文摘

我们之前的研究表明,蛋白酶体抑制剂MG132可以防止糖尿病肾病(DN)连同upregulation核因子(erythroid-derived 2)——2 (Nrf2)。本研究探讨MG132能否防止DN在野生型和Nrf2-KO老鼠。1型糖尿病在野生型和Nrf2-KO诱导小鼠由多个低剂量链脲霉素。两周后注射链脲霉素,野生型和Nrf2-KO小鼠随机分为四组:控制、MG132, DM, DM / MG132。MG132 (10μ克/公斤/天)或车辆管理腹腔内4个月。肾功能、形态学和生物化学变化与MG132测量受测者治疗后。MG132治疗抑制蛋白酶体活性的两个基因型。在野生型小鼠,MG132减毒diabetes-induced肾脏功能障碍,纤维化炎症和氧化损伤以及增加Nrf2和我κB的表达。删除Nrf2基因导致了部分,但显著衰减MG132肾保护Nrf2-KO小鼠与野生型小鼠相比。MG132-increased我κB表达野生型之间没有不同,Nrf2-KO老鼠。这项工作表明,MG132抑制diabetes-increased蛋白酶体活性,导致Nrf2和我κB upregulation和肾保护,可以作为一个策略来防止糖尿病肾病。

1。介绍

糖尿病肾病(DN)是全球终末期肾功能衰竭的主要原因。此外,DN也与心血管疾病的风险很高。风险因素包括高血糖、血脂异常、高血压以及海拔高半胱氨酸,和先进的糖化终端产品(1]。此外,蛋白尿和肾小球滤过率也建议有相关预后影响心血管发病率和死亡率,和蛋白尿的影响尤为明显,肾小球滤过率是正常或接近正常(2]。终末期肾功能衰竭和心血管疾病给我们带来了沉重的社会负担。目前治疗DN主要包括降血糖药和cotreatment renoprotective药物并不能有效地阻止DN的进展。因此,它是至关重要的和紧迫性找到更有效的治疗策略在对抗糖尿病危害肾损伤。

氧化应激诱导的活性氧生成的失衡和内源性抗氧化活性。活性氧引发炎症信号通路进而诱发氧化应激(3]。人们普遍认为氧化应激和炎症都是主要原因DN (4,5]。因此,抑制氧化应激和炎症可能是一种有效的治疗策略的DN。

的cell-permeable MG132是可逆的,强有力的蛋白酶体抑制剂。据报道,MG132抑制核转录因子(erythroid-derived 2)——2 (Nrf2)和IkB蛋白酶体降解,导致抗氧化应激和抗炎作用。Nrf2是一个转录因子。通过绑定到antioxidant-responsive元素(),Nrf2可能上调抗氧化基因的表达和cytoprotective第二阶段解毒酶。我们之前的研究表明,无毒浓度MG132可以抑制Nrf2蛋白酶体降解,导致对diabetes-induced MG132肾的肾保护功能障碍(6]。此外,据报道,MG132抑制IkB蛋白酶体降解在心肌7]。在生理条件下,IkB结合NF -κB和保留NF -κ防止NF - B在细胞质中κB从激活许多炎症基因的转录。MG132上调IkB,导致转录失活的NF -κB和心脏保护(7]。因此,MG132可能有可能通过抗氧化应激和炎症治疗DN。

在目前的研究中,我们试图解决的问题是否蛋白酶体抑制剂MG132可以防止糖尿病肾病小鼠模型在野生型和Nrf2-KO由多个小剂量链脲霉素诱导。同时,我们想知道是否renoprotection MG132完全Nrf2-dependent。

2。材料和方法

2.1。动物

野生型(Nrf2^{+ / +})、纯合子(Nrf2^−−/)和杂合子(Nrf2^{+ / -})与C57BL / 6 j小鼠背景从杰克逊实验室购买(缅因州巴尔港)。Nrf2基因敲除(KO, Nrf2^−−/)雄性老鼠繁殖得到的杂合子(Nrf2^{+ /−})和纯合子(Nrf2^−−/)。只有野生型和年龄Nrf2 KO雄性小鼠被用于本研究。所有这些老鼠实验程序批准的机构动物保健和使用委员会路易斯维尔大学的,这是符合美国国立卫生研究院的标准。

感应的1型糖尿病小鼠模型,8-week-old男性野生型和Nrf2-KO老鼠注射多种低剂量链脲霉素(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)腹腔内,溶解在0.1 M柠檬酸钠缓冲(pH = 4.5)在50毫克/公斤体重每日连续5天,虽然年龄控制老鼠注射了多个相同的柠檬酸钠缓冲。五天过去注射后,小鼠高血糖(血糖水平≥250 mg / dL)被定义为糖尿病(DM)之前(8]。野生型和Nrf2-KO小鼠被随机分配成四组(至少每组):控制、MG132 DM, DM / MG132。使用剂量的MG132基于我们之前的研究(6]。MG132 (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)溶解在二甲亚砜浓度的0.0025μ克/毫升,用注射用生理盐水稀释。非糖尿病患者和糖尿病小鼠进一步接受皮下注射的MG132 10μ克/公斤或车辆每日4个月。最后4个月,小鼠安乐死,他们的肾脏收获进行分析。

2.2。老鼠尿白蛋白肌酐比率(UACR)检测

尿白蛋白、尿肌酐测定按照制造商的程序提供这些工具(Bethyl实验室Inc .,蒙哥马利,TX;生物测定系统,海沃德,CA,职责)。计算鼠标UACR UACR =尿白蛋白/尿肌酐(μg /毫克)。

2.3。肾组织病理学检查

肾组织缓冲福尔马林溶液固定立即10%收获后,嵌入在石蜡和分为5μ米厚的部分到玻片上。被加工的部分不是和马森的三色的染色。

2.4。隔离的核

细胞核从肾脏组织根据制造商的分离过程提供细胞核隔离设备(Sigma-Aldrich)。肾组织从每个老鼠是均质在寒冷的裂解缓冲含有二硫苏糖醇(DTT)和特里同x - 100。然后,库欣的解决方案(蔗糖垫解决方案:蔗糖垫缓冲:二硫苏糖醇= 900:100:1)增加,混合物被转移到一个新管与蔗糖预加载缓冲溶液在13000转离心45分钟紧随其后。浮在表面的分数包含吸气和细胞核可见胞质组件作为一个细颗粒底部的管。

2.5。实时聚合酶链反应

实时PCR进行如前所述[9)使用引物NQO-1, Nrf2和肌动蛋白(生活技术,大岛,纽约)。

2.6。免疫印迹分析

进行免疫印迹试验(如前所述)(10]。主要的抗体FN(1: 200稀释),TGF -β(1:1000稀释),3 nt(1: 1000稀释),4-HNE(1: 1000稀释),il - 6(1: 500稀释),NF -κB(1: 1000稀释),我κB -α(1:1000稀释),Nrf2(1: 500稀释),肌动蛋白(1:3000稀释)α微管蛋白(1:2000稀释),所有这些都从圣克鲁斯生物技术除了购买3 nt(微孔),4-HNE(α诊断),和TGF -βNF -κB,我κB -α,α微管蛋白(细胞信号)。

2.7。20 s蛋白酶体活性测定

20年代蛋白酶体,26 s蛋白酶体复杂的催化核心,负责短期调控蛋白的降解,包括Nrf2和我κB (7,11,12]。因为MG132主要抑制蛋白酶体胰凝乳蛋白酶(十)——活动(13),我们发现20 s蛋白酶体活性量化SLLVY-AMC的水解,ChT-like fluorogenic衬底的活动,根据制造商的20 s蛋白酶体活动的程序分析工具(微孔)。详细的操作程序描述了在我们的早期研究[6]。

2.8。的形态学分析

的形态学进行了分析使用Image-Pro + 6.0软件(美国媒体控制论,马里兰州贝塞斯达)。地区拍照被人们忽视的身份选择的随机样本。

2.9。统计分析

数据收集从每组至少7小鼠和±SD作为手段。图像定量5.2被用于分析西方墨点法。比较不同组之间由单向方差分析,其次是图基的事后考验。此外,一个以及进行比较的数量减少MG132 Nrf2-KO与野生型老鼠。差异显著,如果。

3所示。结果

3.1。一般改变注射STZ后连续5天

连续5天注射STZ后,糖尿病小鼠高血糖。没有意义UACR四组(表和体重1)。

3.2。MG132保留部分保护Diabetes-Induced蛋白尿尽管Nrf2基因的删除

作为肾功能的重要指标,UACR测量的研究。如数据所示1(一)和1 (e)各自控制相比,增长了4.95倍的UACR Nrf2-KO糖尿病小鼠和增加3.38倍UACR为野生型糖尿病老鼠被发现。结果显示,streptozotocin-injected Nrf2-KO老鼠有一个更高层次的UACR比野生型小鼠,指示的重要作用Nrf2防止体外肾损伤。接下来,肾脏重量/胫骨长度(数字1 (b)和1 (e)),这表明肾脏增大,计算。比例明显增加糖尿病组在这两个菌株,但减少了MG132治疗。MG132 UACR下降和肾脏重量/胫骨长度55.1%和29.0%在糖尿病小鼠和野生型27.9%和20.6% Nrf2-KO小鼠,分别;这些影响在Nrf2-KO显著降低小鼠(图1 (e))。它不仅证实Nrf2 MG132保护的关键作用,但也证明了一个Nrf2-independent保护diabetes-induced肾损伤。血糖(图1 (c))在糖尿病大鼠在野生型和Nrf2-KO含量增加,对血糖和MG132没有重大影响的两个基因型。糖尿病减少体重在野生型和Nrf2-KO糖尿病小鼠(图1 (d))。有趣的是,在野生型小鼠糖尿病MG132增加体重,但不是在Nrf2-KO糖尿病老鼠。

3.3。MG132保留部分保护Diabetes-Induced肾纤维化尽管Nrf2基因的删除

调查的影响MG132 diabetes-induced肾纤维化,PAS染色(图2(一个))进行了检测糖原沉积和马森的三色的染色进行测量纤连蛋白的表达(FN)和胶原蛋白(图2 (b))。糖尿病肾脏显示放大肾小球系膜基质,扩张,并增加trichrome-positive区域。MG132显著减弱这些变化在野生型小鼠和仍然提供部分保护diabetes-induced Nrf2-KO老鼠形态学变化。系膜基质扩张(图2 (c))从PAS染色和纤维化积累(图量化2 (d))从马森量化的三色的染色。

FN和TGF -β两个纤维化指标,来衡量西方墨点法测定总蛋白。两种蛋白在糖尿病肾脏显著增加的两个基因型,然而他们减少了MG132治疗。MG132 FN(数字下降3(b)和3(c))和TGF -β(数据3(一)和3(c))在糖尿病小鼠和野生型51.2%和48.9% 29.6%和20.0%在Nrf2-KO小鼠,分别;这些影响是显著降低Nrf2-KO老鼠。

3.4。MG132 Diabetes-Induced减轻氧化应激在野生型糖尿病老鼠,但这种影响是完全迷失在Nrf2-KO糖尿病老鼠

如图4,diabetes-induced氧化损伤是由3 nt nitrosative损伤指数和4-HNE索引的脂质过氧化作用在总蛋白质免疫印迹分析。3 nt(数据4(一)和4 (c))和4-HNE(数字4 (b)和4 (c))在糖尿病肾脏增加两个基因型,在Nrf2-KO老鼠更明显。MG132治疗显著降低3 nt和4-HNE积累在野生型糖尿病老鼠,但不是在Nrf2-KO糖尿病老鼠。

3.5。MG132保留部分保护Diabetes-Induced肾脏炎症尽管Nrf2基因的删除

肾脏炎症的一个重要指标,il - 6是由西方墨点法测定总蛋白,而NF -κB是由西方墨点法测定核蛋白质。如图5野生型和Nrf2-KO老鼠,糖尿病增加il - 6的表达(数字5(一个)和5 (c))和NF -κB(数据5 (b)和5 (c))与对照组相比,分别。更重要的是,Nrf2-KO糖尿病肾脏表达高水平的il - 6和NF -κB,而野生型糖尿病肾脏。MG132降低il - 6和NF -κB在糖尿病小鼠和野生型48.2%和52.9% 22.9%和24.0%在Nrf2-KO小鼠,分别;这些影响是显著降低Nrf2-KO老鼠。

3.6。可能的机制MG132变弱DN

糖尿病肾蛋白酶体活动增加,减少了MG132。如图6(一),与各自对照组相比,糖尿病组肾蛋白酶体活性增加的两个基因型和被MG132治疗显著降低。

3.7。MG132抑制肾蛋白酶体活性,导致Upregulation Nrf2

泛素化和后续的蛋白酶降解被认为是主要负责Nrf2的负调控机制。MG132抑制蛋白酶体活性,这可能导致减少Nrf2退化。因此,Nrf2 mRNA(图6 (b))和总蛋白质含量(图6 (c))是由实时聚合酶链反应和免疫印迹分析,分别。此外,NQO-1表达式,下游Nrf2基因之一,也是由实时PCR(图6 (d))。在野生型小鼠,糖尿病增加Nrf2 mRNA和蛋白表达水平;MG132治疗增加Nrf2蛋白质水平,但不是mRNA水平。Nrf2-KO老鼠,Nrf2几乎检测不到实时聚合酶链反应和免疫印迹分析。符合Nrf2蛋白质水平,在野生型小鼠,糖尿病和MG132 NQO-1 mRNA水平增加。然而,Nrf2不足使不能MG132诱导NQO-1转录。

3.8。MG132抑制肾蛋白酶体活性,导致Upregulation的我κB的差别,对这些基因的NF -κB

作为转录因子,NF -κB可以把到细胞核转录上调炎症细胞因子。我κB是其负面调节器。在基础条件下,我κNF - B结合κB和保留NF -κB在细胞质中,减少了NF -转录活动κb为了确定MG132对我的影响κB,我们通过免疫印迹检测蛋白水平测定总蛋白。如图6 (e)野生型和Nrf2-KO老鼠、糖尿病显著降低我的表情κB,由MG132显著调节治疗。这表明MG132抑制肾蛋白酶体活性,导致我的减少κB降解。因此,MG132增加了我κB(图6 (e))和NF -减少κB(图5 (b))。

4所示。讨论

本研究首次证明了MG132变弱DN通过蛋白酶体活性的抑制糖尿病肾脏,促进退化Nrf2和我κ我们建立糖尿病小鼠模型与多个低剂量链脲霉素在野生型和Nrf2-KO老鼠和对待MG132 4个月。在野生型小鼠,MG132抑制蛋白酶体活性,导致的重大upregulation Nrf2和我κb .因此,MG132显著减毒diabetes-induced肾脏功能障碍,纤维化炎症和氧化损伤。在Nrf2-KO老鼠,MG132也抑制蛋白酶体活性,导致我的重要upregulationκb .然而,Nrf2不足导致的部分损失MG132保护DN。

DN的特征是炎症,氧化应激,扩大肾小球,系膜扩张矩阵,肾小球基底膜增厚、肾小球硬化症,阻力指标纤维化。也许可以和炎症和氧化应激反应被认为是DN的主要发病机制。越来越多的证据表明,阻断氧化应激可以减弱糖尿病并发症,如DN (14),糖尿病性视网膜病变(15),和糖尿病心肌病(16]。作为转录因子,Nrf2主调节器的细胞氧化还原状态。在没有压力的情况下,由Kelch-like-ECH-associated Nrf2保存在细胞质蛋白1 (Keap1)和Cullin 3导致Nrf2的泛素化17]。一旦ubiquitinated Nrf2,它被运送到蛋白酶体,退化及其组件被回收。在氧化条件下,氧化应激破坏临界Keap1的半胱氨酸残基,扰乱Keap1-Cul3泛素化系统。从Keap1 Nrf2是免费,把从细胞质到细胞核。在细胞核,它结合一个小加蛋白质和结合在上游启动子区域基因编码抗氧化酶和启动他们的转录18]。证据表明,upregulation Nrf2可以减轻氧化损伤和糖尿病并发症19,20.]。Nrf2被蛋白酶体降解[21- - - - - -24];因此,蛋白酶体抑制上调Nrf2可能是一种有效的方法。自从被FDA批准的第一个蛋白酶抑制剂(25),蛋白酶体抑制剂已经被用来治疗一些疾病。由于副作用和耐药性,一个新的蛋白酶体抑制剂没有这些缺点,即MG132,被发现。据报道,无毒浓度MG132 Nrf2蛋白酶体降解减少,导致upregulation Nrf2及其下游的抗氧化剂(26,27]。我们之前的研究表明,MG132防止DN的发展通过upregulation Nrf2 OVE26老鼠。此外,消声Nrf2基因与核使不能MG132防止肾小管细胞high-glucose-induced profibrotic响应。它表明治疗效果的MG132 DN可能Nrf2-dependent。本研究还表示Nrf2 MG132保护的重要作用DN。蛋白酶体抑制剂MG132,调节Nrf2基因及其下游的抗氧化剂,如NQO-1,导致肾脏氧化损伤减轻。在野生型糖尿病老鼠,MG132 UACR减少了55.1%。然而,MG132 Nrf2-KO糖尿病小鼠UACR减少了29.0%,证明减轻氧化应激状态的有益作用MG132疫苗提供肾保护作用。有趣的是,MG132保留部分保护diabetes-induced Nrf2-KO小鼠肾损伤。也就是说,MG132可能不是Nrf2-dependent的肾保护。 There may be another mechanism underlying the protective effect of MG132 on DN. This inconsistence may be due to the discrepancy between in vivo and in vitro study. On one hand, exposure of renal tubule cells to high-glucose cannot fully mimic diabetes-induced renal injury. On the other hand, kidney is composed of several different kinds of cells, such as mesangial cells, tubular epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, and podocytes, not just tubule cells.

几项研究显示,糖尿病在静脉内皮细胞蛋白酶体活动增加,心脏,肌肉(腓肠肌28- - - - - -32]。目前的研究也证明糖尿病肾蛋白酶体活动增加,减少我陪着κNF - B和增加κb . MG132治疗显著地抑制蛋白酶体活性,upregulation的陪着我κB的差别,对这些基因的NF -κb .人们普遍认为炎症导致的发病和进展DN。NF -κB是一种蛋白质复杂控制许多基因参与了炎症。一些研究表明,MG132抑制炎性细胞因子的表达(33,34),但其机制尚不完全清楚。在生理条件下,NF -κB是隐藏在细胞质的抑制剂,叫我κB (35- - - - - -37]。当激活信号,我κB是磷酸化和ubiquitinated,然后引导他们被蛋白酶体降解[38,39]。我的退化κB, NF -κB复杂被释放进入细胞核,它促进特定基因编码促炎细胞因子的表达。在目前的研究中,MG132、蛋白酶体抑制剂,增加了我κNF - B和减少κb。因此,它是合理的假设MG132抑制蛋白酶体活性,导致我的减少κB降解。因此,NF -κB是保留在细胞质中,从而避免了NF -κB激活。最后,MG132抑制肾脏炎症。的可能机制MG132改善DN如图7。

目前的研究表明,MG132 TGF -下降β糖尿病大鼠表达。人们普遍认为氧化应激和炎症导致TGF -β激活和纤维化。此外,在当前的研究中,我们假设MG132抑制这两种氧化应激通过Nrf2 upregulation通过NF -和炎症κ(图差别B对这些7)。因此,MG132介导的氧化应激和炎症抑制可能解释的现象TGF -β减少。在最近的一项研究中,黄等人建议MG132减轻DN通过抑制TGF -β信号,这种效应与MG132减少平的降解蛋白质的能力(40]。这可能是另一种机制,通过这种机制MG132 TGF -下降β。

总之,本研究首次表明,蛋白酶体抑制剂MG132低剂量改善DN Nrf2诱导和抑制NF -κ我通过upregulationκb .正如我们之前报道的(6)的用量MG132在当前研究中(10μ克/公斤/天)的最低剂量体内的文献报道。因为蛋白酶体活动增加糖尿病肾脏,是否增加MG132剂量(无毒)可以增强其有效性需要进一步研究DN模式。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Wenpeng崔和衬里苗族的构思和设计实验;丽丽,Yangwei Wang和罗Manyu进行实验;易晒黑分析数据;莉莉写了论文。

确认

这项工作是由中国自然科学基金会(不支持。81200525),吉林省科技发展计划资助项目(没有。20150520034 jh也没有。20160414014 gh),吉林省科学研究项目资助项目(没有。2016446),吉林大学白求恩项目(没有。2015214)。作者想表达自己的感激医生参与这项研究。