HK2)细胞获得写明ATCC(马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。DMEM (Gibco) Opti-MEM我(Gibco),或者使用其他细胞培养媒体根据制造商的建议。HK2细胞约40% confluency对待人类TGF -重组β1 (3 ng / ml)(研发系统)或车辆控制在DMEM表示时间。pre - mir - 382或反mir - 382来自Ambion寡核苷酸。HK2细胞转染的寡核苷酸(100海里)使用Oligofectamine(表达载体)。
2.2。鼠标UUO模型
实验动物:ICR小鼠(6 - 8周,23日g,男)从上海SLRC购买实验动物有限公司(上海,中国)。动物被安置在温度和湿度的笼子里,免费获取水和啮齿动物的食物在12 h光/暗周期。复旦大学实验完成,所有协议都是批准的机构复旦大学动物保健和使用委员会,以及坚持严格的美国国立卫生研究院指导护理和使用实验动物。老鼠成为重症或垂死的实验期间,根据执行安乐死安乐死的动物机构签发的动物保健和使用委员会复旦大学。
所有手术都表现在腹腔内戊巴比妥钠麻醉(80毫克/公斤),intrarectal老鼠温度维持在36.5°C (37.0°C和加热垫在手术期间,和努力都是痛苦和使用的老鼠数量降到最低。老鼠接受单侧输尿管梗阻(UUO)或左输尿管的虚假的操作。妨碍是由左输尿管结扎后中线剖腹手术。左侧输尿管是孤立的,但不结扎,sham-operated控制。UUO手术后,老鼠都被转移到复苏的笼子,一个笼子里。参数如生命体征和时间从麻醉中醒来都是被监控的。食物摄入量是每天监测和动物体重每隔一天一次。锁核酸-(放大器)修改反mir - 382寡核苷酸antiscrambled (Exiqon)在生理盐水稀释(5毫克/毫升)和静脉注射通过尾静脉(10毫克/公斤)30分钟内UUO之前,和剂量重复手术后24小时。体内的小核RNA)对HSPD1或小干扰RNA(10负控制而设计的μg, GenePharma)是由逆行注入输尿管近端结扎,紧跟着的输尿管阻塞。老鼠被颈椎脱位牺牲左输尿管梗阻后7天。肾脏收集评估mir - 382的丰度,HSPD1,硫氧还蛋白(硫氧还蛋白),3-nitrotyrosine (3 nt), VCAM-1, CD3。肾纤维化的程度分级根据马森三色的染色和天狼星红染色。
2.3。病人选择和肾脏形态学分析
我们研究了12个主要IgA肾病患者在2014年至2015年之间,和所有诊断经肾活检在中山医院,复旦大学。6个病人阻力指标纤维化也许可以没有,6例阻力指标纤维化也许可以中度到重度的展出。分析肾纤维化与2执行μ马森米染色石蜡包埋部分由三色的和天狼星红染色。肾纤维化的程度得分由一位有经验的病理学家。阻力指标纤维化,也许可以为10微观领域被认为的放大×400和每个病人主观得分从0到100%。阻力指标纤维化是也许可以的程度分级在0到4:0级没有疫区(正常);1级影响面积不到10%;二年级有一个部位10 - 25%;三年级有一个疫区的25 - 75%;4级有一个受影响的面积大于75%12]。每个幻灯片的指数表示的意思是所有的分数。同样的方法应用于小鼠肾病理分析。这项研究是中山医院临床研究伦理委员会批准,复旦大学。所有的病人提供书面知情同意。临床资料包括血压、血清肌酐和24小时尿蛋白测试记录的时候肾活检。
2.4。RNA隔离
总RNA提取使用试剂盒(英杰公司)从细胞或组织部分如前所述5,13]。组织总RNA从formalin-fixed和石蜡包埋(FFPE)被RecoverALL总核酸提取的隔离设备(美国Ambion,奥斯汀,德克萨斯)根据制造商的协议。
2.5。TaqMan实时聚合酶链反应
mir - 382的表达水平量化通过实时一TaqMan化学(应用生物系统公司)如前所述5,13]。HSPD1的mRNA水平,αsma,钙粘蛋白、波形蛋白、硫氧还蛋白和GAPDH是量化使用SYBR绿色如前所述[5,13]。在这些分析总RNA样本采用。5 s rRNA GAPDH信使rna被用作microrna的标准化控制蛋白质编码基因,分别。信使rna的相对变化和miR-21表达测定使用2−ΔΔCt方法。相关基因水平表达为比例来控制。引物的序列表中列出1。
2.6。免疫印迹和免疫组织化学
分析了几种蛋白质的相对丰度使用免疫印迹和免疫组织化学(包含IHC)如前所述5,13]。主要抗体HSPD1 (1: 100;恩佐生命科学),钙粘蛋白(1:100;Abcam)、波形蛋白(1:100;Abcam),αsma (1: 75;Sigma-Aldrich)、3 nt (1: 100;Abcam)、硫氧还蛋白(1:100;Abcam)、VCAM-1 (1: 10; 0 Abcam), CD3 (1: 50;Abcam)和伯灵顿(1:100;细胞信号传导技术)应用根据制造商的指示。二次抗体(1:1000;杰克逊ImmunoResearch)也应用根据制造商的指示。胶原蛋白免疫组织化学染色和染色分析为以下步骤:在显微镜下(400 x),我们将每片20 - 25片随机和拍照,然后由图像分析Pro-Plus 6.0软件(美国媒体控制论)量化我们的靶蛋白/基因的丰度。参数IOD(集成光密度)来做这项工作。 To prove our assumption with a second method, we also quantified tyrosine-nitrosylated proteins by fluorescence immunoblotting of 3-NT (Abcam; 1 : 100). Secondary antibodies were species-specific FITC-conjugated IgG (1 : 500, Invitrogen).
2.7。3′未翻译区(UTR)记者分析
3′utr记者结构生成,和记者活动分析与少量修改(如前所述5,13]。短暂,海拉细胞(80 - 90% confluency) cotransfected以下:3′utr记者构造(100 ng /),一个pRL-TK内部控制质粒(50毫微克),和控制pre - mir - 382寡核苷酸(10 pmol /好,从Ambion)。细胞被cotransfected使用Lipofectamine 2000(表达载体),制造商的协议。萤火虫和Renilla测定荧光素酶的活动在每个转染后24小时使用Dual-Luciferase记者分析系统(Promega),遵循制造商的协议。Renilla荧光素酶活性作为标准化控制荧光素酶活性测定转染效率和细胞密度。
执行定点诱变与QuickChange II XL定点诱变工具包(Stratagene)后,制造商的协议。引物用于引入点突变HSPD1如下:底漆,5 - CAAGGCAGTGTTCCTCACCAATA遗传算法TTCAGAGAAGACAGTTG 3;反向引物,5 - CAACTGTCTTCTCTGAAtcTATTGGTGAGGAACACTGCCTTG 3。强调核苷酸代表介绍的突变,这些核苷酸位于核心区域的预测目标站点mir - 382。
2.8。mir - 382原位杂交
发现mir - 382的表达通过原位杂交(ISH),协议后Exiqon提出的“一天microRNA伊什”。实验条件的IgA肾病患者肾组织如下:FFPE肾组织切成2μ米厚的部分,清除在二甲苯中,患者使用乙醇梯度,然后暴露于10分钟蛋白酶K(15毫克/毫升)治疗37°C。调查被稀释在杂交缓冲(60 nM, 60μl /组织切片在90°C)和预热4分钟线性化。调查被添加到幻灯片和孵化90分钟54°C。羊antidigoxigenin碱性磷酸酶(anti-DIG-AP)抗体稀释(1:1000)和添加到幻灯片,在室温下孵化60分钟。幻灯片中孵化硝基蓝四唑/磷酸5-bromo-4-chloro-3-indolyl(电视台/ BCIP;罗氏公司)稀释重蒸馏的H2O在32°C,然后安装和组织和中性树脂。
2.9。质粒转染
从KeyGentec HSPD1人类cDNA ORF克隆了。克隆表达HSPD1由CMV启动子和c端Myc-DDK标记。克隆是放大和纯化如前所述5]。与HSPD1 HK2细胞转染质粒或空向量使用Lipofectamine 2000 2的工作浓度μ为每一个35毫米盘g。
2.10。测量细胞ROS水平
CM-H2DCFCA ROS-sensitive荧光染料,用于测量ROS水平,如前所述[14]。HK-2细胞孵化96 -孔板。5毫米CM-H2DCFCA被添加到每个。荧光强度是使用微型板块荧光测量的读者。
2.11。统计分析
数据被表示为平均数±标准差。差异三个或更多组评估使用单向方差分析与Bonferroni调整(方差分析)。SPSS软件(版本19.0)是用于统计分析。的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。mir - 382阻力指标纤维化也许可以导致肾功能的恶化在UUO老鼠
Tubulointerstitial纤维化发达经过7天的UUO阻塞肾脏(图1(一)),mir - 382的表达高于UUO组(UUO与控制,4.32±0.45和1.00±0.13,分别地。)。锁核酸-(放大器)修改反mir - 382(10毫克/公斤)是由尾静脉注射UUO前30分钟,剂量是重复手术后24小时。反mir - 382组,mir - 382的表达显著抑制10毫克/公斤lna -反- mir - 382治疗相比antiscrambled(10毫克/公斤anti - 382与antiscrambled, 1.95±0.33和3.98±0.54,分别地。)(图1(一))。肾组织学分析表明,阻止mir - 382的表达可以减弱肾间质纤维化(数字1(一),1 (c),1 (d))和免疫组织化学染色显示的upregulationαsma和波形蛋白部分逆转阻塞肾脏10毫克/公斤后反mir - 382治疗(数字1 (e)和1 (f))。此外,anti-miR382治疗也减毒肾损伤少增加血清肌酐(图1 (f))和阻止炎症细胞浸润阻塞肾脏(图2)。
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3.2。识别HSPD1 mir - 382的新目标
根据我们先前公布的数据,我们发现mir - 382的目标集群oxidative-related基因包括HSPD1 [5]。在这项研究中,我们发现,使转染HK2 pre - mir - 382细胞显著抑制蛋白表达HSPD1 (pre - 382与pre-NC, 0.60±0.04和1.00±0.04,分别地。)(图3(一个))。反mir - 382低聚糖治疗抑制upregulation mir - 382和逆转HSPD1表达式的减少引起的TGF -β1培养HK2细胞(图3 (b))。3′utr段HSPD1克隆到的基因与荧光素酶报告基因表达载体。Cotransfection pre - mir - 382的海拉细胞显著减少了荧光素酶活性。的预测结合位点突变引入mir - 382在3′utr HSPD1防止抑制HSPD1的pre - mir - 382(图3 (c))。
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3.3。超表达mir - 382降低肾组织的抗氧化能力表达下调HSPD1
mir - 382之间的反向关系表达式和肾脏的表达HSPD1也存在于阻塞肾脏UUO小鼠以及慢性肾脏疾病患者。有较低的蛋白表达HSPD1 7天后UUO阻塞小鼠肾脏(UUO与正常,0.14±0.04和1.00±0.11,分别地。)。反mir - 382治疗剂量为10毫克/公斤抑制UUO HSPD1的差别,对这些基因的老鼠(图4)。IgA肾病患者在临床设置,(IgAN)被确定,并根据是否诊断病例选择最小或实质性的肾间质纤维化。患者在IgAN TIF, mir - 382丰度显著调节相比,在IgAN气管无名动脉瘘管的患者没有(5.59±0.79和1.00±0.23,,图5 (c))。比较蛋白质丰富的钙粘蛋白是抑制(TIF与气管无名动脉瘘管的没有,0.33±0.18和1.00±0.47,分别地。),而这两个α气管无名动脉瘘管的sma (TIF还是没有,4.29±1.72和1.00±0.20,分别地。)和波形蛋白(TIF与气管无名动脉瘘管的没有,4.60±1.82和1.00±0.26,分别地。气管无名动脉瘘管的)是增强组(图6)。还存在一个逆HSPD1和mir - 382丰度之间的关系。蛋白质丰度(TIF与气管无名动脉瘘管的没有,0.12±0.04和1.00±0.18,分别地。)HSPD1气管无名动脉瘘管的患者显著降低(图5 (d))。
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免疫组织化学染色分析表明,硫氧还蛋白的比较蛋白表达(硫氧还蛋白),标记的抗氧化能力,减少阻塞肾脏(图7)。相比之下,3-nitrotyrosine的蛋白表达(3 nt),氧化应激的标记,是调节(图7)。放大器-反- mir - 382治疗(10毫克/公斤)的硫氧还蛋白和差别显著逆转对这些抑制小鼠3 nt的表达受到UUO(10毫克/公斤反- 382组与anti-NC组,Trx: 0.43±0.13和0.20±0.06,;3 nt: 2.11±0.27和4.52±0.16,)。类似的硫氧还蛋白和3 nt表达式也IgAN患者的肾活检组织中发现(TIF与气管无名动脉瘘管的没有,Trx: 0.35±0.09和1.00±0.15,;3 nt: 1.00±0.24和6.43±0.69,)(图6)。
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3.4。超表达HSPD1恢复肾抗氧化能力和变弱的TGF -β1-Induced体外细胞极性的损失
细胞活性氧引起的生产TGF -βTGF - 1β1 + HSPD1质粒组明显低于TGF -β1 +车质粒组(相对荧光单位,89.67±14.15和179.55±16.32,)(图8(一个))。HK2细胞非常耐TGF -β1接触HSPD1质粒转染的预处理,由于类似的信使rna和蛋白质水平的钙粘蛋白保持相比对照组(数字8 (b)和8 (c))。ELISA测定细胞匀浆显示TGF -β硫氧还蛋白的差别1-induced对这些被HSPD1转染(TGF -完全恢复β1 + HSPD1质粒组与TGF -β1 +汽车集团,122.99±9.08 pg / ml和78.43±1.21 pg / ml,分别地。;TGF -β1 + HSPD1质粒组与对照组,122.99±9.08 pg / ml和103.24±2.58 pg / ml,分别地。),而3 nt的蛋白表达HK2细胞,生物标志物的氧化应激和细胞抗氧化防御不足,后减毒HSPD1质粒转染(TGF -β1 + HSPD1质粒组与TGF -β1 +车质粒组,13.57±0.24 ng / ml和18.28±0.66 ng / ml,分别地。;TGF -β1 + HSPD1质粒组与对照组,13.57±0.24 ng / ml和13.08±0.23 ng / ml,分别地。)(数据8 (e)和8 (f))。上述结果表明,过度的HSPD1可能保护肾上皮细胞免受氧化应激细胞极性的损失。
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3.5。肾HSPD1介导的保护作用阻力指标纤维化也许可以对肾mir - 382封锁
在我们的体内动物实验中,小鼠接受UUO治疗与反mir - 382或antiscrambled控制。结扎肾治疗局部HSPD1 siRNA或控制核逆行注入。通过测量大量的实时PCR, mir - 382年反mir - 382治疗被认为是有效的(67.86% mir - 382的水平,减少-70.99%的价格相比antiscrambled集团)(图9(一个))。控制核组相比,蛋白质的表达HSPD1 HSPD1 siRNA组显著抑制,而蛋白质丰富的伯灵顿,proapoptosis标记,HSPD1 siRNA治疗后显著调节(数字9 (b),9 (c),9 (d))。纤维化量化来自天狼星红点的组织表示,反- mir - 382治疗小鼠肾击倒的HSPD1并不受阻力指标纤维化(数据也许可以发展9 (f)和9 (g))。硫氧还蛋白或差别与此同时,对这些基因的伯灵顿中学的upregulation UUO反mir - 382治疗后部分逆转但不与反逆转mir - 382治疗结合HSPD1 siRNA(数字9 (b),9 (c),9 (e))。3 nt的二级差别荧光免疫印迹试验表明,对这些反mir - 382治疗被HSPD1核(数字9 (f)和9 (h))。
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4所示。讨论
阻力指标纤维化也许可以肾是一种常见的病理表现的各种慢性肾脏疾病(CKD),不管最初的触发或受伤的网站。Tubulointerstitial纤维化(TIF)也是最后共同通路,使先进的慢性肾病终末期肾病。气管无名动脉瘘管的已经证明的程度是肾功能下降的预测在动物模型和人类15,16]。气管无名动脉瘘管的因此,阻止甚至逆转的过程可能会阻止慢性肾病进展的一种方式。
气管无名动脉瘘管的的组织病理学资料通常被认为是细胞外基质过度沉积由myofibroblasts在肾间质炎性细胞浸润,肾小管萎缩,毛细血管损失(17,18]。epithelial-mesenchymal过渡的机理(EMT)是众所周知的,受伤的肾小管细胞转变成间充质细胞在肾纤维发生(19- - - - - -22]。从我们先前的研究结果基础上,EMT参与体内慢性肾病的发病机制进展,在一定条件下,它是可逆的,即使增加疑虑EMT体内的存在(23]。在这项研究中,失去上皮钙粘蛋白和细胞外基质增加标记(标记αsma和波形蛋白)观察UUO阻塞肾脏的老鼠和IgAN气管无名动脉瘘管的患者。
小分子核糖核酸(microrna)很小,内生表示时,非编码RNA分子(21 - 25日核苷酸)成立于植物,动物,和一些病毒。microrna在posttranslation级别调节基因的表达通过翻译抑制或mRNA退化,呈现一个microrna的相互关系及其目标基因在大多数情况下(24- - - - - -26]。在我们之前的研究中,大量的在HK2 mir - 382细胞是调节EMT的发展引起的TGF -β1。反mir - 382寡核苷酸治疗显著逆转TGF -β1-induced抑制钙粘蛋白表达和增强αsma表达(5]。在鼠标UUO模型中,我们发现气管无名动脉瘘管的的发展是伴随着大量增加mir - 382在阻塞肾脏。静脉注射的放大器-反- mir - 382寡核苷酸(10毫克/公斤)显著缓解阻塞肾脏的病理损伤,抑制蛋白质的表达波形蛋白和αsma。最近,徐等人报道mir - 382作为骨肉瘤转移和EMT的抑制剂,这是矛盾的,我们的结果从肾组织27]。由于只有一个子集的目标基因的microrna的表达组织,组织有限的功能角色mir - 382可以预期。因此,mir - 382的作用可能是不同的在不同亚型的EMT (22]。
microrna实现他们的生物效应,主要通过抑制翻译或减少大量的目标mrna (28,29日]。Kriegel AJ,我们研究小组的一员,已经证明Kalliken5 (KLK5),一个(chymo) trypsin-like蛋白酶介导多种细胞外基质蛋白质的退化,mir - 382的目标在鼠标UUO模型。她的研究显示,upregulation mir - 382导致内部在小鼠骨髓间质纤维化,部分由针对KLK5 [30.]。除了ECM基因,集群的线粒体蛋白质包括HSPD1被确认为mir - 382的新预测目标基因,表明mir - 382的贡献在气管无名动脉瘘管的发展可以由不同机制的途径(5]。
60 kDa HSPD1,也称为热休克蛋白1,作为重要的线粒体蛋白质分子伴侣。HSPD1据报道,维持线粒体的完整性和防止氧化应激(8- - - - - -10]。体外实验显示的mRNA表达HSPD1明显抑制由HK2 pre - mir - 382细胞,而反mir - 382治疗显著逆转HSPD1 mRNA的减少。我们还发现,反mir - 382治疗就可以,在某种程度上,诱导HSPD1 TGF -独立表达β1。mir - 382可以作为可能的下游TGF -β1或并行TGF -β1。除此之外,在HK2 mir - 382细胞的内源性丰富应该考虑。同样,HSPD1表达式是阻塞气管无名动脉瘘管的调节和肾脏后缓解lna -反- mir - 382(10毫克/公斤)治疗。mir - 382之间的交互和HSPD1也观察临床研究。原位杂交、免疫组织化学染色以及q-PCR测量发现mir - 382之间的相互关系和HSPD1 IgAN气管无名动脉瘘管的患者。因此,HSPD1作为mir - 382的目标基因之一,这进一步验证了定点诱变。自从HSPD1参与氧化应激(8,9),我们选择硫氧还蛋白标记的抗氧化能力(31日- - - - - -33)和3 nt作为氧化应激的标记(34- - - - - -36]。Downregulation HSPD1伴随着硫氧还蛋白减少,3 nt的增加,在UUO老鼠和IgAN气管无名动脉瘘管的患者。抑制mir - 382的表达与反mir - 382导致硫氧还蛋白的表达增加,以及减少表达UUO 3 nt的老鼠。我们还表明,过度HSPD1预防TGFβ1-induced上皮体外特性和氧化应激的损失。此外,体内的肾保护作用研究发现mir - 382封锁对纤维化,细胞凋亡,并阻塞肾脏的氧化还原平衡被肾HSPD1击倒,这进一步证明了我们的假设,mir - 382可能通过氧化应激导致肾间质纤维化细胞凋亡抑制HSPD1二级。
这些结果的差别表明,对这些HSPD1可能导致保护肾组织中抗氧化能力下降。气管无名动脉瘘管的过度氧化应激导致的发展,因此,抑制肾组织的抗氧化能力可能的重要机制之一,mir - 382促进肾小管间质纤维化。
5。结论
在这项研究中,我们探索mir - 382的作用在肾纤维化的发展及其可能机制。我们证明了mir - 382目标HSPD1阻力指标纤维化也许可以参与肾的设置。肾组织的抗氧化能力下降HSPD1表达下调的时候,这表明过度氧化应激可能是一个重要的机制,mir - 382参与肾纤维化。目前的研究表明,upregulation mir - 382,目标基因和HSPD1抗氧化压力,可能部分阻力指标纤维化也许可以导致肾的发展。需要更多的工作来检查,mir - 382是一个潜在的治疗候选人阻力指标纤维化也许可以预防或治疗肾与他人相结合。
的利益冲突
没有利益冲突,金融或否则,由作者声明。
作者的贡献
易方和Ting谢了同样的工作。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(81200557)和上海市科学技术委员会(14 dz2260200,上海的项目重点实验室的肾脏和血液净化)。
补充材料
补充图1:表达的α-SMA阻塞小鼠肾脏。(一)免疫组织化学分析肾脏标本α-SMA丰富的老鼠。治疗10毫克/公斤反mir - 382抑制α-SMA在阻塞肾脏的表达而不是20毫克/公斤的剂量。(B)相对mRNA表达α-SMA阻塞小鼠肾脏。(C)量化α-SMA染色。值用(*)标记与虚假的集团相比,P < 0.05。值标示(#)与10毫克/公斤反- 382组,P < 0.05。“UUO”表明单侧输尿管梗阻。“数控”表示消极的控制。(n = 4)。 Supplemental Figure 2: Expression of Vimentin in obstructed murine kidneys. (A) Immunohistochemical analysis for Vimentin abundance in kidney specimens from mice. Treatment with 10mg/kg dosage of anti-miR-382 suppressed the expression of Vimentin in UUO mice, but not with the dosage of 20mg/kg. (B) Relative mRNA expression of Vimentin. (C) Quantification of Vimentin staining. Values labeled with (*) are compared with the sham group, P<0.05. Values labeled with (#) are compared with 10 mg/kg anti-382 group, P<0.05. “UUO” indicates unilateral ureteral obstruction. “NC” indicates negative control. (n=4)